Name: measurement of basal and forskolin-stimulated lipolysis in inguinal adipose fat pads
Uploaded: 2017-07-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Basal and Forskolin-stimulated Lipolysis in Inguinal Adipose Fat Pads at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der AHA Award Nr. 15BGIA23250030, dem National Institute of General Medical Sciences der NIH unter der Auszeichnung Nummer 8P20 GM103432-12 und der University of Wyoming Fakultät Grant in Aid to BT unterstützt.

Alle Protokolle folgen den Tierschutzrichtlinien der Universität Wyoming. 1. Tierhaltung und Fütterung ANMERKUNG: Erwachsene männliche Wildtyp-Mäuse (C57BL / 6) (Alter 12 bis 24 Wochen) wurden in der Forschungstierstätte gemäß den Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigten Protokollen gezüchtet. <ol><li> Ab der Woche 6 des Alters, Haus Mäuse in Gruppen von vier in getrennten Käfigen und zufällig zuordnen sie in Fütterung Gruppen von NCD oder HFD (± 0,01% CAP) bis Woche 38 des Alters. HINWEIS: CAP ist ein Agonist von TRPV1-Kanalprotein, ausgedrückt in Fettgeweben 11 , 17 . Mischen Sie CAP mit HFD in einem Mixer in der Kapuze und übertragen Sie die gemischte Mischung in ein Tablett mit kleinen 1 in 2 Trennwänden. Halten Sie das Tablett in einem -20 ° C Gefrierschrank. Entfernen Sie das Tablett mit der HFD + CAP Diät aus dem Gefrierschrank nach 24 h und lagern Sie in einem Behälter bei -20 &amp;# 176; C Gefrierschrank bis zum Gebrauch. </li><li> Hausmäuse in einer klimatisierten Umgebung (22,8 ± 2,0 ° C, 45 - 50% Feuchtigkeit) mit einem 12/12-Licht / Dunkel-Zyklus mit Zugang zu ausgewiesener Diät und Wasser ad libitum . </li><li> Am Ende von 38 Wochen, sezernden adinösen Fettgewebe und Verwendung für Lipolyse-Experimente (Abschnitte 2-7). </li></ol> 2. Vorbereitung von Mäusen für die Experimente <ol><li> Anästhesieren von Mäusen durch Injektion von Ketamin und Xylazin-Gemisch (10 mg / kg bzw. 80 mg / kg Körpergewicht). Injektion von 0,01 ml der Mischung / 10 g Körpergewicht der Maus. </li><li> Bestätige tiefe Anästhesie durch eine feste Zehenkneife. Wenn es einen Pedalreflex gibt, teste die Maus nach mindestens 30 s erneut. </li><li> Verwenden Sie Tierarzneimittel, um die Trockenheit der Augen während der Anästhesie zu verhindern. Verlassen Sie Mäuse nicht unbeaufsichtigt während eines der Verfahren. </li><li> Euthanisieren von Mäusen durch Einspritzen einer hohen Dosis Ketamin- und Xylazin-Gemischinjektion (10 mg / kg bzw. 80 mg / kg Körpergewicht)E (0,01 ml / 10 g Körpergewicht) gefolgt von Zervixversetzung. ANMERKUNG: Diese Methode der Sterbehilfe wird vom IACUC der Universität Wyoming genehmigt. </li></ol> 3. Isolierung von Inguinal Adipose Fat Pads <ol><li> Legen Sie die Maus (mit NCD oder HFD (± CAP) für 32 Wochen) liegen auf der linken Seite für die Prozedur. HINWEIS: Wenn du die Maus auf die linke Seite legst, wird der linke Vorder- und linke Hinterbein auf der Sektionsplattform stehen, während der rechte Vorsprung und der rechte Hinterbein von der Plattform abgewandt werden. </li><li> Sterilisieren Sie die Hautoberfläche mit einem 2-Zoll- 2- Gaze-Pad, das in etwa 2,5 ml 70% Ethanol eingeweicht wurde. Machen Sie einen 2 - 3 mm seitlichen Schnitt durch die Haut mit einem Skalpell, um die zugrunde liegende Fettschicht zu zeigen. </li><li> Machen Sie einen 1 cm Schnitt (abhängig von der Größe der Maus) durch die Haut mit einem Skalpell direkt unter dem Brustkorb über die dorsale Oberfläche verbinden die beiden seitlichen Einschnitte. </li><li> Schälen Sie die Hautklappe, indem Sie sie sorgfältig ziehenMit steriler Pinzette und lassen Sie die subkutane Auflage intakt, indem Sie nicht die fetten Pads schneiden. Das ist das fette Pad, das unter der Haut liegt. </li><li> Ziehen Sie das Fett-Pad sorgfältig aus dem zugrunde liegenden Muskel und Faszie mit einer Schere. Ziehen Sie das Fett-Pad, wie es aus dem zugrunde liegenden Muskel geschnitten wird. HINWEIS: Das Gewicht und die Größe der Fettpolster hängt von der Art der Mäuse (NCD oder HFD (± CAP) -fed ab). </li><li> Verwenden Sie eine Pinzette, um sie auf eine Petrischale mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) zu übertragen, bis die Lipolyse-Experimente bei Raumtemperatur (~ 15 min) durchgeführt wurden. </li><li> Isoliere die Fettpolster von der rechten Seite der Maus, wie in den Schritten 3.2-3.6 beschrieben. </li></ol> 4. Basal Glycerol Freisetzung von Inguinal Fat Pads <ol><li> Verwenden Sie scharfe Schere, um etwa 20 mg Fettgewebe in 5 bis 8 Stück zu schneiden. </li><li> Inkubieren Sie die geschnittenen Stücke von Leistenfettkissen in 200 &amp; mgr; l Inkubationsmedium (Dulbecco&#39;s Modified Eagel&#39;s Medium (DMEM), das 2% Fettsäure enthältFreies Rinderserumalbumin (BSA)) bei 37 ° C, 5% CO 2 und 95% Feuchtigkeit für 60 min. <ol><li> Das Inkubationsmedium sammeln und bei -80 ° C für den Lipolyse-Test einfrieren. HINWEIS: Die geschnittenen Stücke werden zur Bestimmung der Proteinkonzentration nach der Lipidextraktion verwendet. </li><li> Übertragen Sie die geschnittenen Fettstücke mit Hilfe von Pinzetten in 1 ml Extraktionslösung (Chloroform: Methanol (2: 1, v / v) und 1% Eisessig) und inkubieren für 60 min bei 37 ° C unter kräftigem Schütteln bei 100 ° C Rpm Die Fettabsaugungslösung verwerfen. HINWEIS: Dieser Schritt wird Fett aus den Schnittstücken extrahieren. Verwerfe die Fett-Extraktionslösung, da sie die Proteinbestimmung beeinträchtigen wird. </li><li> Übertragen Sie das Gewebe (aus Schritt 4.2.2) mit einer Pinzette in ein steriles Mikrofugenröhrchen, das 500 μl Lyse-Lösung (0,3 N NaOH, enthaltend 0,1% Natriumdodecylsulfat, SDS) enthält und über Nacht (12 h) bei 55 ° C unter kräftigem Schütteln inkubieren