Name: quantifying human monocyte chemotaxis in vitro and murine lymphocyte trafficking in vivo
Uploaded: 2017-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
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Diese Arbeit wurde von Bernard L. Schwartz Programm für Arzt-Wissenschaftler an der Rockefeller University, des therapeutischen Entwicklungsfonds Robertson an der Rockefeller University und die Sackler Center für Biomedizin und Ernährungsforschung an unterstützt die Rockefeller Universität.

alle Verfahren wurden von der Rockefeller University angenommen &#39; s institutionelle Animal Care und Use Committee. Alle Tiere unter bestimmten Pathogen-freies Bedingungen untergebracht waren.
 1. Chemotaxis In vitro- <ol><li>Kultur THP-1 Zellen 6 Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 4-(2-Hydroxyethyl)-1- Piperazineethanesulfonic Säure (HEPES; 25 mM) (komplett Media), Aufrechterhaltung der Dichte zwischen 0,5-1,0 x 10 6 Zellen/mL.</li>
	<li>In ein 35-mm-Zellkultur dish, Label 3,5 x 10 5 THP-1 Zellen pro Zustand mit Calcein Acetoxymethyl (Calcein-AM; 2,5 µM) oder anderen geeigneten Fluoreszenzfarbstoff in komplette Medien bei 37 ° C für 30 min. 
	Hinweis: Farbstoffe müssen Zellmembran durchlässig und mit live-Zelle Kennzeichnung kompatibel sein.</li>
	<li>Pre-warme Platte Leser, 37 ° c 
	Hinweis: Neben der Temperaturregelung ist unten-Lesung Funktionalität auch erforderlich. Siehe Schritt 1.10.2 nach einer Alternative zu einer Platte Leser für die Quantifizierung der Migration Zellen.</li>
	<li>Während Zellen bezeichnen, Vorbereiten der Assay-Platte und Unterhaus.
	<ol><li>Verwendung einer 24-Well-Zellkultur-Platte, mit einer Bedingung pro Bohrloch. Führen Sie jede Bedingung in dreifacher Ausfertigung.</li>
		<li>Fügen Sie 750 µL Hank &#39; s Buffered Salzlösung (HBSS) gepuffert mit 25 mM HEPES und 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA), die 24-Well-Platte. Dies dient als der basalen Kontrollbedingung.
		<ol><li>Andere Brunnen für Komparator Bedingungen, immer die Aufrechterhaltung der Gesamtmenge in der unteren Kammer bei 750 µL. 
			Hinweis: In diesem Beispiel dient menschliche Monocyte Lockstoffgradient Protein-1 (MCP-1) als Positivkontrolle für Chemotaxis- 7.
			<ol><li>Montieren die Reagenz Mischung kombiniert HBSS mit 25 mM HEPES, BSA (0,1 %) und MCP-1 (75 ng/mL). Verwenden Sie Erwachsene bovine Serum (2,7 % V / V) mit MCP-1 als eine zusätzliche Positivkontrolle. 
				Hinweis: Chemokin und Chemokin-Konzentration hängt von der chemotaktische Achse unter Studie. Lyophilisierter MCP-1 ist in destilliertem Wasser mit BSA (0,1 %) zu einer Stammlösung mit einer Endkonzentration von 50 μg/mL Nukleinsäuretablette. Dies kann in Wasser, um eine funktionierende Lösung von 10 μg/mL verdünnt werden. Die untere Kammer 5,6 μL dieser Lösung hinzufügen.</li>
			</ol></li></ol></li> <li>Nach der Besetzung der unteren Kammern abgeschlossen ist, legen Sie einen poröse Einsatz in jede Vertiefung, um sicherzustellen, dass die Registerkarten des Einsatzes mit den Kerben der Platte ausrichten. 
		Hinweis: Wählen Sie die geeignete Porengröße für die Einsätze. Für Monozyten und Lymphozyten schneidet gut ab eine Porengröße von 3 μm. Einige Zelltypen und/oder Chemokin-Systeme erfordern eine Matrix-beschichtete Oberfläche für optimale Migration. Zum Beispiel sind für die Messung von THP-1 Monocyte Chemotaxis in Richtung MCP-1, Fibronektin oder Kollagen beschichtet Einsätze empfohlen. Für Platte Leser für Quantifizierung, muss der Einsatz eine Licht-impermeant Beschichtung, wie Polyethylenterephthalat, zur Erkennung von nicht-Migration zu verhindern Zellen in der oberen Kammer 8.</li>
