Name: detection of enterohemorrhagic escherichia coli colonization in murine host by non-invasive in vivo bioluminescence system
Uploaded: 2018-04-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System at JoVE.com

Wir erkennen Chi-Chung Chen von der Abteilung der medizinischen Forschung, Chi Mei Medical Center (Tainan, Taiwan) für die Hilfe bei der Maus Infektion und die Unterstützung durch das Labor Animal Center der National Cheng Kung University. Diese Arbeit wird unterstützt durch den Minister für Wissenschaft und Technologie (MOST) gewährt (die meisten 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006-011, and106-2321-B-006-005) CC.

Achtung: EHEC O157: H7 ist eine Sicherheitsstufe 2 (BSL-2) Erreger nach der Centers for Disease Control and Prevention (CDC) biologische Sicherheit Anweisung (https://www.cdc.gov/). Daher müssen alle experimentellen Verfahren, die EHEC in einem BSL-2 Anlage durchgeführt werden. Kittel und Handschuhe zu tragen, während der Durchführung des Experiments. Arbeiten Sie in einem zertifizierten Biosafety Kabinett (BSC). Desinfizieren Sie die experimentelle Bank vor und nach der Versuchsdurchführung mit 70 % Ethanol. Alle Instrumente oder Geräte, die mit 70 % Ethanol oder Bleichmittel Kontakt (oder potenziell Kontakt) EHEC desinfiziert werden sollte. Kontaminierte (oder verunreinigter) Abfälle sollte sorgfältig abgedichtet und autoklaviert. Tragen Sie eine Maske, Augenschutz, doppelte Handschuhe oder einen Overall, falls erforderlich. Die 6 Wochen alten C57BL/6 weibliche Mäuse waren gekauft und im Labor Animal Center der National Cheng Kung University (NCKU) gepflegt. Die Tierversuche wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss der NCKU (Zulassungsnummer 104-039) genehmigt.
1. Bioluciferase-Label EHEC-Bakterien-Generation
<ol><li>Mix 50 ng Desoxyribonukleinsäure (DNA), 1 μL von 10 μM weiterleiten und reverse Primer, 2 μl 2,5 mM Deoxynucleotides (dNTPs), 2 μl 10-fach Puffer, 0,2 μl DNA Polymerase und sterile bidestilliertem Wasser (DdH2O) zu einem Endvolumen von 20 μL verstärken die Anti-Kanamycin Kassette, NptII -gen24. Das DNA-Template ist von pBSL18024, das von der nationalen BioResource Projekt (NBRP) gekauft wird. Die PCR-Bedingungen sind in Tabelle 1 aufgeführt und die Grundierung-Sequenz ist in Tabelle 2zur Verfügung.</li>
	<li>Verbinden Sie die PCR-Produkte zu einem kommerziellen klonen Vektor nach Kit-Protokoll (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Das NptII -gen-Fragment aus dem Klonen Vektor Rentenantrag und SmaI Verbrauchsteuern und Klonen in pBBR1MCS4, die von den Rentenantrag und ScaI von pAKlux29 erstelle ich beständige Kanamycin Plasmid verdaut ist, pWF27813.</li>
	<li>Verbrauchssteuern LuxCDABE -Operon, aus der Luciferase mit dem Ausdruck Plasmid9, pAKlux2, von SpeI-HF und ScaI und Klon zu SpeI-HF und SmaI verdaut pWF278 Kanamycin generieren resistent und Luciferase Plasmid, pWF27913zum Ausdruck zu bringen. Hinweis: Für die Plasmid-Extraktionen und die ausgeschnittenen Fragment Reinigungen, verwenden Sie die kommerzielle Plasmid-Extraktion und das Gel Extraction Kit bzw.. Mischen Sie für die Enzym-Verdauung 100 ng DNA, 1 μl 10-fach Puffer, 1 μL jeder ausgewählten Restriktionsenzym und sterile DdH2O auf ein Gesamtvolumen von 10 μL und Inkubation bei 37 ° C für 2,5-3 h.</li>
	<li>Verwandeln Sie das Plasmid pWF279 in E. Coli O157: H7 EDL933 kompetente Zellen durch Elektroporation mit 2.500 V für 4 ms.</li>
	<li>Inkubieren Sie die transformierten Bakterienzellen in 1 mL Luria-Bertani (LB)-Medium bei 37 ° C für 1 h.</li>
	<li>Platte die Bakterien auf eine LB-Agar-Platte ergänzt mit 50 µg/mL Kanamycin bei 37 ° C für 16-18 h.</li>
	<li>Überprüfen Sie die biolumineszente Signal der Platte durch ein in-Vivo Bildgebung Maschine am nächsten Tag. Eine einzige Kolonie von der Platte nehmen und Kultur es in 3 mL LB ergänzt mit 50 µg/mL Kanamycin bei 37 ° C für 16-18 h.</li>
	<li>Bereiten Sie bakterielle Lager Medium durch Verdünnung 100 % Glycerin in sterilen DdH2O, die 30 % Glycerin-Lösung zu machen.</li>
	<li>Einfrieren Kanamycin-resistente E. Coli O157: H7 EDL933 Bakterien beherbergen die Luciferase-Plasmid als bakterielle Stock in eine Schraubkappe Cryoröhrchen als ein 1:1 Verhältnis von Bakterien-Kultur und 30 % Glycerin-Lösung bei-80 ° C. Die letztendliche Konzentration an Glycerin beträgt 15 %.</li>
</ol>(2) Biolumineszenz EHEC Bakterien Vorbereitung für orale Impfung
Hinweis: Die Timeline Flussdiagramm der experimentellen Verfahren für die EHEC-Vorbereitung und Maus orale Magensonde ist in Abbildung 1 experimentelle Vorbereitung unterstützen dargestellt.
<ol><li>Streak E. Coli O157: H7 EDL933 Bakterien beherbergen Luciferase Plasmid auf eine LB-Agar-Platte mit 50 µg/mL Kanamycin von-80 ° C Lager. Wachsen Sie die Bakterien für 16-18 h bei 37 ° C.</li>
	<li>Wählen Sie eine einzige Kolonie von der Übernachtung Platte und Kultur in 3 mL LB-Medium mit 50 µg/mL Kanamycin für 16-18 h in einem 37 ° C Inkubator bei 220 u/min.</li>
	<li>Subkultur der Bakterien (1: 100 Verdünnung) in Kanamycin (50 µg/mL) mit LB Brühe für 2,5-3 h in einem 37 ° C Inkubator bei 200 u/min. (Zum Beispiel fügen Sie 2 mL über Nacht Bakterien auf 200 mL LB-Medium mit Kanamycin (50 µg/mL) ergänzt kultiviert).</li>
	<li>Die Bakterien für 2,5-3 h Inkubation und Messung den optischen Dichte-Wert bei 600 nm (OD600) bis der Wert liegt zwischen 0,9 bis 1. Die Bakterienzelle Zahl liegt bei einer Dichte von etwa 108 Kolonie bildende Einheiten (KBE) / mL.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die neu gebildeten Bakterien bei 8.000 x g für 30 min, 4 ° C.</li>