Bei 100 U / min. </li></ol></li><li> Bestimmen Sie die Proteinkonzentration des Gewebes (Schritt 4.2.3) unter Verwendung des Bicinchoninsäure (BCA) -Reagens und BSA als Standard 18 . </li><li> Auftauen des gefrorenen Mediums (Schritt 4.2.1) auf Eis und festzustellen , der Glyceringehalt des Mediums ein freies Glycerin Reagenz wie in Protokoll Abschnitten 6 und 7 beschriebenen 6. <ol><li> Extraktion der Konzentration von Glycerin in Proben aus der Standardkurve, die unter Verwendung von Glycerin-Standards 19 aufgetragen ist, und Expression von Lipolyse als Nanomol-Glycerin pro mg Protein pro h 20 . </li></ol></li></ol> 5. FSK-stimulierte Lipolyse <ol><li> Präinkubieren Sie etwa 20 mg Leistenfettkissen (5 bis 8 Schnittstücke), erhalten aus NCD- oder HFD (± CAP) -Fett-Wildtyp-Maus in 200 μl DMEM mit 2% fettsäurefreiem BSA, 10 μM FSK und 5 μM Triacsin C an 37 ° C in 5% CO 2 und 95% Feuchtigkeit für 60 min. </strOng&gt; <ol><li> Übertragen Sie die Gewebestücke mit Pinzetten auf ein identisches Medium und inkubieren für weitere 60 min bei 37 ° C, 5% CO 2 und 95% Feuchtigkeit. Sammle das Inkubationsmedium und lag bei -80 ° C bis zum Lipolyse-Assay. HINWEIS: Die Stimulation der Lipolyse bewirkt eine rasche Freisetzung von Fettsäuren und Glycerin innerhalb von 15 min, die während der ersten Stunde linear ist, und Plateaus danach. Da die Rate stimulierter Lipolyse höher und stabiler ist Zeitraum zwischen der ersten und zweiten Stunde der FSK - Stimulation, dieses Protokoll gemessen Lipolyse in dem stimulierten Zustand nach dem zweiten Inkubation , wie zuvor 1 beschrieben. So sind sowohl die experimentellen Schritte (5.1 und 5.1.1) notwendig. </li></ol></li><li> Um Fett aus Leistenfettkissen zu extrahieren, übergeben Sie die geschnittenen Stücke von Leistenfettkissen (erhalten von NCD- oder HFD- (± CAP) -Fed-Mäusen) aus Schritt 5.1 mit Hilfe von Pinzetten in 1 ml Extraktionslösung (Chloroform: Methanol (2 : 1. v /V) und 1% Eisessig) und inkubieren für 60 min bei 37 ° C unter kräftigem Schütteln bei 100 U / min. Das extrahierte Fett verwerfen. </li><li> Übertragen Sie das Gewebe (aus Schritt 5.2) mit einer Pinzette in ein steriles Mikrofugenröhrchen, das 500 μl Lyse-Lösung (0,3 N NaOH, enthaltend 0,1% SDS) enthält und über Nacht (12 h) bei 55 ° C unter kräftigem Schütteln bei 100 U / min inkubieren. </li><li> Bestimmen Sie die Proteinkonzentration und den Glyceringehalt des Gewebes, wie in den Schritten 4.3 bzw. 4.4 beschrieben. </li></ol> 6. Herstellung des freien Glycerinreagens <ol><li> Das Glycerinreagenz 19 in 40 ml entionisiertem Wasser in einer bernsteinfarbenen Glasfläschchen rekonstituieren, einen Stopf auf die Durchstechflasche legen und 10 mal mischen. Mischen Sie nicht durch Schütteln. </li><li> Lagern Sie die Durchstechflasche bei 4 ° C in einem kühlschrank vor Licht, indem Sie die Durchstechflasche vollständig mit Aluminiumfolie abdecken. </li><li> Weiter zur Vorbereitung des Glycerin-Standards (Abschnitt 7). </Li&gt; </ol> 7. Vorbereitung des Glycerin-Standards und Bestimmung des Glycerin-Gehalts <ol><li> Machen Sie einen Vorrat von 1 mM durch Verdünnen von 35 &amp; mgr; l des zugeführten Materials mit 65 &amp; mgr; l entionisiertem Wasser. ANMERKUNG: Der Hersteller lieferte Glycerin-Standardlager 2,8 mM Glycerin. </li><li> Nehmen Sie fünf 1-cm-Pfadlänge Einweg-Methacrylat-Küvetten. Markieren Sie die Küvetten mit einem Marker als 0, 1.25, 2.5, 5 und 10 nmol Standard. </li><li> Füge 0, 1,25, 2,5, 5 und 10 μl 1 mM Glycerin-Standard zu den jeweiligen markierten Küvetten hinzu. Das Volumen jeder Küvette auf 10 μl mit entionisiertem Wasser auffüllen. </li><li> 1 bis 10 Verdünnung aller Proben (aus Schritt 4.4 oder 5.1.1) durch Zugabe von 10 μl der Probe zu 90 μl deionisiertem Wasser in frische 500 μl prämarkierte Zentrifugenröhrchen herstellen. 10 μl der verdünnten Proben in die mit der jeweiligen Probenidentifikationsnummer markierten Küvetten geben. </li><li> Schalte das UV-VIS-Spektrophotometer ein und setze die Welle einLänge bis 540 nm. </li><li> Das freie Glycerinreagenz auf Raumtemperatur erwärmen, indem man die Durchstechflasche (Schritt 6.2) bei Raumtemperatur 15 min lang hält. </li><li> Stellen Sie eine Reihe von markierten Küvetten als leeren &quot;0&quot; nmol Standard (Schritt 7.3), Standards (Schritt 7.3) und Proben (Schritt 7.4) auf. </li><li> Fügen Sie 10 μl von jedem der Standard und Probe in die jeweilige markierte Küvette. Verwenden Sie &quot;0&quot; nmol Standard als Leerzeichen. </li><li> Füge 0,8 ml freies Glycerinreagenz in jede Küvette hinzu, wobei die Glycerin-Standards unter Verwendung einer 1-ml-Pipette enthalten sind. </li><li> Die Küvette mit einem 1,5 cm quadratischen Plastik-Paraffin-Film bedecken und den Inhalt durch dreimaliges Umkehren der Küvette mischen und 10 min bei Raumtemperatur ablegen. </li><li> Legen Sie die Küvette in das UV-VIS-Spektrophotometer und notieren Sie die Absorption (540 nm Wellenlänge). </li><li> Zeichnen Sie die Standardkurve unter Verwendung der Konzentrationen der Standards (nmol) in der X-Achse und der aufgezeichneten Absorption in der Y-Achse. </li><li> Berechnen Sie die Konzentration von glYcerol in den Proben (nmol) durch Extrapolation unter Verwendung der in Schritt 7.12 aufgetragenen Standardkurve. </li><li> Multiplizieren Sie die Konzentration der Proben (nmol / Küvette) mit dem Verdünnungsfaktor 10 (siehe Schritt 7.4) und 20 (Gesamtvolumen) </li><li> Teilen Sie die Konzentration von Glycerin in jeder Probe (Schritt 7.13) durch die nach dem BCA-Verfahren berechnete mg Protein. HINWEIS: Da die Leistenfettkissenproben für 60 min inkubiert werden, stellen sie die Ergebnisse als nmol von Glycerin / mg Protein / h dar. </li></ol>

