Dieses Protokoll ist wichtig, da es nicht nur die Visualisierung ermöglicht, ob eine Enhancer-Sequenz die Expression steuern kann, sondern auch, wo sie die Expression in einem bestimmten Teil des Körpers steuern kann. Es ist schnell. Die Injektionen dauern weniger als 10 Minuten, und ob und wo ein Reportergen exprimiert wird, kann innerhalb weniger Tage nach der Probenentnahme gesehen werden.
Um mit dem Klonen zu beginnen, wählen oder entwerfen Sie ein Reporterkonstrukt. Das hier verwendete Konstrukt platziert den Enhancer-Kandidaten in die drei wichtigsten untranslatierten Regionen eines EGFP-Reportergens, das unter der Kontrolle des hsp68-Minimalpromotors exprimiert wird. Um die PCR-Primer für die Amplifikation einer Sequenz von Interesse und das Klonen in den Vektor zu entwerfen, fügen Sie den entsprechenden Homologiearm für die Gibson-Klonierung an das fünf Primzahlende der Primer hinzu.
Führen Sie mit den entwickelten Primern eine PCR aus einer DNA-Probe durch. Verdauen Sie ein bis 10 Mikrogramm Vektor-DNA mit Pac1 und Asc1, abhängig von der gewünschten Anzahl der erforderlichen Klonreaktionen. Durch Verwendung von 0,7 bis 1% Gelelektrophorese für 30 bis 60 Minuten bei 100 Volt trennen Sie die Restriktionsdigest-Fragmente.
Extrahieren Sie das Band für den linearisierten Vektor und reinigen Sie es mit einem handelsüblichen Gelextraktionskit. Sobald das Gibson-Klonen und die Transformation der Zellen abgeschlossen sind, werden die Zellen auf selektiven Medien beschichtet und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert. Nachdem Sie das erfolgreiche Klonen des Reporterkonstrukts überprüft haben, impfen Sie fünf Milliliter der Starterkultur mit dem Glycerinvorrat.
Züchten Sie die Kultur für acht bis 16 Stunden in einem Schüttelinkubator bei 30 Grad Celsius und 180 Umdrehungen pro Minute. Wenn die Brühe trüb wird, verdünnen Sie die Starterkultur 1.000x in 250 bis 300 Milliliter frischer selektiver LB-Brühe und inkubieren Sie sie über Nacht in einem Schüttelinkubator bei 30 Grad Celsius und 180 Umdrehungen pro Minute. Reinigen Sie das Plasmid mit einem handelsüblichen Plasmid-Maxi-Kit.
Um die Rekombination der ITRs zu testen, führen Sie eine Xma1-Verdauung durch. Visualisieren Sie die Bänder. Stellen Sie sicher, dass Ihr Digest die erwartete Anzahl von Bändern anzeigt.
Die Rekombination führt zu weniger Bändern als erwartet. Rekombinante AAV-Mischung für die Lieferung vorbereiten. Wenn Sie die Expressionsmuster mehrerer Enhancer-Reporterviren vergleichen, verdünnen Sie jedes Virus, um die Virustiter mit dem am wenigsten konzentrierten Virus gleichzusetzen.
Mischen Sie das Enhancer-Reportervirus und das konstitutiv ausgedrückte Kontrollreportervirus in einem Verhältnis von zwei zu eins oder drei zu eins. Fügen Sie eine kleine Menge schnellen grünen Farbstoff mit einer Endkonzentration von 0,06% hinzuBrechen Sie die Spitze einer gezogenen Glaspipette aus einem Mikroliter-Kapillarrohr, indem Sie sie vorsichtig in ein zartes, fusselfreies Tuch stechen. Führen Sie die Pipette in eine Absaugvorrichtung mit einer Druckansaugvorrichtung ein, die mit einer Gummidichtung zur Aufnahme einer Mikrokapillarpipette verbunden ist.
Ziehen Sie ein kleines Volumen von etwa 0,2 bis 0,5 Mikrolitern Mineralöl in die Pipette, indem Sie Unterdruck durch den Absauger anlegen. Halten Sie die Absaugeinheit beiseite und legen Sie das Virus auf Eis, bis es zur Injektion bereit ist. Nach der Kryoanästhesie der Neugeborenenmäuse Unterdruck mit der Aspiratoranordnung anlegen und die Virusmischung in die gezogene Glaspipette ziehen, bis der Meniskus die Zwei-Mikroliter-Häkchenmarke passiert.
Nehmen Sie die Maus aus der Kältekammer und legen Sie sie auf die Tischplatte. Lokalisieren Sie die bilateralen Injektionsstellen auf halbem Weg zwischen Lambda und Bregma sowie die sagittale Naht und jedes Auge. Desinfizieren Sie sie mit einem Alkoholtuch.