	<li>Verwerfen Sie den überstand, ohne zu rühren das Pellet von Bakterien und waschen Sie das Pellet mit 100 mL 0,9 % sterile normale Kochsalzlösung durch sanfte Bewegung.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.5 und 2.6 einmal.</li>
	<li>Nach der Wäsche die Bakterienkultur bei 8.000 x g für 30 min, 4 ° C zentrifugiert und den überstand sanft entsorgen.</li>
	<li>Kondensat der Pellets bei 100-fold mit 0,9 % sterile normale Kochsalzlösung. Zum Beispiel, wenn 200 mL Bakterien zentrifugiert werden, fügen Sie 2 mL normale Kochsalzlösung um die Pellets zu unterbrechen.</li>
	<li>Bestätigen Sie die Bakterien KBE (es sollten etwa 109 CFU/100 μL nach Kondensation in normalen Kochsalzlösung sein) durch Ausplattieren konzentrierte Bakterien durch eine 10-divisibel serielle Verdünnung25.</li>
</ol>3. Maus orale Magensonde von EHEC
<ol><li>6 Wochen alten weibliche C57BL/6 Mäusen mit Streptomycin Wasser (5 g/L) für 24 h zu behandeln.</li>
	<li>Nach 24 h wechseln Sie zur regelmäßigen Trinkwasser für ein weiteres 24 h vor der Magensonde. Nach der Behandlung mit Wasser für 24 h, sind die Mäuse bereit für orale Magensonde von EHEC.</li>
	<li>Füllen Sie die Spritze mit 100 μL EHEC-Bakterien durch den Kolben zurückziehen. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in der Spritze sind. Entfernen Sie die Luftblasen durch Einrasten der Spritze mit den Fingern.</li>
	<li>Heben Sie das Tier vorsichtig und legen Sie es auf der Oberseite Käfig mit Sorgfalt.</li>
	<li>Die Maus am Schwanz sorgfältig zu erfassen, und das Tier wird oben auf den Käfig zu greifen und versuchen, sich zu bewegen.</li>
	<li>Sanft Zurückhalten der Maus durch das Greifen der losen Haut im Nacken und Rücken des Tieres mit Daumen und Zeigefinger zu verhindern, dass der Kopf der Maus verschieben.</li>
	<li>Halten Sie die Maus in vertikaler Position die Magensonde Nadel und sicherstellen, dass der Leiter der Maus immobilisiert und senkrecht ist.</li>
	<li>Nadel die Magensonde in die Maus Mund nach dem Dach des Mundes und nach unten in die Speiseröhre und den Magen.</li>
	<li>Wenn die eingefügte Nadel die Hälfte oder zwei Drittel Länge in der Maus ist, injizieren Sie 100 μL EHEC-Bakterien, die ungefähr 109 KBE Zellen enthalten.</li>
</ol>(4) Visualisierung
<ol><li>Erkennen Sie nach der oralen Magensonde die Biolumineszenz Signale auf 1 bis 2 Tage.</li>
	<li>Vor der Prüfung die Biolumineszenz Signale der Tiere, sie zu betäuben, indem man sie in eine Kammer mit 2,5 % Isofluran mit 1,5 L/min Sauerstoff.</li>
	<li>2-5 min. warten Sie, bis alle Mäuse bewusstlos und Anschlag bewegt werden. Tiere sind bereit für in Vivo Nachweis von Biolumineszenz.</li>
	<li>Erkennen und Bild Biolumineszenz Signale der Tiere durch ein in-Vivo imaging-System. Betrieb der Software finden Sie in Abschnitt 5 "Datenerfassung". Während den imaging-Prozess sind alle Tiere unter eine kontinuierliche Versorgung mit 2,5 % Isofluran mit 1,5 L/min Sauerstoff.<ol>
<li>Klicken Sie auf Datei > live und manuell fokussieren auf die Maus.</li>
		<li>Wählen Sie die Belichtung Zeit und Laser Intensität.</li>
		<li>Erwerben, klicken Sie auf > erfassen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Für die ex-Vivo Bildgebung einschläfern Sie die Mäuse durch zervikale Dislokation und entfernen Sie den gesamten Darm von infizierten Mäusen. Legen Sie den Darm in eine 9 cm Petrischale und Bild, durch das in-Vivo imaging-System. Die Einstellung ist identisch mit der in-Vivo imaging außer das Sichtfeld ist als A/B. Weitere Informationen finden Sie Abschnitt 5 "Datenerfassung". Hinweis: Methode für zervikale Dislokation: zurückhalten die Mäuse auf der Oberseite Käfig durch die Rute mit einer Hand greifen, damit die Tiere den Käfig greifen. Legen Sie einen Filzstift oder Daumen und Zeigefinger der anderen Hand gegen die Rückseite des Halses an der Basis des Schädels. Schnell mit der Hand oder das Objekt während der Ruhigstellung des Kopfes nach vorne schieben und mit der Hand die Rute nach hinten ziehen. Prüfen Sie genau, Atemstillstand und kein Herzschlag zu bestätigen.</li>
</ol>5. die Datenerfassung
Hinweis: Die Software für die Datenerfassung wird in der Tabelle der Materialienaufgeführt.
<ol><li>Für die Bildaufnahme die Systemsteuerung Erwerb der Software (Abbildung 2).</li>
	<li>Wählen Sie "leuchtende" "Fotografieren" und "Overlay".</li>
	<li>Eingestellten Belichtungszeit als "Auto". Legen Sie Binning als "Medium."</li>
	<li>Ƒ/Stopp 1 für leuchtende und 8 festgelegt für Foto. Ƒ/Stop steuert die Menge des Lichtes von der CCD-Detektor empfangen.</li>
	<li>Legen Sie das Sichtfeld, basierend auf dem Feld der Bilder, die von Interesse, zu erwerben. Option "D" kann passen fünf 6 Wochen alten Mäusen und Bild sie alle gleichzeitig. "C" kann drei 6 Wochen alten Mäusen in einem Feld Bild.</li>
	<li>Wenn die Mäuse/Proben für die Bildgebung fertig sind, klicken Sie auf "Acquire" für die Bildaufnahme.</li>
	<li>Öffnen Sie die Bilddaten, die erworben wurde.</li>
	<li>Öffnen Sie die Tool-Palette (Abbildung 3).</li>
	<li>Wählen Sie die ROI-Tools. Es wird empfohlen, den Kreis (die am weitesten links ein) reichen die biolumineszenten Bereich auf Bilder (Abbildung 4).</li>
	<li>Klicken Sie auf "Maßnahme ROIs" (Stift-Symbol) zur Messung der Biolumineszenz oberflächenintensität (Abbildung 3). Das ROI-Messungen-Panel und die Quantifizierung Werte angezeigt (Abbildung 5).</li>
	<li>Verwenden Sie die konfigurieren Messung in der linken Ecke des Fensters ROI Messungen die Werte/Informationen benötigt (Abbildung 6) auswählen, andernfalls klicken Sie auf "Exportieren", um diese Datentabelle exportieren und speichern als CSV-Datei (Abbildung 5).</li>
	<li>Verwenden Sie die Werte der Spalte "Gesamtfluss (p/s)" als die Biolumineszenz Intensität Quantifizierung in der CSV-Datei.</li>
</ol>