<ol>
	<li>Schweiger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+lipolysis.">Measurement of lipolysis.</a> Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).</li><li>Coelho, M., Oliveira, T., Fernandes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemistry+of+adipose+tissue:+an+endocrine+organ.">Biochemistry of adipose tissue: an endocrine organ.</a> Arch Med Sci. 9 (2), 191-200 (2013).</li><li>Richard, D., Picard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+fat+biology+and+thermogenesis.">Brown fat biology and thermogenesis.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1233-1260 (2011).</li><li>Barquissau, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White-to-brite+conversion+in+human+adipocytes+promotes+metabolic+reprogramming+towards+fatty+acid+anabolic+and+catabolic+pathways.">White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways.</a> Mol Metab. 5 (5), 352-365 (2016).</li><li>Rodriguez, A., Ezquerro, S., Mendez-Gimenez, L., Becerril, S., Fruhbeck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+adipocyte:+a+model+for+integration+of+cytokine+signaling+in+the+regulation+of+energy+metabolism.">Revisiting the adipocyte: a model for integration of cytokine signaling in the regulation of energy metabolism.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 309 (8), E691-E714 (2015).</li><li>Giordano, A., Smorlesi, A., Frontini, A., Barbatelli, G., Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White,+brown+and+pink+adipocytes:+the+extraordinary+plasticity+of+the+adipose+organ.">White, brown and pink adipocytes: the extraordinary plasticity of the adipose organ.</a> Eur J Endocrinol. 170 (5), R159-R171 (2014).</li><li>Langin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+lipolysis+as+a+metabolic+pathway+to+define+pharmacological+strategies+against+obesity+and+the+metabolic+syndrome.">Adipose tissue lipolysis as a metabolic pathway to define pharmacological strategies against obesity and the metabolic syndrome.</a> Pharmacol Res. 53 (6), 482-491 (2006).</li><li>Zimmermann, R., Lass, A., Haemmerle, G., Zechner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+fat:+the+role+of+adipose+triglyceride+lipase+in+lipolysis.">Fate of fat: the role of adipose triglyceride lipase in lipolysis.</a> Biochim Biophys Acta. 1791 (6), 494-500 (2009).</li><li>Miyoshi, H., Perfield, J. W., Obin, M. S., Greenberg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+triglyceride+lipase+regulates+basal+lipolysis+and+lipid+droplet+size+in+adipocytes.">Adipose triglyceride lipase regulates basal lipolysis and lipid droplet size in adipocytes.</a> J Cell Biochem. 105 (6), 1430-1436 (2008).</li><li>Kolditz, C. I., Langin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+lipolysis.">Adipose tissue lipolysis.</a> Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 13 (4), 377-381 (2010).</li><li>Baskaran, P., Krishnan, V., Ren, J., Thyagarajan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsaicin+induces+browning+of+white+adipose+tissue+and+counters+obesity+by+activating+TRPV1+channel-dependent+mechanisms.">Capsaicin induces browning of white adipose tissue and counters obesity by activating TRPV1 channel-dependent mechanisms.</a> Br J Pharmacol. 173 (15), 2369-2389 (2016).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRPV1+by+dietary+capsaicin+improves+endothelium-dependent+vasorelaxation+and+prevents+hypertension.">Activation of TRPV1 by dietary capsaicin improves endothelium-dependent vasorelaxation and prevents hypertension.</a> Cell Metab. 12 (2), 130-141 (2010).</li><li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+lipolysis+response+to+adipose+afferent+reflex+involved+in+impaired+activation+of+adrenoceptor-cAMP-PKA-hormone+sensitive+lipase+pathway+in+obesity.">Reduced lipolysis response to adipose afferent reflex involved in impaired activation of adrenoceptor-cAMP-PKA-hormone sensitive lipase pathway in obesity.</a> Sci Rep. 6, 34374 (2016).</li><li>Ohyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combination+of+exercise+and+capsinoid+supplementation+additively+suppresses+diet-induced+obesity+by+increasing+energy+expenditure+in+mice.">A combination of exercise and capsinoid supplementation additively suppresses diet-induced obesity by increasing energy expenditure in mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (4), E315-E323 (2015).</li><li>Beylot, M., Martin, C., Beaufrere, B., Riou, J. P., Mornex, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+steady+state+and+nonsteady-state+glycerol+kinetics+in+humans+using+deuterium-labeled+tracer.">Determination of steady state and nonsteady-state glycerol kinetics in humans using deuterium-labeled tracer.</a> J Lipid Res. 28 (4), 414-422 (1987).</li><li>Gilker, C. D., Pesola, G. R., Matthews, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mass+spectrometric+method+for+measuring+glycerol+levels+and+enrichments+in+plasma+using+13C+and+2H+stable+isotopic+tracers.">A mass spectrometric method for measuring glycerol levels and enrichments in plasma using 13C and 2H stable isotopic tracers.</a> Anal Biochem. 205 (1), 172-178 (1992).</li><li>Baskaran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPV1+activation+counters+diet-induced+obesity+through+sirtuin-1+activation+and+PRDM-16+deacetylation+in+brown+adipose+tissue.">TRPV1 activation counters diet-induced obesity through sirtuin-1 activation and PRDM-16 deacetylation in brown adipose tissue.</a> Int J Obes (Lond). , (2017).</li><li>Smith, N. C., Fairbridge, N. A., Pallegar, N. K., Christian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+upregulation+of+CD24+in+pre-adipocytes+promotes+adipogenesis.">Dynamic upregulation of CD24 in pre-adipocytes promotes adipogenesis.</a> Adipocyte. 4 (2), 89-100 (2015).</li><li>Schweiger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+lipolysis.">Measurement of lipolysis.</a> Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).</li><li>Duncan, R. E., Ahmadian, M., Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+lipolysis+in+adipocytes.">Regulation of lipolysis in adipocytes.</a> Annu Rev Nutr. 27, 79-101 (2007).</li><li>Ahmadian, M., Duncan, R. E., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+skinny+on+fat:+lipolysis+and+fatty+acid+utilization+in+adipocytes.">The skinny on fat: lipolysis and fatty acid utilization in adipocytes.</a> Trends Endocrinol Metab. 20 (9), 424-428 (2009).</li><li>Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Duncan, R. E., Ahmadian, M., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+triglyceride+metabolism.+IV.+Hormonal+regulation+of+lipolysis+in+adipose+tissue.">Regulation of triglyceride metabolism. IV. Hormonal regulation of lipolysis in adipose tissue.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293 (1), G1-G4 (2007).</li><li>Jeppesen, J., Kiens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+limitations+to+fatty+acid+oxidation+during+exercise.">Regulation and limitations to fatty acid oxidation during exercise.</a> J Physiol. 590 (5), 1059-1068 (2012).</li><li>Nakamura, M. T., Yudell, B. E., Loor, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+energy+metabolism+by+long-chain+fatty+acids.">Regulation of energy metabolism by long-chain fatty acids.</a> Prog Lipid Res. 53, 124-144 (2014).</li><li>Murray, A. J., Panagia, M., Hauton, D., Gibbons, G. F., Clarke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+free+fatty+acids+and+peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+in+the+control+of+myocardial+uncoupling+protein+levels.">Plasma free fatty acids and peroxisome proliferator-activated receptor alpha in the control of myocardial uncoupling protein levels.</a> Diabetes. 54 (12), 3496-3502 (2005).</li><li>Barbera, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+activates+transcription+of+the+brown+fat+uncoupling+protein-1+gene.+A+link+between+regulation+of+the+thermogenic+and+lipid+oxidation+pathways+in+the+brown+fat+cell.">Peroxisome proliferator-activated receptor alpha activates transcription of the brown fat uncoupling protein-1 gene. A link between regulation of the thermogenic and lipid oxidation pathways in the brown fat cell.</a> J Biol Chem. 276 (2), 1486-1493 (2001).</li><li>Leung, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsaicin+as+an+anti-obesity+drug.">Capsaicin as an anti-obesity drug.</a> Prog Drug Res. 68, 171-179 (2014).</li><li>Hursel, R., Westerterp-Plantenga, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermogenic+ingredients+and+body+weight+regulation.">Thermogenic ingredients and body weight regulation.</a> Int J Obes (Lond). 34 (4), 659-669 (2010).</li><li>Kang, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+capsaicin+reduces+obesity-induced+insulin+resistance+and+hepatic+steatosis+in+obese+mice+fed+a+high-fat+diet.">Dietary capsaicin reduces obesity-induced insulin resistance and hepatic steatosis in obese mice fed a high-fat diet.</a> Obesity (Silver Spring). 18 (4), 780-787 (2010).</li><li>Winkler, B., Steele, R., Altszuler, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+of+glycerol+uptake+to+plasma+glycerol+concentration+in+the+normal+dog.">Relationship of glycerol uptake to plasma glycerol concentration in the normal dog.</a> Am J Physiol. 216 (1), 191-196 (1969).</li><li>Dugan, C. E., Cawthorn, W. P., MacDougald, O. A., Kennedy, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+microfluidic+enzyme+assays+for+simultaneous+detection+of+lipolysis+products+from+adipocytes.">Multiplexed microfluidic enzyme assays for simultaneous detection of lipolysis products from adipocytes.</a> Anal Bioanal Chem. 406 (20), 4851-4859 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Der Abbauprozess von TGL in Glycerin und Fettsäuren wird durch ATGL 9 während der Basallipolyse katalysiert und durch eine Reihe von Proteinen einschließlich der Aktivierung des Adenylylcyclase / PKA-abhängigen Weges während der stimulierten Lipolyse 21 , 22 , 23 orchestriert. Verbesserung der Lipolyse erhöht die Plasmaspiegel von Fettsäuren für Transport und Energieverbrauch 24...

