Unser Protokoll ist wichtig, weil es Forschern ermöglicht, den molekularen Mechanismus der koronaren Angiogenese außerhalb eines Organismus zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie den Prozess der koronaren Angiogenese in einem Organismus genau modelliert und die Untersuchung der Mechanismen der koronaren Angiogenese erleichtert. Beginnen Sie damit, eine schwangere Maus zu sprühen, die embryonale 11,5 Embryonen mit 70% Ethanol trägt.
Heben Sie die Haut über den Bauch mit Zange, verwenden Sie eine Schere, um eine Bauchhaut und Peritonealschnitt seitlich und vor dem Zwerchfell zu machen, um das Gebärmutterhorn auszusetzen. Greifen Sie die Gebärmutter, schneiden Sie das Gewebe frei und ziehen Sie das Gebärmutterhorn. Legen Sie die Reihe der Embryonen in eiskalte sterile PBS unter einem Stereomikroskop, und schälen Sie den Gebärmuttermuskel, Dengelbsack und amnion Abdeckung von jedem Embryo.
Wenn jeder Embryo isoliert ist, verwenden Sie einen perforierten Löffel, um das Gewebe in eine neue Petrischale mit sterilem PBS auf Eis zu übertragen. Um das embryonale Herzgewebe zu ernten, übertragen Sie den ersten Embryo, der in eine neue Petrischale unter dem Mikroskop seziert wird, und legen Sie den Embryo in die ventrale Seite. Verwenden Sie feine Zangen, um einen kleinen Schnitt in der Brust zu machen, etwas über dem Zwerchfell, und setzen Sie die geschlossenen Zangen in den Schnitt, um den Schnitt zu vergrößern.
Verwenden Sie die Zange, um die Brustwand offen zu halten, um das Herz und die Lunge freizulegen, verwenden Sie ein zweites Paar Zangen, um das Herz sanft um 90 Grad zu bewegen, um die dorsale Aorta und Vene freizulegen. Dann, diese Gefäße an der Basis des Herzens greifen, ziehen Sie vorsichtig das Herz und die Lunge vor und spülen Sie das Gewebe mit kalten PBS. Wenn das gesamte Herzgewebe geerntet ist, stellen Sie die Herzproben unter das Mikroskop und entfernen Sie die Lungenlappen aus jedem Herz.
Richten Sie das erste Herz auf seiner rückenden Seite, und halten Sie das Herz an seiner Basis, verwenden Sie feine Zange, um die linke und rechte Vorhöfe im angrenzenden Gewebe um den SV aus dem Herzen zu kratzen. Um den SV zu isolieren, richten Sie die Herz-Rückenseite nach oben. Entfernen Sie den SV vorsichtig aus dem Herzen und verwenden Sie eine sterile Transferpipette, um das isolierte Gewebe in eine neue sechs Zentimeter lange Petrischale mit eiskaltsterilem PBS auf Eis zu legen.
Um die gesamten Ventrikel zu isolieren, entfernen Sie den Abflusstrakt und verwenden Sie eine neue sterile Transferpipette, um die Ventrikel in eine separate sechs Zentimeter lange Petrischale zu legen, die eiskalte sterile PBS auf Eis enthält. Um SV und ganze Ventrikelkulturen einzurichten, beschichten Sie zunächst die Membranen eines acht Mikrometer Poren PET-Kultureinsatzes pro Brunnen einer 24-Well-Kulturplatte, mit 100 Mikroliter frisch verdünnter extrazellulärer Matrix pro Kultur für mindestens 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Wenn die Matrix verfestigt ist, verwenden Sie eine Transferpipette, um eine Explantation auf jeden Einsatz zu übertragen, und bewegen Sie die Platte unter dem Mikroskop.
Positionieren Sie die Explants mit sauberen Zangen in der Mitte jedes Inserts, um sicherzustellen, dass sie nicht an den Seitenwänden befestigt sind, und entfernen Sie sorgfältig alle zusätzlichen PBS. Als nächstes übertragen Sie die Platte mit dem Deckel geschlossen unter einer laminaren StrömungSgewebe-Kulturhaube, und fügen Sie 100 Mikroliter vorgewärmtkomplettes Medium zu jedem Einsatz, und 200 Mikroliter auf den Brunnen unter jedem Einsatz. Dann fügen Sie 300 Mikroliter PBS zu allen ungenutzten Brunnen hinzu und legen Sie die Platte für fünf Tage in den Zellkultur-Inkubator.
