Wir danken Hyewon Cooper für Illustrationen.

1. Präparation Schabe in diesem Protokoll verwendeten Kochsalzlösung hat die folgende Zusammensetzung: Cockroach Kochsalzlösung 36: (Gramm für 100 ml) 210 mM NaCl (1.227 g) 2,9 mM KCl (0,0216 g) 1,8 mM CaCl 2 (0,0265 g) 0,2 mM NaH 2 PO 4 • 2H 2 O (0,0032 g) 1,8 mM Na 2 HPO 4 • 7H 2 O (0,0483 g) (PH 7,2. Der pH-Wert mit 1 M NaOH oder 1 M HCl). <ol><li> Wählen Sie einen männlichen Kakerlake aus dem Vorratsbehälter, die robust Cerci (Abbildung 1). Die letzten Segmente des Mannes sind schmal im Vergleich zu den weiblichen, und die keine Eierstöcke und Eiermasse, sind Männer leichter zu sezieren. Die Männchen von P. americana ein Paar kurze Taster zwischen der Cerci. Diese Taster sind in den Weibchen beobachtet. </li><li> Schneiden Sie die Flügel, Beine und Kopf und stecken den Körper, Bauchseite bis zu einer dish mit Silikon-Elastomer ausgekleidet. </li><li> Mit Zange holen die Bauchplatten und schneiden Sie sie mit einer feinen Schere, beginnend am hinteren Ende und nach vorne arbeiten. Die inneren Organe immer feucht zu halten mit Kochsalzlösung beim Versuch, die Cerci trocken zu halten. Man kann Wachs oder Stücke von Gummi verwenden, um den Bauch nach oben zu positionieren, um die Kochsalzlösung benetzt die Cerci zu verhindern. Wenn sie nass wird, trocknen Sie sie mit einem Stück Seidenpapier. Drücken Sie auf die Seite, die inneren Organe und die weiße Substanz (Fett-Körper). Der VNC ist in der Mitte des Feldes, läuft über die Länge des Bauches und sollte zwischen der glänzenden Tracheen sichtbar sein. Der Nervenstrang ist durchscheinend und kann anfangs schwierig sein, zu sehen, bis die Beleuchtung richtig (Abbildung 2) angepasst. NICHT behandeln die VNC mit einer Pinzette oder Insektenstifte; Verwendung von Glassonden statt manipulieren. </li><li> Räumen Sie Tracheen-System der Tiere so gut wie möglich aus der Nervenstrang mit einer Zange und mit einem Paar von feinen Glas Notwendigkeitles, sehr sorgfältig spalten die VNC-Verknüpfungen in Längsrichtung zwischen A6 und A5 und A4-oder A5-Ganglien (Abbildung 3). Cradle die Cerci und Bauch nach oben aus dem Solebad mit verkürzten Insektenstifte und Wachs oder ein Keil des Silikon-Elastomers, die schneiden kann, um die Vorbereitung (4A und B) zu passen. Seien Sie in der letzten Bauchsegment nicht auf die Nerven, die cercal in die Ganglien projizieren beschädigen besonders vorsichtig (Figuren 2D und 5). </li></ol> 2. Extrazelluläre Aufnahme <ol><li> Die Vorbereitung seziert, Mikroskop, und Aufzeichnungsgerät sollte in einem Setup-Faraday-Käfig sein, externe, insbesondere AC, elektrische Felder, die Signale von Nervenzellen außer Kraft setzen konnte (Abbildung 6) zu blockieren. </li><li> Positionieren Sie das Mikroskop, so dass es mit Blick auf den Mikroskoptisch. Sobald das Präparat auf der Bühne platziert, passen Sie die Position der Beleuchtungsstrahl hoher Intensitätfür die beste Visualisierung von ihm. </li><li> Verbinden Sie den AC / DC-Differenzverstärker mit der integrierten Datenaufzeichnungseinheit (Details auf den spezifischen Hardware-und Software-Einstellungen wurden bereits beschrieben 25). Der Kopf der Bühne hält eine Saug-Elektrode sollte an den Verstärker angeschlossen werden. Eine silberne Erdungskabel, die mit Cl beschichtet worden ist - in den Bauch führt zu stabileren Aufnahmen eingefügt. Der Grund ist, wenn die Lösung in die Körperhöhle nicht in Kontakt mit der Badeflüssigkeit in der Schüssel, der mit der Aufzeichnungselektrode geerdet bleibt zugehörigen