Adipöse Gewebe speichern Energie als Fett 2 und Fettsäure Oxidation ist für die Thermogenese 3 , 4 erforderlich. Fettsäuren, die durch Diäten eingenommen werden, werden zusammen mit Apoproteinen in Chylomikronen verpackt und über Blutkreislauf an verschiedene Gewebe im Körper abgegeben. Obwohl die meisten Zellen im Körper speichern eine Reserve von Energie, Fettgewebe speichert überschüssige Energie als Fett 5 , 6 . Die Lipolyse im Fettgewebe wird durch komplexe Prozesse reguliert und die molekularen Details der Lipolyse bleiben noch vage 7 . Die Lipolyse ist ein Verfahren, bei dem Triglyceride (TGL), die im Fettgewebe gespeichert sind, hydrolysiert werden, um Glycerin und Fettsäuren (FA) durch das Enzym adipöse Triglyceridlipase (ATGL) 8 zu erzeugen. Veränderungen in der basalen und stimulierten Lipolyse ist ein charakteristisches Merkmal der Fettleibigkeit. Die bDie asale Lipolyse wird durch die ATGL-Aktivierung 9 reguliert, die TGL in Diacylglycerin (DAG) umwandelt, das anschließend zu Monoacylglycerin (MAG) hydrolysiert wird. Die Aktivierung von hormonempfindlicher Lipase (HSL) über Adenylylcyclase aktiviert die zyklische Adenosinmonophosphat (cAMP) abhängige Proteinkinase A (PKA) Stimulation und bewirkt eine Lipolyse. Die Messung der Lipolyse, basal und stimuliert, ist daher wichtig, um die Aktivität der an diesem Prozess beteiligten Proteine ​​zu analysieren. Auch die Entschlüsselung der molekularen Regulation der Lipolyse kann vorteilhaft sein, um neue therapeutische Strategien gegen die Fettleibigkeit zu entwickeln 10 . Da Moleküle, die die Lipolyse und die Fettsäureoxidation stimulieren, potentielle Kandidaten für die Verringerung der in Depots gespeicherten Fette sind, ist es wichtig, einen robusten Test auf Reproduzierbarkeit zu verwenden. Bisher veröffentlichte Daten deuten darauf hin, dass die Aktivierung von TRPV1-Protein, ausgedrückt in weißem Fettgewebe, durch CAP-basierteUnd FSK (Adenylylcyclaseaktivator) - stimulierte Lipolyse in Leistenfettkissen 11 . Die bisherige Forschung deutet auch darauf hin, dass die langfristige Aktivierung von TRPV1 durch CAP die PKA 12 aktiviert. Da die Aktivierung von PKA die Lipolyse 13 , 14 stimuliert , wird sowohl die basale als auch die PKA-abhängige stimulierte Lipolyse in Leistenfettpolstern, die nach 32 Wochen nach der Fütterung der jeweiligen Diäten von NCD- oder HFD- (± CAP) -Fed-Mäusen isoliert wurden, die Rolle von TRPV1 validieren Aktivierung in der Lipolyse Dieser Artikel beschreibt eine effiziente Methode zur Bestimmung der basalen und stimulierten Lipolyse. Obwohl andere Verfahren, die radioaktive Isotope von Glycerin und mühsame Hochleistungsflüssigchromatographie oder Gaschromatographie / Massenspektrometrie für die Messungen 15 , 16 zur Verfügung stellen, verfügbar sind, bietet diese Methode eine direkte, einfache und kostengünstigeTechnik zur Bestimmung der Lipolyse im Fettgewebe.