Für DIE VEGF-A-Behandlung am zweiten Tag der Kultur, entfernen Sie das Medium aus beiden Kammern jeder Kultur und fügen Sie 100 Mikroliter PBS zu jedem Einsatz und 200 Mikroliter PBS zu jedem Brunnen hinzu. Nachdem Sie die Platte ein paar Mal gewirbelt haben, ersetzen Sie die PBS durch 300 Mikroliter Basalmedium, ergänzt durch 1%fetales Rinderserum, um die Kulturen zu starten, und geben Sie die Platte an den Inkubator zurück. Am dritten Tag nach dem Hungertod 300 Mikroliter frisches Basalmedium plus Serum in die Kontrollbrunnen und Basalmedium plus 50 Nanogramm pro Milliliter VEGF-A in die Behandlungsbrunnen geben und die Platte an den Zellkultur-Inkubator zurückgeben.
Waschen Sie am sechsten Kulturtag die Kammern wie gezeigt mit PBS und fixieren Sie die Kulturen mit 200 Mikrolitern 4%Paraformaldehyd in jedem Brunnen und 100 Mikroliter Fixativ in jedem Einsatz. Nach 20 Minuten bei 4 Grad Celsius mit Schaukeln die Kulturen mit 300 Mikroliter PBS für 10 Minuten pro Wäsche mit Schaukeln bei Raumtemperatur waschen. Nach der letzten Wäsche 300 Mikroliter Primärantikörperlösung in die Brunnen geben und für eine Nachtkultur bei vier Grad Celsius mit Schaukeln einsetzen.
Am nächsten Morgen die Kulturen zehnmal in nicht-ionischem Tensid in PBS mit Schaukeln waschen und die Waschlösung alle 10 Minuten wechseln, bevor die Kulturen mit 300 Mikrolitern eines geeigneten Fluorophorkonjugatierten Sekundärantikörpers bei vier Grad Celsius über Nacht mit Schaukeln gekennzeichnet werden. Am nächsten Tag die Kulturen 10 Mal in frischem PBS mit nichtionischen Tensid waschen, wie gezeigt. Nach dem letzten Waschen verwenden Sie feine Zangen, um die Membran sorgfältig von jedem Einsatz zu schälen und die Membranen auf einzelne Glasmikroskop-Dias zu legen, seitenach oben zu explantieren.
Bedecken Sie die Proben mit DAPI ergänzten Montagemedium in einem Deckelschlupf, und versiegeln Sie die Kanten der Abdeckung Supleinen mit klarem Nagellack. Wenn der Nagellack getrocknet ist, stellen Sie die Dias durch konfokale Mikroskopie ab. Da die ersten SV-Zellen auf den Herzventrikel wachsen, stellen sie die Produktion von venösen Markern wie Coup-TF2 ein.
Nach fünf Tagen Kultur sprießen SV-Endothelzellen und wandern auf die Membran. Wie im embryonalen Herzen wird die Coup-TF2-Expression reduziert, wenn die Gefäße vom SV wegwandern. Kulturen, die mit VEGF-A stimuliert werden, zeigen ein erhöhtes Wachstum angiogener Sprossen sowohl in der Dichte als auch in der Länge. Weitere SV-Kulturen, die durch VEGF-A stimuliert werden, zeigen eine fast dreifache Erhöhung der Sprossenlänge im Vergleich zu Kontrollen, was darauf hindeutet, dass Endothelsprossen von SV und Endokard auf VEGF-A reagieren.
Es ist wichtig, das SV-Gewebe nicht zu verlieren, während das Herz und die Lunge herausgezogen, die Vorhöfe entfernt und das angrenzende Gewebe rund um den SV gereinigt wird. Live-Bildgebungsexperimente können durchgeführt werden, um die koronare Angiogenese zu visualisieren und die Details der zellulären und molekularen Dynamik während des Prozesses zu erfassen. Diese Technik ist äußerst nützlich für die Bewertung potenzieller molekularer Mechanismen der koronaren Angiogenese und als Modellsystem zur Untersuchung der Angiogenese im Allgemeinen.