	</ol></li> <li>Nach Inkubation für 30 min mit Calcein-AM Zellen, Zellsuspension auf eine 15mL konische Rohr übertragen. Zentrifuge Zellen bei 1.000 x g für 2 min. Sichtprüfung Zellen zur Bestätigung der Aufnahme von Calcein-AM ( Abbildung 1).</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Vakuum-Sauger. Waschen Sie die markierte Zellen in serumfreien RPMI 1640 mit HEPES 25 mM ergänzt. Zellen bei 1.000 x g für 2 min Zentrifugieren und entsorgen des Überstands.</li>
	<li>Aufschwemmen Zellen in serumfreien RPMI 1640 mit HEPES 25 mM ergänzt. Zählen von Zellen und stellen Sie die Lautstärke so, dass die Zellen eine Endkonzentration von 1,0-1,5 x 10 6 Zellen/mL werden.</li>
	<li>Verzichten 250 μl Zellsuspension in die Einlage (Oberhaus).</li>
	<li>, Nachdem alle oberen Kammern gefüllt wurden, sanft heben Sie die Platte und inspizieren die Unterseite für das Vorhandensein von Luftblasen, die Migration und Erkennung stören können. Um eine Blase zu entfernen, versuchen Sie zunächst entfernen, dann Re-Positionierung des Einsatzes. Wenn erfolglos, verwenden Sie eine 27 G Nadel zu punktieren die Blase und dann den Einsatz neu zu positionieren.</li>
	<li>Legen Sie die Platte in den vorgewärmten 37 ° C Platte Leser.
	<ol><li>Acquire Fluoreszenz Lesungen von unten in 1-3 min Abständen. Bei der Verwendung von Calcein-AM festgesetzt der Fluoreszenz Emission und Erregung Wellenlängen 485 nm und 520 nm, beziehungsweise. Je nach Zelle Art und Chemokin Chemotaxis tritt in der Regel über 1-4 h ( Abbildung 2A).</li>
		<li>Als Alternative zur kontinuierlichen Messungen mit einem Teller-Reader, Bild der Brunnen mit einem inversen fluoreszierende Mikroskop ( Abb. 2 b) in der Lage, der Erregung und Detektion von Licht bei 485 nm und 520 nm, beziehungsweise. Verwenden einer niedrigen Vergrößerung, um die Mehrheit an der Unterseite des Einsatzes zu erfassen. Quantifizieren der Zellen durch die Verarbeitung der Bilder mit ImageJ oder ähnliche Software 9.</li>
	</ol></li></ol> 2. Adoptiveltern übertragen der murinen Lymphozyten <ol><li>Vorbereitung der Spenderzellen <ol><li>Anesthetize 8-12 Woche-alten C57BL/6J männliche Spender Mäuse mit Isofluran-Narkose (1-3 %) Verwendung eines Verdampfers. Angemessene Tiefe der Narkose durch Zehe-Prise bestätigen.</li>
		<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in die Rückenlage. Machen Sie eine Mittellinie Inzision mit einem Skalpell und suchen Sie die Milz in der oberen linken peritonealen Raum. Verbrauchssteuern Sie die ganze Milz und in komplette Medien (RPMI ergänzt mit 10 % FBS und 25 mM HEPES; 1 mL/Milz) auf Eis. Narkotisierten Spendertiere durch Enthauptung einschläfern.</li>
		<li>Mahlen Milz Gewebe sanft durch 40 µm-Nylon-Netzgewebe in komplette Medien (1 mL /spleen) mit dem Ende des einen Spritzenkolben eine 15 mL konische Rohr eine einzellige Federung und Transfer vorzunehmen.</li>
		<li>Fügen Sie 4 Bände von Ammoniumchlorid Kalium (ACK) Lyse Puffern und inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur, Erythrozyten zu lysieren.</li>
		<li>Der Zellen bei 1.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur Zentrifugieren und überstand verwerfen. Wenn Erythrozyten im Pellet bleiben, Aufschwemmen im ACK Lyse Puffer, 5 min bei Raumtemperatur inkubieren, Zentrifugieren Zellen bei 1.000 x g für 2 min und überstand verwerfen.</li>