<table><tbody><tr><td>Capsaicin</td><td>Sigma, USA</td><td>M2028</td><td>TRPV1 agonist</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma, USA</td><td>F6886</td><td>Adenylyl cyclase activator</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GE healthcare and life sciences, UT, USA</td><td>SH30081.01</td><td></td></tr><tr><td>High fat diet</td><td>Research diets, New Brunswick, USA</td><td>D12492</td><td>Abbreviated as HFD</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco, USA</td><td>O497</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma, USA</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma, USA</td><td>D9163</td><td></td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>Sigma, USA</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma, USA</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Free Glycerol reagent</td><td>Sigma USA</td><td>F6428</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma, USA</td><td>D8779</td><td></td></tr><tr><td>Triacsin C</td><td>Sigma, USA</td><td>T4540</td><td>Acyl CoA transferase inhibitor</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma, USA</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31998-8</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Thermofisher Scientific, USA</td><td>A412-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Amresco, USA</td><td>O583</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>Sigma, USA</td><td>L3371</td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninic acid reagent</td><td>Sigma, USA</td><td>BCA1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS Spectrophotometer</td><td>Pharmacia Biotech, NJ, USA</td><td>Ultrospec 2000</td><td></td></tr><tr><td>Normal chow diet</td><td>Labdiet.com</td><td>500I</td><td>abreviated as NCD</td></tr><tr><td>C57BL/6 mice</td><td>Jackson Laboratory, CT, USA</td><td>Stock number000664</td><td>wild type mice</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Heathrow Scientific, USA</td><td>HS 234526A</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol standard</td><td>Sigma, USA</td><td>G7793</td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of basal and forskolin-stimulated lipolysis in inguinal adipose fat pads