<ol>
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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrobacter+rodentium:+infection,+inflammation+and+the+microbiota.">Citrobacter rodentium: infection, inflammation and the microbiota.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (9), 612-623 (2014).</li><li>Mallick, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+murine+infection+model+for+Shiga+toxin-producing+Escherichia+coli.">A novel murine infection model for Shiga toxin-producing Escherichia coli.</a> J Clin Invest. 122 (11), 4012-4024 (2012).</li><li>Petty, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Citrobacter+rodentium+genome+sequence+reveals+convergent+evolution+with+human+pathogenic+Escherichia+coli.">The Citrobacter rodentium genome sequence reveals convergent evolution with human pathogenic Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 192 (2), 525-538 (2010).</li><li>Kovach, M. E., Elzer, P. H., Hill, D. S., Robertson , G. T., Farris, M. A., Roop, R. M., Peterson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+new+derivatives+of+the+broad-host-range+cloning+vector+pBBR1MCS,+carrying+different+antibiotic-resistance+cassettes.">Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes.</a> Gene. 166 (1), 175-176 (1995).</li><li>Galen, J. E., Nair, J., Wang , J. Y., Wasserman, S. S., Tanner, M. K., Sztein , M. B., Levine, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Plasmid+Maintenance+in+the+Attenuated+Live+Vector+Vaccine+Strain+Salmonella+typhiCVD+908-htrA.">Optimization of Plasmid Maintenance in the Attenuated Live Vector Vaccine Strain Salmonella typhiCVD 908-htrA.</a> Infect Immun. 67 (12), 6424-6433 (1999).</li><li>Francis, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+pneumococcal+infections+in+the+lungs+of+live+mice+using+bioluminescent+Streptococcus+pneumoniae+transformed+with+a+novel+gram-positive+lux+transposon.">Visualizing pneumococcal infections in the lungs of live mice using bioluminescent Streptococcus pneumoniae transformed with a novel gram-positive lux transposon.</a> Infect Immun. 69 (5), 3350-3358 (2001).</li><li>Goldwater, P. N., Bettelheim, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+(EHEC)+infection+and+hemolytic+uremic+syndrome+(HUS).">Treatment of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infection and hemolytic uremic syndrome (HUS).</a> BMC Med. 10, (2012).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Es wurde berichtet, dass EHEC mit Luciferase Plasmid transformiert verwendet worden ist, um seine Lokalisierung in Hosts oder Gen Ausdruck in Vivo8,11,12zu untersuchen. Das Mausmodell demonstriert hier berichtet auch das EHEC kolonisiert Timing und die Lokalisierung in murinen Host8erkennen. Dennoch bieten wir das Detail-Protokoll wie EHEC Impfung Mäuse intragastrically verwalten und wie sorgfä...

