Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen über Telomere zu beantworten, wie Hefe telomernichtcodierende RNA TERRA Lokalisierung, und ich kann darauf bestehen, dass es Telomer des Ursprungs oder in trans, ein anderes cromes-mants Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es Forschern ermöglicht, TERRA Moleküle aus einem einzigen Telomer in lebenden Zellen auszudrücken. Demonstriert wird das Verfahren von Claudio Oss Pegorar und Nicole Bettin, zwei Doktoranden aus meinem Labor. Um mit dem Wachstum von AGS-Zellen gemäß dem Textprotokoll zu beginnen.
Wenn die Zellen dann 50 bis 60% Konfluenz erreichen, werden sie mit dem sgRNA Cas9-Expressionsvektor und der MS2-Kassette betrachtet. Am nächsten Tag ersetzen Sie das Kultivierungsmedium durch ein Medium, das Neomycin enthält. Danach fügen Sie 10 Mikroliter von 0,25%Tripsyn zu jedem Brunnen einer 96 Brunnenplatte hinzu.
Markieren Sie mit einem Mikroskop und einem Marker die Position jedes klonenden Klons, der in der Schale sichtbar ist. Ersetzen Sie das Neomycin-Kultivierungsmedium durch genügend PBS, um einen dünnen Flüssigkeitsfilm auf den Klonen zu bilden. Mit einer 10-Mikroliter-Pipette mit fünf Mikroliter Trypsin, lassen Sie das Trypsin langsam auf die Kolonie.
Lassen Sie das Trypsin die Zellen für eine Minute lösen. Scrape die Kolonie mit der Spitze, und saugen Sie es in die Spitze. Danach übertragen Sie die Zellen aus der Kolonie in einen Brunnen der 96-Brunnenplatte.
Inkubieren Sie die Platte für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Dann füllen Sie den Brunnen mit 150 Mikroliter selektivem Medium. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter Gelatine zu jedem Brunnen von drei 96 Brunnenplatten hinzu.
Inkubieren Sie die Platten bei Raumtemperatur für 30 Minuten, und waschen Sie die Platten mit PBS zweimal. Nachdem die Klone 90% Zusammenfluss erreichen, das Medium aus jedem Brunnen der Platte aspirieren und die Platte mit PBS waschen. Dann fügen Sie 30 Mikroliter Trypsin zu jedem Brunnen, und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten.
Als nächstes fügen Sie 70 Mikroliter selektives Medium zu jedem der Brunnen hinzu. Stören Sie die Zellen, indem Sie nach oben und unten pfeifen. Übertragen Sie 30 Mikroliter der Mischung auf den Brunnen der gelatinierten DNA-Platte, die 120 Mikroliter selektives Medium enthält.
Dann 30 Mikroliter der Mischung auf die gelatinierte Gefrierplatte mit 50 Mikroliter Medium übertragen. Legen Sie die DNA in den Inkubator und lassen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius wachsen, bis sie 90% Zusammenfluss erreichen. Danach 80 Mikroliter eiskaltes Gefriermedium zu jedem Brunnen der Gefrierplatte hinzufügen.
Versiegeln Sie die Platte mit Parafilm, ersetzen Sie den Deckel, und wickeln Sie die Platte in Aluminiumfolie. Dann die Gefrierplatten bei 80 Grad Celsius aufbewahren. Nachdem die Klone in der DNA-Platte 90% Zusammenfluss erreicht haben, waschen Sie die Platte zweimal mit PBS.
Dann lysieren Sie die Zellen mit 50 Mikroliter LysisPuffer. Bedecken Sie die Platte mit Parafilm, ersetzen Sie den Deckel und wickeln Sie die Platte in Saran-Wrap. Danach bebrüten Sie die Platte bei 37 Grad Celsius über Nacht.
Am nächsten Tag 100 Mikroliter Ethanol-Natriumchlorid-Lösung zu jedem Brunnen hinzufügen, und ermöglichen DNA-Fällung für sechs Stunden oder über Nacht bei Raumtemperatur. Dann die Platte umkehren und dreimal mit 200 Mikroliter Ethanol 70% pro Brunnen waschen. Fügen Sie 20 Mikroliter RNase Eine Lösung zu jedem Brunnen der Platte hinzu und brüten Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.