		<li>Aufschwemmen der Zellen in komplette Medien in einer Konzentration von 2-5 x 10 7 Zellen/mL, dann abgießen die Zellsuspension durch eine 40 µm-Nylon-Netzgewebe, Zelle Ablagerungen zu entfernen.</li>
		<li>Etikett 1 x 10 7 Zellen/Empfänger Maus mit einem Fluoreszenzfarbstoff kompatibel mit Leben Zellen und bei der anschließenden Fixierung, wie z. B. 5-Chloromethylfluorescein Diacetat (Endkonzentration 2 μM) 10 einbehalten . Inkubation bei 37 ° C für 30 min. 
		Hinweis: Um mehr als eine Zellenbevölkerung zu verfolgen, verwenden Sie andere Fluoreszenzfarbstoffe mit zusätzlichen Zellpopulationen. Zum Beispiel kann ein Teil der Spenderzellen mit 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) Benzoyl gelabelt) amino) Tetramethylrhodamine (Endkonzentration 2 μM) 11.</li>
		<li>Fügen Sie 4 Bände mit HBSS ergänzt 25 mM HEPES, dann Zentrifuge bei 1.000 x g für 2 min und überstand verwerfen. Aufschwemmen Sie Pellet in HBSS ergänzt mit HEPES 25 mM, eine Endkonzentration von 1 x 10 8 Zellen/mL.
		<ol><li>Wenn mehr als ein Fluoreszenzfarbstoff zu verwenden, halten Sie Zell-Populationen bis unmittelbar vor der Injektion getrennt.</li>
			<li>Eine kleine aliquoten (10 μl) der Zellen von jeder Farbe auf eine Fixativ Lösung (1 mL) für spätere Flow Cytometry Entschädigung übertragen.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Übertragung von Lymphozyten <ol><li>8-12 Wochen zu betäuben-alte C57BL/6J männliche Empfänger Mäuse mit Isofluran (1-3 %) Verwendung eines Verdampfers; Tiefe der Narkose durch Zehe-Prise bestätigen. Tier Tierarzt Salbe zuweisen &#39; s Augen austrocknen zu verhindern.</li>
		<li>Kurz Wirbel Spenderzellen (1 s) und Transfer zum 1 mL Injektionsspritze mit 27 G, 0,5 in Nadel, differentiell beschrifteten Zellpopulationen zu kombinieren, wenn anwendbar.
		<ol><li>Eine kleine aliquoten (10 μl) gemischte Zellen auf einem Fixativ Lösung (1 mL) für spätere Flow Cytometry Analysen übertragen.</li>
		</ol></li> <li>Spendertiere in Bauchlage zu platzieren. Milde kaudalen Druck auf die Haut dorsalen für das Auge, verursacht den Augapfel leicht hervorstehen.</li>
		<li>Direkt die Nadel medial und 100 µL Zellsuspension Spender Retro-Orbital in jeder Empfänger Maus injizieren. Zellen können auch über die Rute Vene injiziert werden.</li>
		<li>Allmählich zurückziehen die Injektionsnadel und Maus allein in einem Recovery-Käfig. Tier zu überwachen, bis er das Bewusstsein wiedererlangt hat; einmal vollständig wiederhergestellten Rückkehr des Tieres zu Sozialwohnungen.</li>
	</ol></li> <li>Sammlung und Analyse <ol><li>nach 1 h, Empfänger Mäuse mit Isofluran-Narkose (1-3 %) mit einem Vaporizer zu betäuben, Tiefe der Narkose durch Zehe-Prise bestätigen. Die Milz (oder anderes Gewebe von Interesse) zu ernten (Schritt 2.1.2.) von jedem Empfänger Maus und Ort in die komplette Medien (1 mL/Empfänger). Narkotisierten Tieren durch Enthauptung einschläfern. 
		Hinweis: Längere Intervalle vor der Ernte Gewebe erhöht Gewebe Akkumulation durch mindestens 24 Std.</li>
		<li>Mahlen Milz Gewebe sanft durch 40 µm-Nylon-Netzgewebe in komplette Medien mit dem Ende des einen Spritzenkolben 15 mL konische Rohr eine einzellige Federung und Transfer vorzunehmen.</li>
		<li>Fügen Sie 4 Bände der ACK Lyse Puffer und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifugieren die Zellsuspension bei 1.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur und überstand verwerfen.</li>
		<li>Aufschwemmen Zellen in der Färbung Puffer (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung ergänzt mit 1 % FBS). Zellen zu zählen und auf eine Endkonzentration von 3 x 10 7 Zellen/mL einstellen. 100 µL Zellsuspension auf einer 96-Well Runde Bodenplatte übertragen.</li>