Fluid. </li><li> Stellen Sie die Aufnahmefrequenz auf 4 kHz. Stellen Sie die Spannungsskala (y-Achse) bis 500 mV (dieser kann eingestellt werden, um die Visualisierung der Messkurve zu optimieren). Führen Sie das Aufnahme-Software in kontinuierlicher oder Oszilloskop-Modus, um neuronale Aktivität in Reaktion auf Reize aufzuzeichnen. </li><li> Schneiden Sie eine der VNC-Verknüpfungen in der Nähe von A5 und legen Sie das Schnittende bis A6 in eine Saug-Elektrode angebracht. Achten Sie darauf, pull Salzlösung in die Saug-Elektrode, um die Silberdraht im Inneren vor dem Ansaugen in der Nerven abzudecken. </li><li> Mit einer Pipette trocken blasen Luft an die Haare auf jeden cercus entfernt. Sehen Sie, wenn die Stimulierung der Haare auf dem cercus ipsilateral zu der aufgezeichneten Verbindungs ​​gibt eine andere Antwort als die kontralateralen ein. Nehmen die Amplituden der Reaktionen und der Anzahl der Spitzen in einem gegebenen Zeitintervall, während der Stimulation. </li><li> Bewegen Sie die Saug-Elektrode mit einem cercal Nerven für die Aufnahme. Um eine bessere Passform, wechseln Sie zu einer Elektrodenspitze mit einer kleineren Öffnung bei Bedarf zu bekommen. </li><li> Schneiden Sie die cercal Nerven Nähe von A6 und saugen dann die Nerven, die zum cercus. Es sollte spontane Abfeuern von Aktionspotentialen sein. Nun blasen Luft auf die cercus und beachten Sie die Antworten. </li></ol> 3. Elektrische Stimulation der sensorischen Nerven zu ermitteln Recruitment <ol><li> Ändern Sie den Aufnahme-Software zu fegen Modus, so dass es Aufzeichnungen Spuren (100-500 msec.) jedes Mal, wenn ein Reiz ausgelöst wird. </li><li> Verbinden der Stimulationselektrode mit dem Ausgang des Stimulators. </li><li> Verbinden Sie den Stimulator Kabel mit den beiden Mini-Haken Leitungen oder Clips. </li><li> Die BNC-Trigger-Ausgang von dem Stimulator mit dem Triggereingang der Aufzeichnungseinheit. </li><li> 10 ms, Frequenz::;: Dauer: Verzögerung 0,3 s Die folgenden Stimulationsparameter sollten eine Reaktion hervorrufen 1 Hz, Spannung: nach Bedarf anpassen, um ein Signal in den Aufnahmen zu erhalten (knapp über Schwelle und in der Lage, eine maximale Antwort zu erhalten). Es gibt keinen Grund zu Spannungen viel höher als maximale Schwellenwert für die Einstellung gehen, wie eine hohe Spannung beschädigt werden, um den Nerv. </li><li> Schneiden Sie die cercal Nerven als distale wie möglich, so dass eine lange Nervenwurzel kann in der stimulierenden Elektrode Sog gezogen (Abbildung 7, Pfeilspitze) werden. Die Binde zwischen A6 und A5 oder ein anderes Segment weiter vorn verwendet werden. </li><li> Stellen Sie den Aufnahme Saug-Elektrode, so können Sie puwerde ein Schnitt Binde in die Elektrode. Seien Sie sicher, etwas Kochsalzlösung in den Saug-Elektroden ziehen, um den Silberdraht im Inneren vor dem Ansaugen in den Nerven zu decken. Sicherzustellen, dass die Stimulationselektrode ist ebenfalls in dem Bad Salz geerdet (in der Bauchhöhle in der Nähe von A3 ist ideal). </li><li> Liefern Sie eine Reihe von Einzelreize, aus zunehmender Spannung, bis ein Aktionspotential auf dem Bildschirm erscheint. Man sollte eine Aufzeichnung der minimalen Stimulationsspannung und Dauer machen, um eine Antwort zu rekrutieren. Erhöhen Sie die Intensität, bis eine Reaktion in den synaptischen Verknüpfungen beobachtet. Die große Spitze (extrazelluläre APs) von den riesigen Axone erscheint zuerst, und dann andere kleinere AP kann auch beobachtet werden. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte.