EHEC O157: H7 ist ein Erreger, der Durchfall1, HS2, HUS3und sogar Akutes Nierenversagen4 durch verunreinigtes Wasser oder Lebensmittel verursacht. EHEC ist eine pathogene Enterobacterium und besiedelt mit dem Magen-Darm-Trakt des Menschen1. Wenn EHEC zunächst halten an Host Darmepithel, Spritzen sie die Kolonisation Faktoren in Wirtszellen durch die Typ III-Sekretion System (T3SS), das Funktionen wie ein molekularer Spritze induzieren eine Befestigung und auszulöschen (A/E) Läsion anschließend zur Durchsetzung Adhäsion (Kolonisation)5. Diese Gene in A/E Läsion Bildung beteiligt sind durch den Ort der Enterozyten Auslöschung (LEE) Pathogenität Insel5kodiert.
Biolumineszenz ist eine Licht-produzierende chemische Reaktion in die Luciferase seine Substrat Luciferin zum sichtbaren Licht6generieren katalysiert. Dieser enzymatischen Prozess erfordert oft das Vorhandensein von Sauerstoff oder Adenosintriphosphat (ATP)6. Biolumineszenz imaging (BLI) erlaubt Forschern, die Visualisierung und die Quantisierung der Wirt-Pathogen Interaktionen in lebenden Tieren7. BLI kann bakterielle Infektionszyklus mit lebenden Tieren charakterisieren, indem Sie die folgenden biolumineszenten Bakterien, wie sie zu migrieren und dringen in verschiedenen Geweben7; Dies zeigt eine dynamische Weiterentwicklung der Infektion. Darüber hinaus bezieht sich die bakterielle Belastung bei Tieren auf die Biolumineszenz Signal8; So ist es ein bequemer Indikator, die pathologischen Zuständen von Versuchstieren in eine einfache und direkte Weise zu schätzen.
Das hier verwendete Plasmid enthaltenen Luciferase Operon, LuxCDABE, die aus dem Bakterium Photorhabdus Luminescens , die eine eigene Luciferase Substrat7,9kodiert. Durch die Umwandlung dieser Luciferase exprimierenden Plasmid in Bakterien, können die Kolonisation und Infektion Prozesse überwacht werden, durch die Beobachtung dieser biolumineszenten Bakterien mit lebenden Tieren. Insgesamt erlauben BLI und Biolumineszenz-Label Bakterien Forschern, überwachen die bakterielle Zahlen und Lage, bakterielle Lebensfähigkeit mit Antibiotika-Therapie Behandlung und bakterielle Genexpression in Infektion/Kolonisation6, 7. zahlreiche Pathogene Bakterien gemeldet wurden, äußern, die LuxCDABE -Operon, deren Infektion Zyklus und/oder Gen-Ausdruck in Infektion zu untersuchen. Diese Bakterien, einschließlich adhärent E. Coli10, EHEC8,11,12,13, enteropathogenic E. Coli (EPEC)8, Citrobacter Rodentium14,15, Salmonella Typhimurium16, Listeria Monocytogenes17, Yersinia Enterocolitica18,19, und Vibrio Cholerae20, dokumentiert wurden.
Einige experimentelle Modelle wurden entwickelt, um die Studie von EHEC Kolonisation in Vitro und in Vivo21,22,23zu erleichtern. Allerdings gibt es einen Mangel an geeigneten Tiermodellen, die EHEC Kolonisation in Vivozu studieren, und damit einen daraus resultierenden Mangel an Details. Um die Studie des EHEC Kolonisation Mechanismus in Vivozu erleichtern, ist es wertvoll, Tiermodellen zu beobachten und quantifizieren EHEC Besiedlung mit lebenden Tieren in eine nicht-invasive Methode zu bauen.
Dieses Manuskript beschreibt ein Maus-EHEC-Kolonisation-Modell, das eine Biolumineszenz mit dem Ausdruck ihrer System verwendet, um EHEC Kolonisation im Laufe der Zeit unter lebenden-Hosts zu überwachen. Mäuse sind intragastrically mit Biolumineszenz-Label EHEC beimpft und die biolumineszente Signal bei Mäusen mit einem nicht-invasive in Vivo imaging System13erkannt wird. Mäuse mit Biolumineszenz-Label EHEC zeigten signifikante Biolumineszenz Signale in ihrem Darm, nach 2 Tagen-Infektion, die vorgeschlagen Post, dass diese Bakterien im Darm Host kolonisiert, nach 2 Tagen-Infektion Post infiziert. Ex-Vivo Bilddaten zeigte, dass diese Kolonisierung speziell in den Blinddarm und Dickdarm von Mäusen. Mithilfe dieses Maus-EHEC-Modell kann die biolumineszente EHEC Kolonisierung erkannt werden im Leben Wirt durch ein in-Vivo imaging-System, um die detaillierten Mechanismen der magensaftresistenten Bakterien Kolonisation, zu untersuchen, die in weiteren Verständnis fördern kann EHEC-induzierte physiologische und pathologische Veränderungen.