		<li>Fleck Zellen für gewünschte Markern (siehe Tabelle Material) für die Analyse von Durchflusszytometrie. Fluorophor-konjugierten Antikörpern (siehe die Tabelle Materialien) gegen die gewünschten Markierungen hinzufügen und bei 4 ° C für 20 Minuten im Dunkeln inkubieren. Hinzufügen von 100 µL Puffer Färbung, Zellen bei 1.000 x g für 3 min Zentrifugieren und entsorgen des Überstands.</li>
		<li>Aufschwemmen das Pellet in 200 µL Puffer Färbung, Zellen bei 1.000 x g für 3 min Zentrifugieren und entsorgen des Überstands.</li>
		<li>Das Pellet in 125 µL Färbung Aufschwemmen Puffern und Proben mit einem Durchflusszytometer mit Standardverfahren zu erwerben. 
		Hinweis: Der grüne Farbstoff ist begeistert von einem 488 nm Laser und die Emission mit 505 und 530/30 dichroitische Filter erkannt wird. Die orange Farbe ist begeistert durch eine 561 nm und die Emission von 582/15 dichroitische Filter erfasst wird.
		<ol><li>Verwendung gespeichert Zellen aus 2.1.8.2 Ausgleich für jede Fluoreszenzfarbstoff. 
			Hinweis: Mit Wulst-Vergütung mit Fluorophore passend zur Erregung und Emissionsspektren der Kennzeichnung Farbstoffe in suboptimalen Entschädigung führen wird.</li>
			<li>Verwenden die gespeicherten Eingabezellen aus Schritt 2.2.2.1 genau zu bestimmen, das Verhältnis von differentiell Eingabezellen beschriftet, wenn mehr als eine beschriftete Bevölkerung ( Abbildung 3). Berechnen Gewebe spezifische Migration basierend auf dem Verhältnis von beschriftet, unbeschriftete Zellen ( Abbildung 4).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+chemokine+receptors:+positioning+cells+for+host+defense+and+immunity.">Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity.</a> Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li><li>Ponda, M. P., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+stimulation+of+CCR7+chemotaxis+due+to+coagulation+factor+XIIa-dependent+production+of+high-molecular-weight+kininogen+domain+5.">Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boyden+chamber+assay.">Boyden chamber assay.</a> Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).</li><li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li><li>Leonard, E. J., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+monocyte+chemoattractant+protein-1+(MCP-1).">Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1).</a> Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).</li><li>Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+fluorescence+based+assay+of+neurite+formation.">An automated fluorescence based assay of neurite formation.</a> J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+cell+cycle-dependent+changes+in+cell+thiol+level+by+combining+a+new+laser+dye+with+Hoechst+33342.">Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342.</a> Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).</li><li>West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+fixation+of+thiol-reactive+fluorescent+cytoplasmic+probes+for+tracking+cell+migration.">Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration.</a> J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).</li><li>Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+greater+chemotactic+network+for+lymphocyte+trafficking:+chemokines+and+beyond.">The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond.</a> Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben

Quantifizierung der Immunzelle Migration kann erreicht werden, mit einfachen und schnellen Tests in Vitro und in Vivo. Wir zeigen die in Vitro Chemotaxis von menschlichen Monozyten als Reaktion auf eine MCP-1 Steigung und Vermehrung von Serum. In Vivo, Spender murinen Splenocyten waren differentiell beschriftet und anschließend Adoptiveltern waren Empfänger Tiere erholt.
Mit einem Teller-Reader hat den Vorteil, mehrere Zeit Probenahmestellen (so oft wie al...

Robuste Immunität erfordert die komplexe zeitliche und räumliche Koordination einer Vielzahl von Zelltypen, um entsprechend reagieren auf eine Verletzung, Infektion und Selbsttoleranz erzeugen. Mehrere Dutzend Chemokin-Rezeptoren und ihrer entsprechenden Liganden wurden entdeckt und charakterisierte die molekulare Mechanismen durch den spezifischen Zellen können zu einem bestimmten Zeitpunkt in einem bestimmten Gewebe geleitet werden. Studium Chemotaxis und Migration ist somit ein unverzichtbarer Bestandteil der Immunologie Forschung. In der Tat wurde der beschriebenen in-vitro- Test vor kurzem als Screening-Instrument zur chemotaktische Cofaktor zu identifizieren, die Chemotaxis von T-Zellen in Richtung C-C Chemokine 19 und 213beschleunigt. Der Zweck der hier beschriebenen Methoden sind quantitative Bewertungen der Immunzelle Chemotaxis in Vitro und in Vivozu ermöglichen.
Die Boyden (Zelle Migration und Invasion) Kammer-Assay ist eine kostengünstige, reproduzierbare und schnelle Methode für die Bewertung der Zelle Migration4,5. In der standard-Assay die obere Kammer ist mit Zellen ausgesät, und ist durch eine poröse Einlage aus einem unteren Kammer, in die die Zellen Wandern getrennt. Zum gewünschten Zeitpunkt können Zellen, die an der Unterseite des Einsatzes migriert wurden behoben und gebeizt für Quantifizierung von Lichtmikroskopie. Jedoch solche Messungen Datenerhebung auf einer einzigen Endpunkt, der dynamische Datenerfassung schließt zu beschränken und können erfordern umfangreiche Optimierung den optimale Zeitpunkt für die Analyse zu bestimmen. Hier werden verschiedene Anpassungen beschrieben, die in Echtzeit, quantitative und Multiplex Messungen der Chemotaxis in Vitrozu ermöglichen.
Für in Vivo Studien ist ein funktionelle Endpunkt verwendet, nämlich die spezifischen Anhäufung von Zellen in einem bestimmten Gewebe-Fach. Bereits beschriftete Spenderzellen werden in Empfänger Tiere durch Adoptiveltern Transfer eingeführt. Diese Spenderzellen können anschließend durch Durchflusszytometrie nach Empfänger Gewebe Ernte identifiziert werden. Auch ist eine Co Kennzeichnung Strategie, die für die Bestimmung des Handels mit verschiedenen Zelltypen innerhalb einer einzigen Empfänger Tier erlaubt. Diese Methode beseitigt die Inter Tiere Variation aus Zelle Injektion und Konten für physiologische Variabilität zwischen Tier.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture flask</td><td>Corning</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1430</td><td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td></tr><tr><td>Cell culture dish</td><td>Corning</td><td>1007</td><td></td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>Corning</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroblok Fibronectin Insert</td><td>Corning</td><td>CB354597</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9998S</td><td></td></tr><tr><td>Human Recombinant MCP-1</td><td>Peprotech</td><td>300-04</td><td></td></tr><tr><td>Adult bovine Serum</td><td>Sigma</td><td>B9433</td><td></td></tr><tr><td>HBSS with calcium and magnesium; no phenol red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M2e plate reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX71 inverted fluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein animal health</td><td>11695-6776-2</td><td>Isofluorane anesthesia</td></tr><tr><td>Cell strainer 40um nylon</td><td>Falcon Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysing buffer</td><td>Quality Biological</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Orange CMTMR Dye</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2927</td><td>Excitation: 541nm, Emission: 565nm</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA Dye</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2925</td><td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td></tr><tr><td>5ml syringe</td><td>BD Syringe</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>1ml TB syringe</td><td>BD Syringe</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 cell line</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>100228</td><td>Excitation: 405nm, Emission: 421nm</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>115540</td><td>Excitation: 405nm, Emission: 603nm</td></tr><tr><td>96-well round bottom plate</td><td>Corning</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>LSRII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Flow cytometer</td></tr></tbody></table>