Einer der Gründe für die ausstellenden Techniken für diese klassische Zubereitung ist, dass die Cerci System war und ist ein aktives Forschungsgebiet in ein auf Fragen der Entwicklung der neuronalen Schaltkreise sowie Fragen zur synaptischen Reparatur und Regeneration 26-31. Beide Verfahren hervorzurufen Aktivität in der Schabe Bauchmark verwendet werden, um die Auswirkungen der pharmakologischen Mitteln oder Insektiziden auf Funktion des Nervensystems zu untersuchen. Diese Experimente werden durch einfaches Lösen neuroaktiven Chemikalien in Kochsalzlösung getan. Nach dem Austausch dieser Lösung mit dem normalen Bademedium kann Veränderungen in evozierten oder spontane Aktivität während der Aufnahme von Verknüpfungen oder einer motorischen Nerven, um eine konsistente Auslesen der Wirkung der Chemikalie auf ZNS-Funktion geben, beobachtet werden. Wie in allen neurophysiologischen Experimente ein häufiges Problem ist elektrisches Rauschen. Wahrscheinlich der größte Faktor bei der Signalqualität für diesen Vorbereitungen is die Saug-Elektrode Siegel auf dem Nervengewebe. Die Dichtheit, die nicht vollständig in der cercal Nerven-oder Bindegewebe ziehen, ist ideal. Die Aufnahmen können auch mit Doppelhaken Elektroden unter der Nervenstrang und Isolierung des VNC mit einer Mischung aus Mineralöl und Petrolatum platziert werden. Die Mischung kann in eine Spritze geladen und um die Nervenkabel 32 ausgewiesen werden. Auch eine sorgfältige Präparation ist so kritisch hier wie in CNS Vorbereitung. Manche finden es einfacher, das ZNS durch Zerlegung der dorsalen Kutikula zugreifen. Während dies reduziert die Möglichkeit der Beschädigung der Bauchmark kann es sich als schwierig, alle Eingeweide mit diesem Ansatz zu entfernen. Es wird hier nicht beschrieben, aber diese Vorbereitung ist zugänglich für die intrazelluläre Aufnahme in den riesigen Inter 32,33. Das gesamte Nervenstrang kann auch entfernt werden, um mehrere Aufnahme-und Stimulationselektroden gleichzeitig aufnehmen. In der Tat Erforschung des Antennallobus, Pilz-body, und anderen ZNS-Frontstrukturen ist noch im Gange 34-35. Während die Kakerlake CNS weiterhin Licht auf modernen neurobiologischen Forschung werfen diese besondere Zubereitung ist einfach genug, um in grundständigen akademischen Laboratorien verwendet werden.