<table><tbody><tr><td>Shaker incubator</td><td>YIH DER</td><td>LM-570R</td><td>bacteria incubation&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Orbital shaking incubator</td><td>FIRSTEK</td><td>S300</td><td>bacteria incubation&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>pBSL180</td><td></td><td></td><td>source of nptII gene</td></tr><tr><td>pAKlux2</td><td></td><td></td><td>source of luxCDABE operon</td></tr><tr><td>T&amp;amp;A Cloning Kit</td><td>Yeastern Biotech</td><td>FYC001-20P</td><td>use for TA cloning&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Nsi&lt;/em&gt; I</td><td>NEB</td><td>R0127S</td><td>use for plasmid cloning&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sca&lt;/em&gt; I</td><td>NEB</td><td>R0122S</td><td>use for plasmid cloning&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Spe&lt;/em&gt; I-HF</td><td>NEB</td><td>R0133S</td><td>use for plasmid cloning&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sma&lt;/em&gt; I&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>R0141S</td><td>use for plasmid cloning&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>T4 ligase</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td>use for plasmid cloning&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ex Taq</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>use for PCR amplification</td></tr><tr><td>10X Ex Taq Buffer</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>use for PCR amplification</td></tr><tr><td>dNTP Mixture&amp;nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>use for PCR amplification</td></tr><tr><td>PCR machine</td><td>applied Biosystem&amp;nbsp;</td><td>2720 thermal cycler&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;for PCR amplification</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>SIGMA</td><td>G5516-1L</td><td>use for bacteria stocking solution</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434-5KG-R</td><td>chemical for making LB medium, 10 g/L</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>CONDA pronadisa</td><td>Cat 1612.00</td><td>chemical for making LB medium, 10 g/L</td></tr><tr><td>Yeast Extract powder</td><td>Affymetrix</td><td>23547-1 KG</td><td>chemical for making LB medium, 5 g/L</td></tr><tr><td>Agar</td><td>CONDA pronadisa</td><td>Cat 1802.00</td><td>chemical for making LB agar</td></tr><tr><td>kanamycin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>K4000-5G</td><td>antibiotics, use for seleciton</td></tr><tr><td>streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S6501-100G</td><td>antibiotics, eliminate the microbiota in mice</td></tr><tr><td>EDL933 competent cell</td><td>Homemade</td><td></td><td>method is on supplemental document&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>MicroPulser</td><td></td><td>for electroporation</td></tr><tr><td>Electroporation Cuvettes</td><td>Gene Pulser/MicroPulser</td><td>1652086</td><td>for electroporation</td></tr><tr><td>High-speed centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti, J-26S XP</td><td>use for centrifuging bacteria&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fixed-Angle Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>JA25.5</td><td>use for centrifuging bacteria&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fixed-Angle Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>JLA10.5</td><td>use for centrifuging bacteria&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>centrifuge bottles</td><td>Beckman Coulter</td><td>REF357003</td><td>use for centrifuging bacteria&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>centrifuge bottles</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>3141-0500</td><td>use for centrifuging bacteria&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>eppendorf biophotometer plus&amp;nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>AG 22331 hamburg</td><td>for measuring the OD600 value of bacteria</td></tr><tr><td>C57BL/6 mice&amp;nbsp;</td><td>Laboratory Animal Center of NCKU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lab coat, gloves</td><td></td><td></td><td>for personnel protection&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>isoflurane&amp;nbsp;</td><td>Panion &amp;amp; BF Biotech Inc.</td><td>G-8669</td><td>for mice anesthesia, pharmaceutical grade</td></tr><tr><td>1ml syringe&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>use for oral gavage of mice</td></tr><tr><td>Reusable 22 G ball-tipped feeding needle</td><td></td><td>&amp;phi;0.9 mm X L 50 mm</td><td>use for oral gavage of mice</td></tr><tr><td>surgical&amp;nbsp; scissors&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>use for mice experiment</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS 200 imaging system</td><td>Perkin Elmer</td><td>IVIS spectrum</td><td>use for bioluminescent image capture&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Living Image Software</td><td>Perkin Elmer</td><td>version 4.1</td><td>use for quantifying the image data</td></tr></tbody></table>

detection of enterohemorrhagic escherichia coli colonization in murine host by non-invasive in vivo bioluminescence system

Enterohemorrhagic E. Coli (EHEC) O157: H7, das ist ein durch Lebensmittel übertragene Erreger, Causesdiarrhea, hämorrhagische Kolitis (HS) und Hämolytisch-Urämischen Syndrom (HUS), um den Darm-Trakt des Menschen besiedeln. Um detaillierte Mechanismus der EHEC Kolonisation in vivo Studie unbedingt Tiermodellen zu überwachen und zu quantifizieren, EHEC Besiedlung haben. Wir zeigen hier ein Maus-EHEC Kolonisation Modell durch die Umwandlung der biolumineszenten mit dem Ausdruck ihrer Plasmids, EHEC zu überwachen und zu quantifizieren EHEC Kolonisation in lebenden Gastgeber. Tiere mit Biolumineszenz-Label EHEC beimpft zeigen intensive Biolumineszenz Signale bei Mäusen durch Erkennung mit einem nicht-invasive in Vivo imaging-System. Nach 1 bis 2 Tage-Infektion Post, konnte Biolumineszenz Signale noch bei infizierten Tieren nachgewiesen werden, was darauf hindeutet, dass EHEC besiedeln in Gastgeber für mindestens 2 Tage. Wir zeigen auch, dass diese Biolumineszenz EHEC suchen, Maus Darm, speziell in den Blinddarm und Dickdarm, von Ex-Vivo -Bilder. Dieses Maus-EHEC Kolonisation Modell kann als ein Werkzeug, um das aktuelle Wissen des EHEC Kolonisation Mechanismus voraus dienen.

Wir mit der Bezeichnung der Biolumineszenz EHEC verabreicht (~ 109 Bakterienzellen), 6 - Wochen alten weiblichen C57BL/6 Mäusen durch orale Magensonde. Nach der mündlichen Inokulation von EHEC Mäusen innerhalb von 1 h wurden die Tiere auf Biolumineszenz Signal durch die in-Vivo imaging-System wie in Abbildung 7dargestellt untersucht. Die Ergebnisse zeigten ein starkes Signal der biolumineszentes Magensonde Mäuse mit EHEC Biolumineszenz...

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Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Ein detailliertes Protokoll von einem Maus-Modell für Enterohemorrhagic E. Coli (EHEC) Besiedlung durch mit Hilfe von Bakterien mit der Bezeichnung der Biolumineszenz wird vorgestellt. Die Erkennung dieser biolumineszenten Bakterien durch eine nicht-invasive in Vivo imaging-System mit lebenden Tieren kann unser gegenwärtige Verständnis der EHEC Besiedlung voraus.