Die Lipolyse ist ein Verfahren, bei dem das als Triglyceride in adipösen Geweben gelagerte Lipid in Glycerin und Fettsäuren hydrolysiert wird. Dieser Artikel beschreibt die Methode zur Messung der basalen und Forskolin (FSK) -stimulierten Lipolyse in den Leistenfettkissen, die von Wildtyp-Mäusen isoliert wurden, die entweder normale Chow-Diät (NCD), fettreiche Diät (HFD) oder eine fettreiche Diät mit 0,01 gefüttert wurden % Des Capsaicins (CAP; transientes Rezeptorpotential Vanilloidunterfamilie 1 (TRPV1) Agonist) für 32 Wochen. Die hier beschriebene Methode zur Durchführung der Ex-vivo- Lipolyse wird von Schweiger et al. 1 Wir stellen ein detailliertes Protokoll zur Messung der Glycerinspiegel durch UV-Visible (UV / VIS) -Spektrophotometrie vor. Die hier beschriebene Methode kann verwendet werden, um Leistenfettkissen für Lipolyse-Messungen erfolgreich zu isolieren, um konsistente Ergebnisse zu erzielen. Das für Leistenfettkissen beschriebene Protokoll kann leicht erweitert werden, um die Lipolyse in anderen Geweben zu messen.

Um die Wirkung von CAP auf die basale und stimulierte Lipolyse zu bewerten, wurde in dieser Untersuchung die Lipolyse in Leistenfett-Pads durchgeführt, die aus NCD- oder HFD- (± CAP) -förmigen Wildtyp-Mäusen isoliert wurden. Die repräsentativen Ergebnisse für die Basal- und FSK-stimulierte Lipolyse für die Leistenfett-Pads sind in Tabelle I angegeben . Basal- und FSK-stimulierte Glycerin-Freisetzung in Gegenwart von Triacsin C, die die Acyl-coA-Synthetase hemmt un...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Basal and Forskolin-stimulated Lipolysis in Inguinal Adipose Fat Pads at JoVE.com

Measurement of Basal and Forskolin-stimulated Lipolysis in Inguinal Adipose Fat Pads

Dieses Protokoll beschreibt die Methode zur Bestimmung der Basal- und Forskolin-stimulierten Lipolyse in Leistenfett-Pads, die aus normaler Chow-Diät (NCD) oder hochfettigen Diät (HFD) ± Capsaicin-gefütterten Wildtyp-Mäusen erhalten wurden. Als Index für die Lipolyse wurde die Glycerinfreisetzung aus Leistenfett-Pads gemessen.

Messung der Basal- und Forskolin-stimulierten Lipolyse bei Inguinal Adipose Fat Pads

Lipolysis is a process by which the lipid stored as triglycerides in adipose tissues are hydrolyzed into glycerol and fatty acids. This article describes ...

measurement-basal-forskolin-stimulated-lipolysis-inguinal-adipose-fat

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.6K Aufrufe.  University of Wyoming.  Dieses Protokoll beschreibt die Methode zur Bestimmung der Basal- und Forskolin-stimulierten Lipolyse in Leistenfett-Pads, die aus normaler Chow-Diät (NCD) oder hochfettigen Diät (HFD) ± Capsaicin-gefütterten Wildtyp-Mäusen erhalten wurden. Als Index für die Lipolyse wurde die Glycerinfreisetzung aus Leistenfett-Pads gemessen. 

Serie: Measurement of Basal and Forskolin-stimulated Lipolysis in Inguinal Adipose Fat Pads

Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis

Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of adipocytes, which in turn induces abnormal secretion of adipokines, triggering metabolic syndromes such as obesity, dyslipidemia, hyperglycemia, hyperinsulinemia, insulin resistance and type 2 diabetes. Therefore, investigating the molecular mechanisms behind adipocyte dysregulation could help to develop novel therapeutic strategies. Our protocol describes methods for evaluating the molecular mechanism affected by hypoxic conditions of the AT, which correlates with adipocyte apoptosis in adult mice. This protocol describes how to analyze AT in vivo through gene expression profiling as well as histological analysis of adipocyte differentiation, proliferation and apoptosis during hypoxia exposure, ascertained through staining of hypoxic cells or HIF-1&#945; protein. Furthermore, in vitro analysis of adipocyte differentiation and its responses to various stimuli completes the characterization of the molecular pathways behind possible adipocyte dysfunction leading to metabolic syndromes.

Adipose tissue (AT) can influence whole body homeostasis, therefore understanding the molecular mechanisms of adipocyte differentiation and function is of importance. We provide a protocol for gaining new insights into these processes by analyzing adipocyte homeostasis, differentiation and hypoxia exposure as a model for induced adipocyte apoptosis.

Mechanismus der Regulierung der Adipocyte Zahlen in adulten Organismen durch Differenzierung und Apoptosis Homöostase

Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

A Microphysiologic Platform for Human Fat: Sandwiched White Adipose Tissue

White adipose tissue (WAT) plays a crucial role in regulating weight and everyday health. Still, there are significant limitations to available primary culture models, all of which have failed to faithfully recapitulate the adipose microenvironment or extend WAT viability beyond two weeks. The lack of a reliable primary culture model severely impedes research in WAT metabolism and drug development. To this end we have utilized NIH's standards of a microphysiologic system to develop a novel platform for WAT primary culture called 'SWAT' (sandwiched white adipose tissue). We overcome the natural buoyancy of adipocytes by sandwiching minced WAT clusters between sheets of adipose-derived stromal cells. In this construct, WAT samples are viable over eight weeks in culture. SWAT maintains the intact ECM, cell-to-cell contacts, and physical pressures of in vivo WAT conditions; additionally, SWAT maintains a robust transcriptional profile, sensitivity to exogenous chemical signaling, and whole tissue function. SWAT represents a simple, reproducible, and effective method of primary adipose culture. Potentially, it is a broadly applicable platform for research in WAT physiology, pathophysiology, metabolism, and pharmaceutical development.