Es gibt mehr als 4.000 Schabenarten, aber nur etwa 30 sind bekannte Schädlinge. Vielleicht die bekannteste ist die falsch benannte Amerikanische Schabe Periplaneta americana, die in Afrika entstanden und wird heute fast überall auf dem Planeten gefunden. Neben seiner schnellen Laufgeschwindigkeit ein und Ausweichverhalten, in den Tropen P. americana ist in der Lage Flug 2,3. Die vorherrschenden Merkmale der Schabe Zentralnervensystem (ZNS) sind die segmentierten Natur und Dezentralisierung von Steuerungsprozessen 4,5. Das Gehirn-, Brust-und Bauchganglien werden von gepaart interganglionic Verknüpfungen miteinander verbunden, um die Bauchmark (VNC) zu bilden. Die Ganglien bei jedem Segment integrieren Mitte. Sie bestehen aus einem äußeren, kortikalen Bereich enthaltenden Zellen für die Blut-Hirn-Schranke Lässigkeit unmittelbar unterhalb verantwortlich, und die Zellkörper der Neuronen ursprüng zusammenUrsprung in diesem Ganglion. Diese Somata kann Inter, modulatorischen Neuronen oder Motoneuronen gehören. Sie liefern Axone, die in der Ganglienherkunfts (lokale Interneuron) bleiben oder Axone, die zwischen den Ganglien des ZNS (interganglionic Inter) oder dass an peripheren Muskelzellen (Motoneurone) beenden zu projizieren. Die meisten Zellkörper ventral oder ventrolateral in der Ganglien Kortex 5 positioniert. Die gepaarten, interganglionic Verknüpfungen enthalten nur Axonen und keine neuronalen Zellkörpern. Das Neuropil eines Ganglien enthält Gliazellen (Neuroglia), Axon Wege, Bündel von Axonen und Dendriten (Neuriten) von Neuronen. Neuropil frei von neuronalen Zellkörpern. Dies ist der Bereich innerhalb des Ganglion wo direkte synaptische Kommunikation zwischen Nervenzellen und Integration von Eingängen auf. Die Fähigkeit der amerikanischen Schabe P. americana zu erkennen und zu reagieren, plötzlich zu einem Raubtier nähert (Fuß-, Han-d, etc.) hat zu einer Reflexschaltung, der Cerci und Riesenfasersystem besteht aus 6,7 zugeschrieben worden. Die Cerci sind ein Paar von hornartigen Windempfindlichen Strukturen am Ende der Bauchhöhle (Abbildung 1). P. americana die ventrale Oberfläche jedes cercus enthält etwa 200 fadenförmige (Thread) Haare, die in 14 Spalten organisiert sind. Neun dieser Spalten konsistent in verschiedenen Tieren nach den Antworteigenschaften des zugehörigen Empfängerzelle und Axon identifiziert werden. Jedes Haar ist in einer Fassung, die sie am leichtesten in einer Ebene, die Spalte spezifisch verbiegen können. Bewegung der Haare in einer Richtung entlang ihrer Ebene induziert eine Depolarisation der Rezeptorzelle und eine Burst-Aktionspotentiale (APs) in sensorischen Neuronen. Bewegung in die entgegengesetzte Richtung hemmt keine laufenden spontanen APs 8. Die bevorzugte Ablenkungsebene und Direktionalität der Reaktion unterscheidet sich in jeder Spalte. Somit ist die filiform Haar-Rezeptor-Komplexe sind nicht nur für das Erfassen der Bewegung der Luft, sondern auch für &quot;Codieren&quot;, in Form von APs, die Richtung, aus der der Luftstrom stammt. Die Verarbeitung dieser Informationen durch das ZNS führt zu einer &quot;angemessen&quot; Fluchtreaktion 6,7. Diese funktionelle, säulen Spezifität der Sinneshärchen wird von Tier zu Tier erhalten. Die Rezeptorzelle jedes fadenförmigen Haar ist zur Umwandlung der mechanischen Auslenkung der Haare in ein neuronales Ereignis (was zu einem Burst oder Hemmung von APs in Axon 9 der Rezeptorzelle verantwortlich. Die APs zu reisen, um das Terminal Abdominalganglion (A6) über cercal Nerven XI, wo sie mit riesigen Axone des Bauchmark (VNC) Synapsen. Die riesigen Axone sind vermutlich für die Übertragung und nachfolgende Anregung von Motoneuronen, die in einem Fluchtverhalten 6,10,11 Ergebnisse verantwortlich zu sein. Die Verhaltens Latenz of die Fluchtreaktion von P. americana ist eine der kürzesten aller Tier 7. Verhaltens-Latenzzeit ist die Zeit zwischen der Ankunft eines Reizes zu einem Mechanorezeptor und die Einleitung einer Fluchtreaktion. In Versuchen mit hoher Geschwindigkeit, um die Filmfluchtversuch von einem angreifenden Kröte aufzunehmen, wurde die Kakerlake beobachtet, um seine Abkehr von der Kröte in der etwa 40 ms (Zeit von Beginn der Zunge Erweiterung beginnen, Bewegung 7,12 Kakerlake. Mit gesteuert Wind Windbeutel könnte die Verhaltens Latenz bis 11 ms reduziert werden. Weitere Experimente zeigten, dass eine Mindestwindgeschwindigkeit von Blätterteig 12 mm / ms (bei ​​einer Beschleunigung von 600 mm / ms 2) einen Fluchtantwort hervorzurufen, während noch niedrigere Geschwindigkeiten (3 mm / sec) verursacht langsam zu Fuß bewegen Schaben 12 zu stoppen. Die starke Korrelation, die in der Regel besteht zwischen Riesenfasersysteme und Fluchtverhalten ist gut dokumentiert 13,14. In instances wo eine bestimmte Zelle notwendig und ausreichend ist, um ein bestimmtes Verhalten hervorzurufen ist, wird die Zelle als Befehls Neuron 15,16 bezeichnet. Rieseninter (GIS) in der Wind Flucht Schaltung von P. americana sind nicht notwendig für den Reflex. Tiere, die experimentell abgetragen GIs haben zeigen immer noch die Fluchtverhalten daher sind diese GIs werden nicht als Befehl Neuronen 17,18. Abtrennen zervikalen Verknüpfungen, die rostral sensomotorischen Schaltung wird auch das Verhalten, das anzeigt, dass absteigend Eingabe vom Gehirn hat eine Wirkung auf die Fluchtrichtung 19. Diese Aspekte der Feinsteuerung und Redundanz sind entscheidend, um das Überleben des Organismus und werden durch neurochemische Modulation über biogene Amine 20 ergänzt. Die P. americana Nervenstrang Vorbereitung hat in den letzten vielen Jahrzehnten, beginnend mit der Pionierarbeit von Roeder &lt;war eine elegante Modellsystem für Neuroethologensup&gt; 21. Es ermöglicht Studierenden, ihre Ein 22,23,24 aufzeichnen, anzeigen und analysieren primären sensorischen Aktivität und die daraus resultierenden Reaktionen von riesigen Inter. Neben der Vermittlung der Idee, dass identifizierbare neuronalen Schaltkreise zugrunde liegen Verhaltensreaktionen auf die Umwelt sollten diese Übungen eine Wertschätzung für die biologischen Beiträge dieses gemeinsamen Haushalt Schädling gemacht zu vermitteln.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>182 silicone kit</td>
			<td>182 silicone elastomer kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#8226;2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>221465</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td>To adjust pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material Name</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting tools</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>assortment</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Pins</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc</td>
			<td>26001-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>PZMIII-BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass electrodes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS7095B5X</td>
			<td>Box of 200, suction electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MD4-M3-R</td>
			<td>Can fix for base or on a metal rod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire (10/1,000 inch)</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>782500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC/DC differential amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>Model 3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLab 26T</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>27T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head stage</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Comes with AC/DC amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabChart7</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical leads</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tools</td>
			<td>make yourself</td>
			<td></td>
			<td>For manipulating nerves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cable and connectors</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes with bulbs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7</td>
			<td>Box of 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beakers</td>
			<td>any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wax or modeling clay</td>
			<td>any company or local stores</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Grass Instruments</td>
			<td>SD9 or S88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tip for suction electrode</td>
			<td>local hardware store (Watt&#39;s brand)</td>
			<td>&#188; inch OD x 0.170 inch ID</td>
			<td>Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neural circuit recording from an intact cockroach nervous system

