Dieses Protokoll verwendet die Bestrahlung mit sichtbarem violettem Licht, um die Flavinmononukleotid-Photolyse zu induzieren. Dabei entsteht eine große Menge an freien Radikalen, die pathogene Bakterien wie Staphylococcus aureus und E. coli hemmen. Wir haben Flavinmononukleotid als geeigneten Photosensibilisator getestet.
In diesem Protokoll verwenden wir sichtbares violettes Licht, das sicher ist und keine teure Ausrüstung erfordert. Diese Methode kann zur Therapie von verletzter Haut oder infiziertem Unterhautgewebe verwendet werden, indem eine optische Faser zur Beleuchtung eingeführt wird. Es kann auch auf die Hygienepraxis in der Lebensmittelindustrie angewendet werden.
Tang-Yu Chen, ein Doktorand aus meinem Labor, demonstriert das Verfahren Zunächst montieren Sie sechs Leuchtdioden mit je 12 Volt an der Innenseite eines undurchsichtigen Plastikbechers. Nehmen Sie ein gläsernes Reagenzglas mit einem Durchmesser von 13 Millimetern und einer Höhe von 100 Millimetern und geben Sie die Reaktanten in das Röhrchen. Befestigen Sie die Schläuche oben im Becher und stellen Sie dieses Setup auf eine konstante Temperatur von 25 bis drei Grad Celsius.
Überwachen und erfassen Sie die Temperatur der Testeinheiten während der photolytischen Reaktionen mit einem Infrarot-Thermometer. Als nächstes wird eine 0,1-Millimolar-FMN-Lösung in 100-Millimolar-Kaliumphosphatpuffer bei pH 7,8 hergestellt. Belichten Sie jeweils drei Milliliter FMN-Proben fünf Minuten lang blauem, grünem, rotem oder violettem Licht.
Halten Sie parallel drei Milliliter FMN-Lösung im Dunkeln als Kontrolle. Legen Sie die Probe in ein UV-sichtbares Spektralphotometer und zeichnen Sie die Absorption der bestrahlten Proben im Bereich von 250 bis 750 Nanometern auf. Um sich auf den Nachweis von Superoxidradikalen vorzubereiten, fügen Sie zunächst 109,3 Milligramm L-Methionin zu 73,3 Milliliter 100-Millimolarphosphatpuffer bei pH 7,8 hinzu.
In die Lösung geben Sie 10 Milligramm NBT-Pulver und 1,5 Milliliter 0,117-Millimolar-FMN. Setzen Sie einen Milliliter der Reaktionslösung für ein bis fünf Minuten blauem oder violettem LED-Licht aus. Notieren Sie die Absorption von 516 Nanometern, um Formazan nachzuweisen, das durch die photochemische Reaktion von NBT erzeugt wird.
Impfen Sie eine Kolonie von Staphylococcus aureus in 10 Milliliter Lysogenie-Bouillon in einem 15-Milliliter-Reagenzglas mit Schraubverschluss. Züchten Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius für 16 Stunden in einem Shaker. Übertragen Sie 0,5 Milliliter der Kultur in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Verdünnen Sie die Kultur auf eine optische Dichte von 0,5 bei 600 Nanometern durch Zugabe von sterilisiertem Wasser. Dann werden 0,5 Milliliter der Kultur in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Bei 14.000 g für 10 Minuten zentrifugieren und den Überstand dekantieren.
Fügen Sie dem Zellpellet und dem Wirbel einen Milliliter FMN-gepufferte Lösung hinzu. Zur Bestrahlungskontrolle wird ein Milliliter Phosphatpuffer hinzugefügt. Einen Milliliter bakterielle Zelllösung, die 30-mikromolare FMN und Phosphatpuffer enthält, in Glasröhrchen überführen.
Platzieren Sie sie für eine Strahlung unter violettem Licht mit 10 Watt pro Quadratmeter für 30 Minuten. Dann wird ein Milliliter bakterielle Zelllösung mit 30-60 und 120 Mikromolar FMN und Phosphatpuffer in Glasröhrchen übertragen. Bestrahlen Sie 120 Minuten lang mit blauem Licht bei 20 Watt pro Quadratmeter Quadratmeter.
Bestrahlen Sie auch ein Röhrchen mit einem Milliliter 120-Mikromolar FMN für 60 Minuten. Nach der Bestrahlung werden 0,2 Milliliter der Reaktionslösung auf eine Luria-Agarplatte gegeben. Die Lösung mit einem L-förmigen Glasstab verteilen und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Berechnen Sie am nächsten Tag die lebensfähige Keimzahl und die Inaktivierungsrate von Staphylococcus aureus. Bereiten Sie die Staphylococcus aureus-Proben wie zuvor beschrieben vor, um ein Zellpellet zu erhalten. Zu 75 Milliliter Phosphatpuffer werden 0,1093 Gramm L-Methionin, 0,1 Gramm NBT und 25 Milliliter FMN-Lösung hinzugefügt.
Geben Sie einen Milliliter jeder Reaktantenlösung mit unterschiedlichen FMN-Konzentrationen zu den Zellpellets und dem Wirbel. Bestrahlen Sie die Lösungen 10 Minuten lang unter violettem Licht mit 10 Watt pro Quadratmeter Quadratmeter. Das Gemisch wird 10 Minuten lang bei 14.000 g zentrifugiert und der Überstand dekantiert.
Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter Dimethylsulfoxid, um das reduzierte NBT zu extrahieren. Notieren Sie die Absorption bei 560 Nanometern. Die Bestrahlung von FMN mit grünem und rotem Licht zeigte keine Wirkung auf die Peaks bei 372 und 444 Nanometern im Vergleich zur Dunkelkontrolle, während die Verringerung der Absorption von FMN bei 444 Nanometern unter blauem und violettem Licht beobachtet wurde, was auf eine erhöhte Photolyse hindeutet.
Der Nachweis von Superoxidradikalen, die während der FMN-Photolyse unter blauem oder violettem Licht gebildet wurden, erfolgte mittels NBT-Reduktion. Die photochemische Wirkung von FMN war abhängig von der Bestrahlungszeit. Die FMN-Photolyse mit blauem oder violettem Licht führte zu einer signifikanten Inaktivierung von Staphylococcus aureus.
Bei der Bestrahlung mit blauem Licht wurde eine dosisabhängige Inaktivierung beobachtet, wobei eine Inaktivierung von 97 % für 120-mikromolares FMN erreicht wurde. Unter violettem Licht wurde eine Inaktivierungsrate von 96% für Staphylococcus aureus erreicht, wobei 30-mikromolare FMN eine höhere Wirksamkeit für die bakterielle Inaktivierung zeigte. Die NBT-Reduktion zeigte, dass die photolytische Wirkung von FMN unter violettem Licht bei Staphylococcus aureus proportional zur FMN-Konzentration war.
Unter unbehandelten Bedingungen wurde eine geringere Häufigkeit von Superoxidradikalen durch eine geringe Absorption bei 560 Nanometern angezeigt, während höhere Absorptionswerte bei der FMN-Behandlung eine reichliche Produktion von Superoxidradikalen zeigten, was zu einem erhöhten photochemischen Effekt führte. Es ist wichtig, eine gute LED-Lichtquelle zu haben. Die spektrale Breite des violetten Lichtbereichs muss eng sein, um eine Überlappung mit der UV-Absorption zu vermeiden, da UV-Strahlung gefährlich sein kann.
Im Anschluss an das Verfahren können andere chemische Verbindungen wie Tetracyclin, Doxycyclin, Catechin und FMN auf Photolyse getestet werden.