Danach verwenden Sie drei Mikroliter genomischer DNA für die PCR-Verstärkung und richten Sie die PCR-Maschine ein. Wachsen Sie die PCR-positiven Klone in sechs Well-Platten nach dem Textprotokoll. Sobald die Klone 90% Konfluss erreichen, waschen Sie die Zellen mit PBS und fügen Sie 250 Mikroliter Lysispuffer mit Proteinase K zu jedem Brunnen hinzu.
Verwenden Sie einen Zellschaber, um die Zellen zu kratzen, und übertragen Sie das Lysat in ein 1,5 Milliliter-Rohr. Inkubieren Sie das Lysat bei 37 Grad Celsius für 16 Stunden. Fügen Sie dem Lysat einen Milliliter Ethanol hinzu und schütteln Sie es kräftig.
Lassen Sie die Klone in F-12K Medium entsprechend dem Textprotokoll wachsen. Fügen Sie dann das Cre-exezierende Adenovirus in die Zellen ein, sobald sie 70% Zusammenfluss erreicht haben. 48 Stunden nach der Infektion, teilen Sie die Zellen in drei 10-Zentimeter-Gerichte.
Dann kulturieren Sie die dritten Gerichte für Daseinfrieren der Zelle und DIE RNA-Extraktion. Zuerst die TERRA-MS2-Klone und die wilden AGS-Zellen in Glasbodenschalen auftellern. Fügen Sie dann Polybren und das MS2-GFP, das Retrovirus exzessient, auf das Medium.
Nach 24 Stunden das Medium, das das Retrovirus enthält, entsorgen und frisches Medium ohne Phenolrot in die Zellen geben. Schließlich, mit einem invertierten Mikroskop und einer empfindlichen Kamera Bild die Zellen mit dem entsprechenden Objektiv und Blende. In diesem Protokoll wurden Krebszellklone erstellt und abgebildet, die ein MS2-Sequenz-Tag an einem einzelnen Subtelomere enthalten.
Die Neomycin-resistenten Klone wurden mit PCR gescreent. Die positiven Klone wurden zur genomischen DNA-Extraktion und Südfleckanalyse kultiviert. Die klonpositiven Klone für PCR und Die Southern Blot Analyse wurden mit dem CRE-GFP-Exzessatos Adenovirus infiziert, um das in der MS2-Kassette enthaltene Neomycin-Gen zu entfernen.
Nachdem die Eliminierung des Neomycin-Resistenzgens bestätigt wurde, wurde die aus den Klonen extrahierte RNA auf die Expression von TERRA-MS2-Transkripten getestet. Um TERRA-MS2-Transkripte in lebenden Zellen durch konfokale Mikroskopie zu visualisieren, wurden die ausgewählten Klone mit einem Retrovirus infiziert, das ein MS2-GFP-Fusionsprotein exdrückte. TERRA-MS2-Transkripte und Telomere wurden gleichzeitig in lebenden Zellen mittels konfokaler Mikroskopie visualisiert, indem das MS2-GFP-Fusionsprotein und ein mCherry-fused Telomer-Bindungsprotein TRF2 in den ausgewählten Klonen mitexzidiert wurden.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, alle Anstrengungen zu unternehmen, um einen einzelnen Klon anstelle einer gemischten Population von Klonen auszuwählen. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie ein DNA-FISCH auf Chromosomenaufstrichen verwendet werden, um die Integration der MS2-Kassette in feste Zellen zu visualisieren. Nach ihrer Entwicklung kann diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Telomere ebnen, um die zelluläre Lokalisierung einzelner Telomer-TERRA-Moleküle in lebenden menschlichen Zellen zu erforschen.
Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit viralen Vektoren und radioaktiven Materialien extrem unsicher sein kann. Und Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen von Labormänteln, Handschuhen und die Verwendung von Plexiglasschilden zur Minimierung der Strahlung sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.