Die Schabe Bauchmark Zubereitung ist ein gefügig System für neuroethology Versuche, neuronale Netzwerkmodellierung und Testen die physiologischen Wirkungen von Insektiziden. Dieser Artikel beschreibt den Umfang der Schabe sensorischen Modalitäten, die verwendet werden können, um zu untersuchen, wie eine Insektennervensystem reagiert auf Umweltstörungen. Der Schwerpunkt liegt hier auf dem Fluchtverhalten von Cerci zu riesigen Faserübertragungs in Periplaneta americana vermittelt. Diese in situ-Herstellung erfordert nur mäßige Seziersaal Geschick und elektrophysiologische Know-how, um reproduzierbare Aufnahmen der neuronalen Aktivität zu erzeugen. Peptide oder andere chemische Reagenzien kann dann direkt mit dem Nervensystem in Lösung mit physiologischer Kochsalzlösung angewendet werden. Insektizide könnte auch vor der Dissektion verabreicht werden und die Flucht Schaltung kann als Proxy für den erregbaren Zustand des Zentralnervensystems dienen. In diesem Zusammenhang sind die hierin beschriebenen Tests würden auch nützlich sein, um Researchers interessiert Regeneration von Gliedmaßen und der Evolution der Entwicklung des Nervensystems, für die P. americana ist ein etablierter Modellorganismus.