Durchbohren Sie den Schädel der neugeborenen Mäuse mit der gezogenen Glaspipette. Wenn die Nadel in den Schädel eindringt, üben Sie einen positiven Druck durch die Absaugeinheit aus. Geben Sie einen Mikroliter des Virus in den lateralen Ventrikel und ziehen Sie die Pipette zurück.
Legen Sie die Maus auf ein Heizkissen oder eine Wärmekammer, um sich zu erholen. Bringen Sie das Tier nach dem Erwachen in den heimischen Käfig zurück. Nehmen Sie Fluoreszenzbilder auf, die den Gehirnabschnitt mit einer 5-fachen subjektiven Linse mit geringer Vergrößerung durchqueren.
Durch die Lokalisierung der Injektionsstelle ist das Ausmaß der Virustransduktion in Abhängigkeit von der Dichte und Intensität der rot fluoreszierenden Zellen zu bewerten. Vergleichen Sie die Tiere, die ähnlich übertragen wurden. Nehmen Sie fluoreszierende Bilder mit einem Objektivobjektiv mit höherer Vergrößerung von mehr als 25x auf.
Öffnen Sie als Nächstes die Analysesoftware und wenden Sie einen Drei-mal-Drei-Medianfilter an, um das Rauschen zu reduzieren. Klicken Sie auf das Menü Verarbeiten, dann auf Rauschen und wählen Sie die Option Flecken entfernen. Um die Hintergrundfluoreszenz von den Bildern zu subtrahieren, trennen Sie zunächst die Kanäle eines Mehrkanalbildes.
Klicken Sie auf das Menü Bild, dann auf Farbe und wählen Sie die Option Kanäle teilen. Zeichnen Sie mit dem Rechteck- oder Kreisauswahlwerkzeug eine kleine Form in einem Bereich des Bildes ohne fluoreszierende Zellen. Messen Sie die durchschnittliche Pixelintensität des Hintergrunds, indem Sie auf Analysieren und dann auf Messen klicken, und wiederholen Sie den Vorgang mehrmals.
Mittelwert des mittleren Grauwerts von fünf auf acht Hintergrundbereiche, und entfernen Sie die Dezimalwerte. Subtrahieren Sie die Werte von jedem Pixel im Bild, indem Sie das Menü "Verarbeiten" auswählen und dann auf "Mathematik" und "Subtrahieren" klicken. Geben Sie als Nächstes den zu subtrahierenden Hintergrundwert ein und klicken Sie auf OK. Falls erforderlich, fügen Sie die Kanäle wieder zu einem Mehrkanalbild zusammen, indem Sie das Menü Bild auswählen, dann auf Farbe klicken und Kanäle zusammenführen auswählen.
Um die Anzahl der grün fluoreszierenden Zellen zu zählen, blenden Sie den grünen Kanal aus und zeichnen Sie mit dem Freiform-Auswahlwerkzeug eine Form um die Gehirnregion, die rote Fluoreszenz ausdrückt. Klicken Sie auf die Funktion Messen, um die Fläche, die integrierte Dichte und den mittleren Grauwert des Rotkanals in der ausgewählten Zone zu messen. Zählen Sie die Anzahl der grünen Zellen mithilfe eines Mehrpunktauswahlwerkzeugs, und normalisieren Sie die Anzahl der grünen Felder um die integrierte Intensität des roten Kanals.
Nach dem Transducing des Enhancer-Reporters zeigte die intrakranielle Injektion der Maus bei P0 mit einem positiven AAV-Konstrukt eine enhancergetriebene EGFP-Expression in den mittleren unteren Schichten des Kortex 28 Tage nach der Injektion. Die Maus, der ein Negativkontrollkonstrukt bei P0 injiziert wurde, zeigte 28 Tage nach der Injektion keine Expression von EGFP, was zeigt, dass die Enhancer-Elemente die Transkription von EGFP im Gehirn der Maus vorantreiben. Um den erfolgreich übertragenen Bereich zu visualisieren und auf potenzielle Variabilität zu kontrollieren, wurden AAV-gelieferte Enhancer-Reporterbibliotheken verschiedener Titer untersucht.
Die High-Titer-Bibliothek der Kandidaten-Enhancer treibt eine breite EGFP-Expression an, während die Low-Titer-Bibliothek der Kandidaten-Enhancer die spärliche CGFP-Expression im P7-Mausgehirn antreibt. Es ist wichtig, den Enhancer-Reporter AAV mit der Positivkontrolle bei jeder Injektion zu mischen, um zwischen Enhancern ohne Aktivität und fehlgeschlagenen Lieferungen zu unterscheiden. Dieses Verfahren kann mit Immunhistochemie, RNA-FISH oder Einzelzell-RNA-Sequenzierung kombiniert werden, um zu bestimmen, in welchen Zelltypen ein Enhancer aktiv ist.