White adipose tissue (WAT) has critical deficiencies in its current primary culture models, hindering pharmacological development and metabolic studies. Here, we present a protocol to produce an adipose microphysiological system by sandwiching WAT between sheets of stromal cells. This construct provides a stable and adaptable platform for primary WAT culture.

Eine Microphysiologic Plattform für menschliches Fett: weißen Fettgewebe eingeklemmt

White adipose tissue (WAT) plays a crucial role in regulating weight and everyday health.  Still, there are significant limitations to available primary ...

Verhalten

Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 reached a staggering sum of $190.2 billion in direct medical costs alone. Obesity is a major risk factor for a wide host of diseases. Historically, little was known regarding adipose and its major and essential functions in the body. Brown and white adipose are the two main types of adipose but current literature has identified a new type of fat called brite or beige adipose. Research has shown that adipose depots have specific metabolic profiles and certain depots allow for a propensity for obesity and other related disorders. The goal of this protocol is to provide researchers the capacity to identify and excise adipose depots that will allow for the analysis of different factorial effects on adipose; as well as the beneficial or detrimental role adipose plays in disease and overall health. Isolation and excision of adipose depots allows investigators to look at gross morphological changes as well as histological changes. The adipose isolated can also be used for molecular studies to evaluate transcriptional and translational change or for in vitro experimentation to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to other published techniques due to the design allowing for isolation of multiple depots with simplicity and minimal contamination.

Due to the drastic and negative connection between obesity and other comorbidities, research on the role adipose plays in disease and overall health is warranted. We present a protocol for the isolation and excision of adipose depots allowing for the study of adipose using in situ and in vitro methods.

Lokalisierung, Identifizierung und Exzision Murine Fettgewebe Depots

Obesity has increased dramatically in the last few decades and affects over one third of the adult US population. The economic effect of obesity in 2005 ...

Medizin

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor response to insulin, local hypoxia, and inflammation. By stimulating the differentiation of functional white adipocytes from progenitors, radical hypertrophy of the adipocyte population can be prevented and, consequently, the metabolic health of adipose tissue can be improved along with a reduction of inflammation. Also, by stimulating a differentiation of beige/brown adipocytes, the total body energy expenditure can be increased, resulting in weight loss. This approach could prevent the development of obesity co-morbidities such as type 2 diabetes and cardiovascular disease.
This paper describes the isolation, expansion, and differentiation of white and beige adipocytes from a subset of human adipose tissue endothelial cells that co-express the CD31 and CD34 markers. The method is relatively cheap and is not labor-intensive. It requires access to human adipose tissue and the subcutaneous depot is suitable for sampling. For this protocol, fresh adipose tissue samples from morbidly obese subjects [body mass index (BMI) &#62;35] are collected during bariatric surgery procedures. Using a sequential immunoseparation from the stromal vascular fraction, enough cells are produced from as little as 2&#8211;3 g of fat. These cells can be expanded in culture over 10&#8211;14 days, can be cryopreserved, and retain their adipogenic properties with passaging up to passage 5&#8211;6. The cells are treated for 14 days with an adipogenic cocktail using a combination of human insulin and the PPAR&#947; agonist-rosiglitazone.
This methodology can be used for obtaining proof of concept experiments on molecular mechanisms that drive adipogenic responses in adipose endothelial cells, or for screening new drugs that can enhance the adipogenic response directed either towards white or beige/brown adipocyte differentiation. Using small subcutaneous biopsies, this methodology can be used to screen out non-responder subjects for clinical trials aimed to stimulate beige/brown and white adipocytes for the treatment of obesity and co-morbidities.

The differentiation of white and beige adipocytes from adipose tissue vascular progenitors bears potential for metabolic improvement in obesity. We describe protocols for a CD34+CD31+ endothelial cell isolation from human fat and for a subsequent in vitro expansion and differentiation into white and beige adipocytes. Several downstream applications are discussed.

Isolation, Expansion und Adipogenen Induktion von CD34 + CD31 + Endothelial Zellen aus menschlichen Omentalis und subkutanem Fettgewebe

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

Immunologie und Infektion

Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for the design of personalized microtissues for health screening and drug testing. Current strategies are often quite complex and fail to accurately fully depict the multicellular and functional properties of thermogenic adipose tissue. Microvascular fragments, small intact microvessels comprised of arteriole, venules, and capillaries isolated from adipose tissue, serve as a single autologous source of cells that enable vascularization and adipose tissue formation. This article describes methods for optimizing culture conditions to enable the generation of three-dimensional, vascularized, and functional thermogenic adipose tissues from microvascular fragments, including protocols for isolating microvascular fragments from adipose tissue and culture conditions. Additionally, best practices are discussed, as are techniques for characterizing the engineered tissues, and sample results from both rodent and human microvascular fragments are provided. This approach has the potential to be utilized for the understanding and development of treatments for obesity and metabolic disease.

Here, we present a detailed protocol outlining the use of microvascular fragments isolated from rodent or human fat tissue as a straightforward approach to engineer functional, vascularized beige adipose tissue.

Dreidimensionale Kultivierung von vaskularisiertem thermogenem Fettgewebe aus mikrovaskulären Fragmenten

Engineering thermogenic adipose tissue (e.g., beige or brown adipose tissues) has been investigated as a potential therapy for metabolic diseases or for ...

Biotechnik

Assessing Whole-Body Lipid-Handling Capacity in Mice

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a class of many different molecules with many pathways involved in their synthesis and metabolism. A starting point for evaluating lipid hemostasis for nutrition and obesity research is needed. This paper describes three easy and accessible methods that require little expertise or practice to master, and that can be adapted by most labs to screen for lipid-metabolism abnormalities in mice. These methods are (1) measuring several fasting serum lipid molecules using commercial kits (2) assaying for dietary lipid-handling capability through an oral intralipid tolerance test, and (3) evaluating the response to a pharmaceutical compound, CL 316,243, in mice. Together, these methods will provide a high-level overview of lipid handling capability in mice.