Die Stimulation der Haare auf der Cerci von einem Luftstoß verursacht Einleitungen von primären sensorischen Neuronen, die mit extrazellulären Saug-Elektroden entweder Verknüpfungen zwischen Bauchganglien oder der cercal Nerven selbst (Abbildung 8) befestigt aufgezeichnet werden können. Spike-Amplituden von den beiden Bereichen aufgezeichnet sind, in der Größenordnung von einigen Mikrovolt an Millivolt. Aufgrund der sensorischen Integration in die Ganglien die Anzahl der in der Verbindung Aktionspotential oder von der cercal Nerven aufgenommenen Einzel Spikes beobachteten Spitzen ist bemerkenswert größer als in Aufnahmen aus den Verknüpfungen beobachtet. Aber auch beachten, dass es wesentlich weniger Rauschen in der Aufnahme an der Binde durch die dichtere Abdichtung zwischen der Elektrode und dem Nervengewebe. Durch schnaufend Luft an den Cerci große Spitzen in den Verknüpfungen (8A) beobachtet werden. Mit dieser Methode anregend, Aufnahmen zwischen A3 und A4 typischen<html> ly zeigen eine große Spitze Merkmal der Riesenintern (n). Aufnehmen von einem cercal Nerven während körperlich Reiben der Cerci mit einer Pinzette erzeugt eine starke Büste der Aktivität (8B 1). In einer anderen Aufnahme, 2 Luftstöße jedes produzierte eine schnelle Zerschlagung Antwort in der cercal Nerven (8B 2). Wenn die elektrische Stimulation der Nerven cercal mit einem Saug-Elektrode und die Aufnahme in die Binde zwischen A3 und A4, kann man eine Schwelle an der Stimulation zu beobachten, um Reaktionen hervorgerufen (8C 1). Die elektrische Stimulation des Nerven cercal klar löst eine Reaktion in Verknüpfungen, die für manipulative Studien mit pharmakologischen Wirkstoffen oder den lokalen Umwelt umgibt, wie Temperatur quantifiziert werden kann (Fig. 8C 2). <html> fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Periplaneta americana mit intakten Cerci. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig2.jpg" /> Abbildung 2. Ventrale Ansicht der Schabe Nervenstrang wie bei der ventralen Nagelhaut entfernt gesehen (A). Eine vergrößerte Ansicht des Segments durch Pfeile skizziert ist in (B) gesehen. In (C) wurden die Verknüpfungen zwischen A4 und A3 mit einer Glassonde verschüttet. Die 6. Abdominalganglion ist in (D) mit den beiden cercal Nerven verlassen am Schwanzende gezeigt. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig3.jpg" /> Abbildung 3. Schematische Ansicht der ventralen Nervenstrang Kakerlake. ys &quot;&gt; <img alt="Fig. 4" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig4.jpg" /> Abbildung 4. Die Cerci sind nach oben aus dem Solebad positioniert. Die geöffneten Bauchraum mit Kochsalzlösung (A) mit dem Schwanzende des Plötze mit einem kleinen keilförmigen Stück Silikon-Elastomer, um die Cerci draußen zu halten erhöht überflutet werden der Badewanne (B). <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig5.jpg" /> Abbildung 5. Die 6. Abdominalganglion mit der cercal Nerven (durch Pfeile angedeutet). <img alt="Fig. 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig6.jpg" /> Abbildung 6. Das Gerät einrichten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50584/50584fig6large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um zu sehen lar</a>ger Figur. <img alt="Fig. 7" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig7.jpg" /> Abbildung 7. Stimulating und Aufzeichnungselektrode einrichten. <img alt="Fig. 8" fo:content-width="5.75in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig8.jpg" /> Abbildung 8. Neural Aufnahmen der Verknüpfungen und cercal Nervenstimulation mit verschiedenen Verfahren. Aufnahme mit einer Saug-Elektrode aus den Verknüpfungen zwischen A3 und A4, während schnaufend Luft an der Cerci (A). Aufnahme aus den primären cercal Neuronen mit einer Saug-Elektrode, während entweder physisch Reiben (B 1) oder die Erbringung von Flugwindbeutel (B 2) führt zu einer schnellen Ausbrüche von Aktivität in der cercal Nerv. Elektrisch Stimulierung des Nerven cercal produziert Antworten in Verknüpfungen ( <strong&gt; C-1). Beachten Sie die schrittweise Erhöhung der Stimulationsintensität (Pfeile geben die Amplitude des Stimulationsartefakt) und die Intensität des folgenden hervorgerufenen Reaktionen. Die elektrische Stimulation des Nerven cercal bietet eine relativ kontrolliert mittels Stimulierung des Nerven cercal für Konsistenz in der Stimulation für die Quantifizierung der Antworten (C 2).

