Dieses Protokoll ermöglicht es dem Benutzer, eine effiziente Transgenexpression im ventrikulären Myokard zu erreichen, was Genexpressionsstudien zur Untersuchung von Herzrhythmusstörungen und Funktionen im ventrikulären Gewebe erleichtert. Die Technik zur viralen Transgenexpression ist für das Tier minimal-invasiv und verursacht weniger Schäden und kürzere Erholungszeiten als herkömmliche Ansätze, die eine Thorakotomie beinhalten. Die Technik zur Induktion von Arrhythmien in kleinen Nagetierherzen ist nützlich, um die Anfälligkeit für Arrhythmien in Kleintiermodellen für Herzerkrankungen zu beurteilen.
Das Verfahren wird von Dr. Alice Lu, einer Postdoktorandin aus dem Labor, demonstriert. Sterilisieren Sie zunächst den linken unteren Brustbereich der anästhesierten Maus mit abwechselnden Runden eines Peelings auf Jod- oder Chlorhexidinbasis in Alkohol, dreimal in kreisförmiger Bewegung. Führen Sie unter Anleitung der Ultraschallbildgebung die Nadel der Spritze mit dem Virus in die Brust des Tieres ein.
Nähern Sie sich der Nadelspitze in die linksventrikuläre vordere freie Wand und injizieren Sie langsam 10 bis 15 Mikroliter des Virus. Überprüfen Sie die erfolgreiche Injektion in Ultraschallbildern durch die erhöhte Helligkeit in der Nähe der Nadelspitze. Ziehen Sie die Nadel aus dem Herzen und führen Sie sie in andere Regionen des linken Ventrikels ein, um eine zweite und dritte Injektion der gleichen Virusmenge zu erhalten.
Um eine Langendorff-Perfusion des Mausherzens durchzuführen, legen Sie das kanülierte Herz in eine mit Silikonelastomer beschichtete, 10 Zentimeter lange Kunststoffschale mit dem linken Ventrikel nach oben. Kanulieren Sie die Aorta des Herzens mit einer stumpfen Nadel, die mit einem modifizierten Langendorff-Profusionssystem im Modus mit konstanter Flussrate verbunden ist. Perfundiert Sie das Herz mit sauerstoffbeblasener Tyrode-Lösung bei 37 Grad Celsius.
Überprüfen Sie zu Beginn der Perfusion die korrekte Aortenkanülation, indem Sie die Auswaschung des Blutes aus dem Herzen während der ersten zwei bis drei Herzschläge beobachten und die Herzfarbe von rot zu blass ändern. Stellen Sie die Durchflussrate so ein, dass der Perfusionsdruck bei 70 bis 80 Millimeter Quecksilbersäule bleibt. Legen Sie nach der Bestätigung die Elektroden eines Kleintier-EKG-Systems um das Herz herum, indem Sie sie in die Silikon-Elastomer-Beschichtung in der Schale einführen.
Zeichnen Sie dann das EKG mit einer kompatiblen Software auf. Als nächstes führen Sie eine adrenerge Rezeptorstimulation durch und perfundiert das Herz mit Isoproterenol und Tyrode-Lösung. Führen Sie nach 10 Minuten eine programmierte elektrische Stimulation durch, um ventrikuläre Tachyarrhythmien zu induzieren, indem Sie das Herz an der Spitze mit zwei Platinelektroden stimulieren, die mit einem elektrischen Stimulator verbunden sind.
Starten Sie den Stimulationsvorgang mit den ersten 10 aufeinanderfolgenden Stimuli S1, gefolgt von einem zusätzlichen Stimulus S2 mit einem Anfangsintervall von 80 Millisekunden. Reduzieren Sie dann das S2-Intervall jedes Mal wiederholt um zwei Millisekunden, bis der Herzschlag nicht mehr erfasst werden kann oder die effektive Refraktärperiode (ERP) des Herzens erreicht ist. Überwachen Sie alle induzierten ventrikulären Tachyarrhythmien, einschließlich ventrikulärer Tachykardie und Flimmern, durch EKG.
Wenn keine Arrhythmien induziert werden. Fügen Sie nach S2 einen weiteren zusätzlichen Stimulus, S3, mit den gleichen Parametern hinzu, bis das ERP erreicht ist. Wenn ventrikuläre Tachyarrhythmien immer noch nicht induziert werden, stoppen Sie die elektrische Stimulation und betrachten Sie das Herz als nicht induzierbar.
Während der programmierten elektrischen Stimulation wird das erfolgreiche Pacing des Herzens durch die Eins-zu-Eins-Erfassung des Herzschlags während der aufeinanderfolgenden S1-Stimuli und des verlängerten QRS-Komplexes während des S1-Pacings verifiziert. Diese kombinierten adrenergen und elektrischen Stimulationen induzierten keine ventrikulären Tachyarrhythmien bei gesunden, scheinoperierten Wildtyp-Mausherzen oder bei Kontroll-Adenovirus-GFP-injizierten Rattenherzen. Im Gegensatz dazu induzierte das gleiche Protokoll ventrikuläre Tachyarrhythmien bei 77 % der Wildtyp-Mäuseherzen nach Myokardinfarkt und bei drei von vier Ratten nach intramyokardialer Injektion von Ad-Wnt3a.
Achten Sie beim Einführen der Nadel darauf, dass die Nadelspitze in die freie Wand und nicht in den Ventrikel eingebettet ist. Auch die Sicherung und Kanülierung der Aorta des Herzens ist der kritischste Schritt. Nach diesen Verfahren können Herzen für histologische Standardstudien oder molekularbiologische Tests verwendet werden.
Alternativ können lebende Zellen isoliert werden, um einzellige elektrophysiologische Studien durchzuführen.