quantifying human monocyte chemotaxis in vitro and murine lymphocyte trafficking in vivo

Chemotaxis ist die Migration auf eine spezifische chemische Gradienten1. Chemokine sind chemotaktische Zytokine, die Förderung der zellulären Menschenhandel mit anatomischen und zeitlichen Spezifität2. Chemotaxis ist eine kritische Funktion von Lymphozyten und anderen Immunzellen, die quantitativ bewertet in Vitro. Dieses Manuskript beschreibt Methoden, die die Beurteilung der Chemotaxis, erlauben sowohl in Vitro und in Vivo, für unterschiedliche Zelltypen, einschließlich Zell-Linien und native Zellen. Die in-vitro-, Platte-basiertes Format ermöglicht den Vergleich von mehreren Bedingungen gleichzeitig in Echtzeit und können innerhalb von 1-4 h. In Vitro Assay Bedingungen manipuliert werden, vorzustellen, Agonisten und Antagonisten, wie erfolgen sowie unterscheiden Sie Chemotaxis von Chemokinese, ist die zufällige Bewegung. Für in Vivo Menschenhandel Bewertungen können für Adoptiveltern übertragen Immunzellen mit mehreren Fluoreszenzfarbstoffen markiert und verwendet werden. Die unterschiedliche Kennzeichnung von Zellen ermöglicht gemischte Zellpopulationen im selben Tier, dadurch abnehmende Varianz und Reduzierung der Anzahl der Tiere für ein angemessen angetriebene Experiment eingefügt werden soll. Migration in lymphatischen Gewebe tritt in weniger als 1 h, und mehrere Gewebe Fächer können Sie probieren. Durchflusszytometrie Gewebe Ernte folgt ermöglicht eine schnelle und quantitative Analyse der wandernden Muster aus mehreren Zelltypen.

Bei der Verwendung von Calcein-AM Farbstoff bestätigen Sichtprüfung der Zellen Label Aufnahme (Abbildung 1). Automatisierte fluoreszierende Lesungen werden Migration als Zellen Transit auf der Unterseite des Einsatzes im Laufe der Zeit verfolgen. Diese Daten zeigen eindeutig eine Induktion der Zellwanderung in Richtung MCP-1 sowie eine Aufwertung dieser Reaktion durch Serum (Abbildung 2A). Je nach Stärke des wandernden Stimulu...

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Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Quantifizierung der menschliche Monocyte Chemotaxis In Vitro und murinen Lymphozyten Menschenhandel In Vivo

Protokolle für die quantitative Bewertung der Lymphozyten Chemotaxis und Migration sind wichtige Werkzeuge für die Immunologie Forschung. Hier wird eine in-vitro- Protokoll beschrieben, dass Genehmigungen in Echtzeit, Multiplex, Bewertung von Zellwanderung sowie eine ergänzende in Vivo Technik ermöglicht Tracking von native Zellen Milz.

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

7.1K Aufrufe.  The Rockefeller University. Protokolle für die quantitative Bewertung der Lymphozyten Chemotaxis und Migration sind wichtige Werkzeuge für die Immunologie Forschung. Hier wird eine in-vitro- Protokoll beschrieben, dass Genehmigungen in Echtzeit, Multiplex, Bewertung von Zellwanderung sowie eine ergänzende in Vivo Technik ermöglicht Tracking von native Zellen Milz.

Serie: Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Menschliche T-Lymphozyten-Isolierung, Kultur und Analyse der Migration In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the transmigration of innate immune monocytes to inflammatory sites of deposited lipid called fatty streaks, which are present in arterial walls of medium to large arteries. The key pathogenic feature of lesions at this early stage of atherosclerosis is the maturation of monocytes which migrate into arteries to form foam cells or lipid-laden macrophages. Considerable evidence supports the hypothesis that risk of atherosclerosis is increased by chronic inflammatory conditions accompanying diseases such as rheumatoid arthritis and HIV, as well as general ageing, and that this risk is predicted by monocyte activation. While mouse models provide a good platform to investigate the role of monocytes in atherogenesis in vivo, they require genetic alteration of natural cholesterol metabolism and drastic alteration of normal mouse diets, and have limited suitability for the study of atherogenic influences of human comorbid diseases. This motivated us to develop a human in vitro model to measure the atherogenic potential of monocytes isolated from individuals with defined disease states. Currently, human in vitro models are limiting in that they evaluate monocyte transmigration and foam cell formation in isolation. Here we describe a protocol in which monocytes isolated from patient blood transmigrate across human endothelial cells into a type 1 collagen matrix, and their propensity to mature into foam cells in the presence or absence of exogenous lipid is measured. The protocol has been validated for the use of human monocytes purified from individuals with HIV infection and elderly HIV uninfected individuals. This model is versatile and allows monocyte transmigration and foam cell formation to be evaluated using either microscopy or flow cytometry as well as allowing the assessment of atherogenic factors present in serum or plasma.