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Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

Dieser Artikel beschreibt die Kakerlake Bauchmark Dissektion und Aufnahmen aus dem extrazellulären cercal Nerven und Verknüpfungen. Hervorgerufenen Reaktionen werden durch elektrische Stimulation der Nerven-oder cercal direkte mechanische Stimulation der Cerci erzeugt.

Neuronalen Schaltkreis-Aufnahme von einem intakten Nervensystem Schabe

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological ...

neural-circuit-recording-from-an-intact-cockroach-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

32.1K Aufrufe.  University of Kentucky.  Dieser Artikel beschreibt die Kakerlake Bauchmark Dissektion und Aufnahmen aus dem extrazellulären cercal Nerven und Verknüpfungen. Hervorgerufenen Reaktionen werden durch elektrische Stimulation der Nerven-oder cercal direkte mechanische Stimulation der Cerci erzeugt. 

Serie: Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably label the global patterning of multiple topographic projections. The cerebellum is an ideal model to study the orderly arrangement of neural circuits. For example, the compartmental organization of spinocerebellar mossy fibers has proven to be an indispensable system for studying mossy fiber patterning. We recently showed that wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa 555 and 488 can be used for tracing spinocerebellar mossy fiber projections in developing and adult mice (Reeber et al. 2011). We found three major properties that make the WGA-Alexa tracers desirable tools for labeling neural projections. First, Alexa fluorophores are intense and their brightness allows for wholemount imaging directly after tracing. Second, WGA-Alexa tracers label the entire trajectory of developing and adult neural projections. Third, WGA-Alexa tracers are rapidly transported in both retrograde and anterograde directions. Here, we describe in detail how to prepare the tracers and other required tools, how to perform the surgery for spinocerebellar tracing and how best to image traced projections in three dimensions. In summary, we provide a step-by-step tracing protocol that will be useful for deciphering the organization and connectivity of functional maps not only in the cerebellum but also in the cortex, brainstem, and spinal cord.

We provide a practical guide for delivering tracers in vivo and use the spinocerebellar pathway as a model system to demonstrate essential steps for successful neuronal circuit analysis in mice. We describe in detail our versatile tracing protocol that exploits wheat germ agglutinin (WGA) conjugated to Alexa fluorophores.

Revealing Neural Circuits Topographie in Multi-Color

Neural circuits are organized into functional topographic maps. In order to visualize complex circuit architecture we developed an approach to reliably ...

Forschung

Neurowissenschaften

Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13. In the auditory system, fundamental response properties of brainstem neurons including threshold, frequency specificity, and inhibitory sidebands are altered in significant ways under anesthesia1-2. These observations prompted physiologists to seek ways to record from single neurons without the contaminating effects of anesthesia. One result was a decerebrate preparation, where the brainstem was completely transected at the level of the midbrain4. The drawbacks of this preparation are a formidable surgery, the elimination of descending projections from the forebrain, and an inability to use sensory stimulation to examine structures above the midbrain. A different strategy has been to implant electrode arrays chronically to record from single neurons and multiunit clusters while the animal is awake and/or behaving5,6. These techniques however are not compatible with injecting tracer dyes after first electrophysiologically characterizing a brain structure. To avoid altering neural response properties with anesthetics while recording electrophysiological response properties from single neurons, we have adapted a head restraint technique long used in bats7-9 to mouse10-12. Using this method, we are able to conduct electrophysiological recordings over several days in the unanesthetized mouse. At the end of the recording sessions, we can then inject a dye to reconstruct electrode positions and recording sites or inject a tracer so that pathways to and from the recording loci can be determined. This method allows for well isolated single neuron recordings over multiple days without the use anesthetics.

Electrophysiological characterization of neuronal responses is important for understanding brain function and for guiding the placement of dyes for pathway tracing. However, many studies are performed in anesthetized animals. To understand brain function without anesthetics, we developed a method to record neuronal response properties and inject dyes in awake mouse.