This paper provides three easy and accessible assays for assessing lipid metabolism in mice.

Beurteilung der Ganzkörper-Lipid-Handling-Kapazität bei Mäusen

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a ...

Differentiation and Imaging of Brown Adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice

Brown adipose tissue (BAT) is only present in mammals and has a thermogenic function. Brown adipocytes are characterized by a multilocular cytoplasm with multiple lipid droplets, a central nucleus, a high mitochondrial content, and the expression of uncoupling protein 1 (UCP1). BAT has been proposed as a potential therapeutic target for obesity and its associated metabolic disorders due to its ability to dissipate metabolic energy as heat. To investigate BAT function and regulation, brown adipocyte culturing is indispensable. The present protocol optimizes tissue processing and cell differentiation for culturing brown adipocytes from newborn mice. Additionally, procedures for the imaging of differentiated adipocytes with both confocal immunofluorescence and transmission electron microscopy are shown. In the brown adipocytes differentiated with the techniques described herein, the major defining features of classical BAT are preserved, including high UCP1 levels, increased mitochondrial mass, and very close physical contact between the lipid droplets and mitochondria, making this method a valuable tool for BAT studies.

Preadipocytes are isolated from the stromal vascular fraction of interscapular brown adipose tissue from newborn mice and differentiated into cells that accumulate lipid droplets, express molecular markers, and show the mitochondrial morphology of mature brown adipocytes. These cells are further analyzed by immunofluorescence and transmission electron microscopy.

Differenzierung und Bildgebung von braunen Adipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion des interscapularen Fettgewebes von neugeborenen Mäusen

Brown adipose tissue (BAT) is only present in mammals and has a thermogenic function. Brown adipocytes are characterized by a multilocular cytoplasm with ...

Biologie

Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro

Adipocytes store energy in the form of triglycerides in lipid droplets. This energy can be mobilized via lipolysis, where the fatty acid side chains are sequentially cleaved from the glycerol backbone, resulting in the release of free fatty acids and glycerol. Due to the low expression of glycerol kinase in white adipocytes, glycerol re-uptake rates are negligible, while fatty acid re-uptake is dictated by the fatty acid binding capacity of media components such as albumin. Both glycerol and fatty acid release into media can be quantified by colorimetric assays to determine the lipolytic rate. By measuring these factors at multiple time points, one can determine the linear rate of lipolysis with high confidence. Here, we provide a detailed protocol for the measurement of lipolysis in in vitro differentiated adipocytes and ex vivo adipose tissue from mice. This protocol may also be optimized for other preadipocyte cell lines or adipose tissue from other organisms; considerations and optimization parameters are discussed. This protocol is designed to be useful in determining and comparing the rate of adipocyte lipolysis between mouse models and treatments.

Measuring the Rate of Lipolysis in Ex Vivo Murine Adipose Tissue and Primary Preadipocytes Differentiated In Vitro

Triglyceride lipolysis in adipocytes is an important metabolic process resulting in the liberation of free fatty acids and glycerol. Here, we provide a detailed protocol to measure basal and stimulated lipolysis in adipocytes and ex vivo adipose tissue from mice.

Messung der Lipolyserate in ex vivo murinem Fettgewebe und primären Präadipozyten, die in vitro differenziert wurden

Adipocytes store energy in the form of triglycerides in lipid droplets. This energy can be mobilized via lipolysis, where the fatty acid side chains are ...

Halbautomatische Isolierung von weißem Fettgewebe der Maus

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their mechanisms. Immortalized white preadipocyte cell lines are publicly available and widely used. However, the emergence of beige adipocytes in white adipose tissue in response to external cues is difficult to recapitulate to the full extent using publicly available white adipocyte cell lines. Isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue is commonly executed to obtain primary preadipocytes and perform adipocyte differentiation. However, mincing and collagenase digestion of adipose tissue by hand can result in experimental variation and is prone to contamination. Here, we present a modified semi-automated protocol that utilizes a tissue dissociator for collagenase digestion to achieve easier isolation of the SVF, with the aim of reducing experimental variation, reducing contamination, and increasing reproducibility. The obtained preadipocytes and differentiated adipocytes can be used for functional and mechanistic analyses.

Autor im Rampenlicht: Halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion aus weißem Fettgewebe der Maus mit einem Gewebedissoziator  

This protocol describes the semi-automated isolation of the stromal vascular fraction (SVF) from murine adipose tissue to obtain preadipocytes and achieve adipocyte differentiation in vitro. Using a tissue dissociator for collagenase digestion reduces experimental variation and increases reproducibility.

Halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion aus murinem weißem Fettgewebe mit Hilfe eines Gewebedissoziators

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...

Messung der Basal- und Forskolin-stimulierten Lipolyse bei Inguinal Adipose Fat Pads

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Mechanismus der Regulierung der Adipocyte Zahlen in adulten Organismen durch Differenzierung und Apoptosis Homöostase

Eine Microphysiologic Plattform für menschliches Fett: weißen Fettgewebe eingeklemmt

Lokalisierung, Identifizierung und Exzision Murine Fettgewebe Depots

Isolation, Expansion und Adipogenen Induktion von CD34 + CD31 + Endothelial Zellen aus menschlichen Omentalis und subkutanem Fettgewebe

Dreidimensionale Kultivierung von vaskularisiertem thermogenem Fettgewebe aus mikrovaskulären Fragmenten

Beurteilung der Ganzkörper-Lipid-Handling-Kapazität bei Mäusen

Differenzierung und Bildgebung von braunen Adipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion des interscapularen Fettgewebes von neugeborenen Mäusen

Messung der Lipolyserate in ex vivo murinem Fettgewebe und primären Präadipozyten, die in vitro differenziert wurden

Halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion aus murinem weißem Fettgewebe mit Hilfe eines Gewebedissoziators

Halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion aus murinem weißem Fettgewebe mit Hilfe eines Gewebedissoziators