Erkennung von Enterohemorrhagic Escherichia Coli Besiedlung in murinen Host durch nicht-invasive In Vivo Biolumineszenz-System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

detection-enterohemorrhagic-escherichia-coli-colonization-murine-host

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

9.4K Aufrufe.  National Cheng Kung University. Ein detailliertes Protokoll von einem Maus-Modell für Enterohemorrhagic E. Coli (EHEC) Besiedlung durch mit Hilfe von Bakterien mit der Bezeichnung der Biolumineszenz wird vorgestellt. Die Erkennung dieser biolumineszenten Bakterien durch eine nicht-invasive in Vivo imaging-System mit lebenden Tieren kann unser gegenwärtige Verständnis der EHEC Besiedlung voraus.

Serie: Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

Mit Luciferase to Image Bakterielle Infektionen bei Mäusen

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Forschung

Immunologie und Infektion

In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative medicine. However, direct injection of hESCs, and cells differentiated from hESCs, into living organisms has thus far been hampered by significant cell death, teratoma formation, and host immune rejection. Understanding the in vivo hESC behavior after transplantation requires novel imaging techniques to longitudinally monitor hESC localization, proliferation, and viability. Molecular imaging has given investigators a high-throughput, inexpensive, and sensitive means for tracking in vivo cell proliferation over days, weeks, and even months. This advancement has significantly increased the understanding of the spatio-temporal kinetics of hESC engraftment, proliferation, and teratoma-formation in living subjects.

A major advance in molecular imaging has been the extension of noninvasive reporter gene assays from molecular and cellular biology into in vivo multi-modality imaging platforms. These reporter genes, under control of engineered promoters and enhancers that take advantage of the host cell s transcriptional machinery, are introduced into cells using a variety of vector and non-vector methods. Once in the cell, reporter genes can be transcribed either constitutively or only under specific biological or cellular conditions, depending on the type of promoter used. Transcription and translation of reporter genes into bioactive proteins is then detected with sensitive, noninvasive instrumentation (e.g., CCD cameras) using signal-generating probes such as D-luciferin.

To avoid the need for excitatory light to track stem cells in vivo as is required for fluorescence imaging, bioluminescence reporter gene imaging systems require only an exogenously administered probe to induce light emission. Firefly luciferase, derived from the firefly Photinus pyralis, encodes an enzyme that catalyzes D-luciferin to the optically active metabolite, oxyluciferin. Optical activity can then be monitored with an external CCD camera. Stably transduced cells that carry the reporter construct within their chromosomal DNA will pass the reporter construct DNA to daughter cells, allowing for longitudinal monitoring of hESC survival and proliferation in vivo. Furthermore, because expression of the reporter gene product is required for signal generation, only viable parent and daughter cells will create bioluminescence signal; apoptotic or dead cells will not. 

In this video, the specific materials and methods needed for tracking stem cell proliferation and teratoma formation with bioluminescence imaging will be described.

With the growing interest in stem cell therapies, molecular imaging techniques are ideal for monitoring stem cell behavior after transplantation. Luciferase reporter genes have enabled non-invasive, repetitive assessment of cell survival, location, and proliferation in vivo. This video will demonstrate how to track hESC proliferation in a living mouse.

In vitro und in vivo Biolumineszenz Reporter Gene Imaging von humanen embryonalen Stammzellen

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative ...

Biologie

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite this similarity, these bacteria show extreme variations in characteristics like growth behavior, intensity of light emission or regulation of bioluminescence. The method presented here is a newly developed assay that combines recording of cell growth and bioluminescent light emission intensity over time utilizing a plate reader. The resulting growth and light emission characteristics can be linked to important features of the respective bacterial strain, such as quorum sensing regulation. The cultivation of a range of bioluminescent bacteria requires a specific medium (e.g., artificial sea water medium) and defined temperatures. The easy to handle, non-bioluminescent standard-research bacterium Escherichia coli (E. coli), on the other hand, can be cultivated inexpensively in high quantities in laboratory scale. Exploiting E. coli by introducing a plasmid containing the whole lux operon can simplify experimental conditions and additionally opens up many possibilities for future applications. The expression of all lux genes utilizing an E. coli expression strain was achieved by construction of an expression plasmid via Gibson cloning and insertion of four fragments containing seven lux genes and three rib genes of the lux-rib operon into a pET28a vector. E. coli based lux gene expression can be induced and controlled via Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG) addition resulting in bioluminescent E. coli cells. The advantages of this system are to avoid quorum sensing regulation restrictions and complex medium compositions along with non-standard growth conditions, such as defined temperatures. This system enables analysis of lux genes and their interplay, by the exclusion of the respective gene from the lux operon, or even addition of novel genes, exchanging the luxAB genes from one bacterial strain by another, or analyzing protein complexes, such as luxCDE.

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

Bioluminescent bacteria regulate light production through a variety of mechanisms, such as quorum sensing. This novel method allows the in situ investigation of bioluminescence and the correlation of light emission to cell density. An artificial bioluminescent Escherichia coli system allows the characterization of lux operons, Lux proteins, and their interplay.

In Situ Messung und Korrelation der Zelldichte und Lichtemission von Biolumineszenten Bakterien

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite ...

Biochemie

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of bacteria in gene and cell therapy for cancer. Bacteria present an attractive class of vector for cancer therapy, possessing a natural ability to grow preferentially within tumors following systemic administration. Bacteria engineered to express the lux gene cassette permit BLI detection of the bacteria and concurrently tumor sites. The location and levels of bacteria within tumors over time can be readily examined, visualized in two or three dimensions. The method is applicable to a wide range of bacterial species and tumor xenograft types. This article describes the protocol for analysis of bioluminescent bacteria within subcutaneous tumor bearing mice. Visualization of commensal bacteria in the Gastrointestinal tract (GIT) by BLI is also described. This powerful, and cheap, real-time imaging strategy represents an ideal method for the study of bacteria in vivo in the context of cancer research, in particular gene therapy, and infectious disease. This video outlines the procedure for studying lux-tagged E. coli in live mice, demonstrating the spatial and temporal readout achievable utilizing BLI with the IVIS system.

Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo

This article describes the administration of lux-tagged bacteria to mice and subsequent in vivo analysis using IVIS bioluminescence imaging.

Bioluminescent Bakterielle Imaging<em&gt; In Vivo</em

This video describes the use of whole body bioluminesce imaging (BLI) for the study of bacterial trafficking in live mice, with an emphasis on the use of ...

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by Russel and Burch in Hume's 3Rs (replacement, reduction, refinement), the utilization of animal models in scientific research is under constant pressure to identify new methodologies to reduce animal usage while improving scientific accuracy and speed. A major challenge to Hume's principals however, is how to ensure the studies are statistically accurate while reducing animal disease morbidity and overall numbers. Vaccine efficacy studies currently require a large number of animals in order to be considered statistically significant and often result in high morbidity and mortality endpoints for identification of immune protection. We utilized in vivo imaging systems (IVIS) in conjunction with a firefly bioluminescent enzyme to progressively track the invasion of the central nervous system (CNS) by an encephalitic virus in a murine model. Typically, the disease progresses relatively slowly, however virus replication is rapid, especially within the CNS, and can lead to an often, lethal outcome. Following intranasal infection of the mice with TC83-Luc, an attenuated Venezuelan equine encephalitis virus strain modified to expresses a luciferase gene; we are able to visualize virus replication within the brain at least three days before the development of clinical disease symptoms. Utilizing CNS invasion as a key encephalitic disease development endpoint we are able to quickly identify therapeutic and vaccine protection against TC83-Luc infection before clinical symptoms develop. With IVIS technology we are able to demonstrate the rapid and accurate testing of drug therapeutics and vaccines while reducing animal numbers and morbidity.

In Vivo Imaging Systems IVIS Detection of a Neuro-Invasive Encephalitic Virus

Utilizing luciferase and in vivo imaging systems (IVIS) as a novel means to identify disease endpoints before clinical developments occur. IVIS has allowed us to visualize in real time the invasion of encephalitic viruses over multiple days, providing a more accurate disease model for future study. It has also allowed us to identify the potential protective features of antivirals and vaccines faster than currently utilized animal models. The capability to utilize individual animals over multiple time points ensures reduced animal requirements, costs, and overall morbidity to the animals utilized ensuring a more humane and more scientific means of disease study.

In Vivo Imaging Systems (IVIS) Nachweis eines Neuro-Invasive encephalitische Virus

Modern advancements in imaging technology encourage further development and refinement in the way viral research is accomplished. Initially proposed by ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

This protocol outlines the steps required to longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging tomography with integrated &mu;CT (DLIT-&mu;CT) and the subsequent use of this data to generate a four dimensional (4D) movie of the infection cycle. To develop the 4D infection movies and to validate the DLIT-&mu;CT imaging for bacterial infection studies using an IVIS Spectrum CT, we used infection with bioluminescent C. rodentium, which causes self-limiting colitis in mice. In this protocol, we outline the infection of mice with bioluminescent C. rodentium and non-invasive monitoring of colonization by daily DLIT-&mu;CT imaging and bacterial enumeration from feces for 8 days.
The use of the IVIS Spectrum CT facilitates seamless co-registration of optical and &mu;CT scans using a single imaging platform. The low dose &mu;CT modality enables the imaging of mice at multiple time points during infection, providing detailed anatomical localization of bioluminescent bacterial foci in 3D without causing artifacts from the cumulative radiation. Importantly, the 4D movies of infected mice provide a powerful analytical tool to monitor bacterial colonization dynamics in vivo.

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Multi-modality imaging is a valuable approach for studying bacterial colonization in small animal models. This protocol outlines infection of mice with bioluminescent Citrobacter rodentium and the longitudinal monitoring of bacterial colonization using composite 3D diffuse light imaging tomography with &mu;CT imaging to create a 4D movie of C. rodentium infection.

4D Imaging von Multimodalität<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infektionen bei Mäusen

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Monitoring Breast Cancer Growth and Metastatic Colony Formation in Mice using Bioluminescence

Breast cancer is a frequent heterogeneous malignancy and the second leading cause of mortality in women, mainly due to distant organ metastasis. Several animal models have been generated, including the widely used orthotopic mouse models, where cancer cells are injected into the mammary fat pad. However, these models cannot help monitor tumor growth kinetics and metastatic colonization. Cutting-edge tools to monitor cancer cells in real time in mice will significantly advance the understanding of tumor biology. 
Here, breast cancer cell lines stably expressing luciferase and green fluorescent protein (GFP) were established. Specifically, this technique contains two sequential steps initiated by measuring the luciferase activity in vitro and followed by the implantation of the cancer cells into mammary fat pads of nonobese diabetic-severe combined immunodeficiency (NOD-SCID) mice. After the injection, both the tumor growth and metastatic colonization are monitored in real time by the noninvasive bioluminescence imaging system. Then, the quantification of GFP-expressing metastases in the lungs will be examined by fluorescence microscopy to validate the observed bioluminescence results. This sophisticated system combining luciferase and fluorescence-based detection tools evaluates cancer metastasis in vivo, which has great potential for use in breast cancer therapeutics and disease management.

Here, we describe a noninvasive monitoring method involving luciferase and green fluorescent protein expression in various breast cancer cell lines. This protocol provides a technique to monitor tumor formation and metastatic colonization in real time in mice.