Die Erstellung eines Awake Mausklick für Aufnahme neuronalen Antworten und Einspeisen von Tracer

It is well known that anesthesia alters neural response properties in various regions of the brain.13.  In the auditory system, fundamental response ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

Die Produktion von lentiviralen Vektoren für die Transduktion von Zellen aus dem Zentralen Nervensystems

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

Eine Verletzung Paradigm Central Nervous System Repair in Untersuchen<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

Aufzeichnung der elektrischen Aktivität von identifizierten Neuronen im intakten Gehirn von transgenen Fischen

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory environment and the limited capacity for neurogenesis. We are developing&#160;a strategy to simultaneously address&#160;neuronal and axonal pathway loss within the damaged CNS. This manuscript presents the fabrication protocol for micro-tissue engineered neural networks (micro-TENNs), implantable constructs consisting of neurons and aligned axonal tracts spanning the extracellular matrix (ECM) lumen of a preformed hydrogel cylinder hundreds of microns in diameter that may extend centimeters in length. Neuronal aggregates are delimited to the extremes of the three-dimensional encasement and are spanned by axonal projections. Micro-TENNs are uniquely poised as a strategy for CNS reconstruction, emulating aspects of brain connectome cytoarchitecture and potentially providing means for network replacement. The neuronal aggregates may synapse with host tissue to form new functional relays to restore and/or modulate missing or damaged circuitry. These constructs may also act as pro-regenerative&#160;&#34;living scaffolds&#34; capable of exploiting developmental mechanisms for cell migration and axonal pathfinding, providing synergistic structural and soluble cues based on the state of regeneration. Micro-TENNs are fabricated by pouring liquid hydrogel into a cylindrical mold containing a longitudinally centered needle. Once the hydrogel has gelled, the needle is removed, leaving a hollow micro-column. An ECM solution is added to the lumen to provide an environment suitable for neuronal adhesion and axonal outgrowth. Dissociated neurons are mechanically aggregated for precise seeding within one or both ends of the micro-column. This methodology reliably produces self-contained miniature constructs with long-projecting axonal tracts that may recapitulate features of brain neuroanatomy. Synaptic immunolabeling and genetically encoded calcium indicators suggest that micro-TENNs possess extensive synaptic distribution and intrinsic electrical activity. Consequently, micro-TENNs represent a promising strategy for targeted neurosurgical reconstruction of brain pathways and may also be applied as biofidelic models to study neurobiological phenomena in vitro.

This manuscript details the fabrication of micro-tissue engineered neural networks: three-dimensional micron-sized constructs comprised of long aligned axonal tracts spanning aggregated neuronal population(s) encased in a tubular hydrogel. These living scaffolds can serve as functional relays to reconstruct or modulate neural circuitry or as biofidelic test-beds mimicking gray-white matter neuroanatomy.

Anatomisch inspirierte dreidimensionale Mikro-Gewebe-konstruierte Neuronale Netze für Nervensystem-Rekonstruktion, Modulation und Modellierung

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Elektrophysiologische Aufnahme der zentralen Nervensystems Tätigkeit der dritte Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

Weitfeld-Einzelphotonen optische Aufnahme in Gehirnscheiben mit spannungsempfindlichem Farbstoff

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

Dissektion und Isolierung von murinen Glia aus mehreren Regionen des zentralen Nervensystems

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Evaluation and Manipulation of Neural Activity Using Two-Photon Holographic Microscopy

Recent advances in optical bioimaging and optogenetics have enabled the visualization and manipulation of biological phenomena, including cellular activities, in living animals. In the field of neuroscience, detailed neural activity related to brain functions, such as learning and memory, has now been revealed, and it has become feasible to artificially manipulate this activity to express brain functions. However, the conventional evaluation of neural activity by two-photon Ca2+ imaging has the problem of low temporal resolution. In addition, manipulation of neural activity by conventional optogenetics through the optic fiber can only simultaneously regulate the activity of neurons with the same genetic background, making it difficult to control the activity of individual neurons. To solve this issue, we recently developed a microscope with a high spatiotemporal resolution for biological applications by combining optogenetics with digital holographic technology that can modify femtosecond infrared laser beams. Here, we describe protocols for the visualization, evaluation, and manipulation of neural activity, including the preparation of samples and operation of a two-photon holographic microscope (Figure 1). These protocols provide accurate spatiotemporal information on neural activity, which may be useful for elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that lead to abnormalities in neural activity.

We developed a two-photon holographic microscope that can visualize, assess, and manipulate neural activity using high spatiotemporal resolution, with the aim of elucidating the pathogenesis of neuropsychiatric disorders that are associated with abnormal neural activity.