Überwachung des Brustkrebswachstums und der metastasierenden Koloniebildung bei Mäusen mittels Biolumineszenz

Breast cancer is a frequent heterogeneous malignancy and the second leading cause of mortality in women, mainly due to distant organ metastasis. Several ...

Krebsforschung

Combined In vivo Optical and &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in vivo optical and &#956;CT imaging allow the visualization of biological phenomena in an anatomical context. These imaging modalities may be especially useful to study conditions that impact bone. In particular, orthopaedic implant infections are an important problem in clinical orthopaedic surgery. These infections are difficult to treat because bacterial biofilms form on the foreign surgically implanted materials, leading to persistent inflammation, osteomyelitis and eventual osteolysis of the bone surrounding the implant, which ultimately results in implant loosening and failure. Here, a mouse model of an infected orthopaedic prosthetic implant was used that involved the surgical placement of a Kirschner-wire implant into an intramedullary canal in the femur in such a way that the end of the implant extended into the knee joint. In this model, LysEGFP mice, a mouse strain that has EGFP-fluorescent neutrophils, were employed in conjunction with a bioluminescent Staphylococcus aureus strain, which naturally emits light. The bacteria were inoculated into the knee joints of the mice prior to closing the surgical site. In vivo bioluminescent and fluorescent imaging was used to quantify the bacterial burden and neutrophil inflammatory response, respectively. In addition, &#956;CT imaging was performed on the same mice so that the 3D location of the bioluminescent and fluorescent optical signals could be co-registered with the anatomical &#956;CT images. To quantify the changes in the bone over time, the outer bone volume of the distal femurs were measured at specific time points using a semi-automated contour based segmentation process. Taken together, the combination of in vivo bioluminescent/fluorescent imaging with &#956;CT imaging may be especially useful for the noninvasive monitoring of the infection, inflammatory response and anatomical changes in bone over time.

Combined In vivo Optical and  &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Combined optical and &#956;CT imaging in a mouse model of orthopaedic implant infection, utilizing a bioluminescent engineered strain of Staphylococcus aureus, provided the capability to noninvasively and longitudinally monitor the dynamics of the bacterial infection, as well as the corresponding inflammatory response and anatomical changes in the bone.

Kombiniert<em&gt; In-vivo-</em&gt; Optische und μCT Imaging-Infektion, Entzündung und Knochenanatomie in einem Orthopädie Implantat-Infektion in Mäuse Monitor

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in ...

Medizin

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a pET-SUMO-EGFP vector (SUMO = small ubiquitin-like modifier) and expressing enhanced green fluorescence protein (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). EGFP-expressing E. coli is coincubated with macrophages for 1 h at 37 &#176;C; the negative control group is incubated on ice for the same amount of time. Then, the macrophages are ready for assessment. The advantages of this technique include its simple and straightforward steps, and phagocytosis can be measured by both flow cytometer and fluorescence microscope. The EGFP-expressing E. coli are stable and display a strong fluorescence signal even after the macrophages are fixed with paraformaldehyde. This method is not only suitable for the assessment of macrophage cell lines or primary macrophages in vitro but also suitable for the evaluation of granulocyte and monocyte phagocytosis in peripheral blood mononuclear cells. The results show that the phagocytic capability of peritoneal macrophages from young (eight-week-old) mice is higher than that of macrophages from aged (16-month-old) mice. In summary, this method measures macrophage phagocytosis and is suitable for studying the innate immune system function.

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Here, we present a protocol to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis using enhanced green fluorescence protein-expressing Escherichia coli.

Mit grünen Fluoreszenz Protein exprimierenden verbessert Escherichia Coli Maus peritonealen Makrophagen Phagozytose bewerten

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice using Bioluminescence Imaging

Urinary tract infections (UTI) rank among the most common bacterial infections in humans and are routinely treated with empirical antibiotics. However, due to increasing microbial resistance, the efficacy of the most used antibiotics has declined. To find alternative treatment options, there is a great need for a better understanding of the UTI pathogenesis and the mechanisms that determine UTI susceptibility. In order to investigate this in an animal model, a reproducible, non-invasive assay to study the course of UTI is indispensable.
For years, the gold standard for the enumeration of bacterial load has been the determination of Colony Forming Units (CFU) for a particular sample volume. This technique requires post-mortem organ homogenates and serial dilutions, limiting data output and reproducibility. As an alternative, bioluminescence imaging (BLI) is gaining popularity to determine the bacterial load. Labeling pathogens with a lux operon allow for the sensitive detection and quantification in a non-invasive manner, thereby enabling longitudinal follow-up. So far, the adoption of BLI in UTI research remains limited.
This manuscript describes the practical implementation of BLI in a mouse urinary tract infection model. Here, a step-by-step guide for culturing bacteria, intravesical instillation and imaging is provided. The in vivo correlation with CFU is examined and a proof-of-concept is provided by comparing the bacterial load of untreated infected animals with antibiotic-treated animals. Furthermore, the advantages, limitations, and considerations specific to the implementation of BLI in an in vivo UTI model are discussed. The implementation of BLI in the UTI research field will greatly facilitate research on the pathogenesis of UTI and the discovery of new ways to prevent and treat UTI.

This manuscript describes the intravesical administration of uropathogenic bacteria with a lux operon to induce a urinary tract infection in mice and subsequent longitudinal in vivo analysis of the bacterial load using bioluminescence imaging.

Longitudinale Nachsorge von Harnwegsinfektionen und deren Behandlung bei Mäusen mittels Biolumineszenz-Bildgebung

Urinary tract infections (UTI) rank among the most common bacterial infections in humans and are routinely treated with empirical antibiotics. However, ...

Erkennung von Enterohemorrhagic Escherichia Coli Besiedlung in murinen Host durch nicht-invasive In Vivo Biolumineszenz-System

Zusammenfassung

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