We describe a protocol to measure transmigration by monocytes across human endothelial monolayers and their subsequent maturation into foam cells. This provides a versatile method to assess the atherogenic properties of monocytes isolated from people with different disease conditions and to evaluate factors in blood which may enhance this propensity.

Quantifizierung der Monocyte Seelenwanderung und Schaumbildung Zelle von Personen mit chronischen entzündlichen Erkrankungen

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

Laminar-Flow-based Assays, Rekrutierung von Leukozyten auf kultivierten vaskuläre Zellen und adhärenten Thrombozyten zu untersuchen

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

Gleichzeitige Untersuchung der Rekrutierung von Monocyte Subpopulationen unter Strömung In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of monocyte-derived macrophages can impair wound healing. We showed that high fat and high sugar diets promote monocyte priming and dysfunction, converting healthy blood monocytes into a hyper chemotactic phenotype poised to differentiate into macrophages with dysregulated activation profiles and impaired phenotypic plasticity. The over-recruitment of monocyte-derived macrophages and recruitment of macrophages with dysregulated activation profiles is believed to be a major contributor to the development of chronic inflammatory diseases associated with metabolic disorders, including atherosclerosis and obesity. The goal of this protocol is to quantify the chemotactic activity of blood monocytes as a biomarker for monocyte priming and dysfunction and to characterize the macrophage phenotype blood monocytes are poised to differentiate into in these mouse models. Using single cell Western blot analysis, we show that after 24 h 33%of cells recruited into MCP-1-loaded basement membrane-derived gel plugs injected into mice are monocytes and macrophages; 58% after day 3. However, on day 5, monocyte and macrophage numbers were significantly decreased. Finally, we show that this assays also allows for the isolation of live macrophages from the surgically retrieved basement membrane-derived gel plugs, which can then be subjected to subsequent characterization by single cell Western blot analysis.

Here we present a protocol to quantify the chemotactic activity of blood monocytes in mouse models, to assess the effects of nutritional, pharmacological and genetic interventions on blood monocyte and to characterize the blood monocytes derived macrophages in mouse models using monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-loaded basement membrane-derived gel plugs.

Quantifizierung der monozytenchemotaktischen Aktivität in Vivo und Charakterisierung von Blutmonozyten abgeleiteten Makrophagen

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex vivo transmigration system. Group 2 innate lymphoid cells (ILC2) and CD4+ T helper cells were isolated from spleens and lungs of chicken egg ovalbumin (OVA)-challenged BALB/c mice. We confirmed the expression of CCR4 on both CD4+ T cells and ILC2, comparatively. CCL17 and CCL22 are the known ligands for CCR4; therefore, using this ex vivo transmigration method we examined CCL17- and CCL22-induced movement of CCR4+ lymphocytes. To establish chemokine gradients, CCL17 and CCL22 were placed in the bottom chamber of the transmigration system. Isolated lymphocytes were then added to top chambers and over a 48 h period the lymphocytes actively migrated through 3 &#181;m pores towards the chemokine in the bottom chamber. This is an effective system for determining the chemokinetics of lymphocytes, but, understandably, does not mimic the complexities found in the in vivo organ microenvironments. This is one limitation of the method that can be overcome by the addition of in situ imaging of the organ and lymphocytes under study. In contrast, the advantage of this method is that is can be performed by an entry-level technician at a much more cost-effective rate than live imaging. As therapeutic compounds become available to enhance migration, as in the case of tumor infiltrating cytotoxic immune cells, or to inhibit migration, perhaps in the case of autoimmune diseases where immunopathology is of concern, this method can be used as a screening tool. In general, the method is effective if the chemokine of interest is consistently generating chemokinetics at a statistically higher level than the media control. In such cases, the degree of inhibition/enhancement by a given compound can be determined as well.

In this protocol, lymphocytes are placed in the top chamber of a transmigration system, separated from the bottom chamber by a porous membrane. Chemokine is added to the bottom chamber, which induces active migration along a chemokine gradient. After 48 h, lymphocytes are counted in both chambers to quantitate transmigration.

Bewertung der Lymphozytenmigration in einem Ex-Vivo-Transmigrationssystem

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Time-lapse Imaging of Mouse Macrophage Chemotaxis

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a chemical. Chemokinesis and chemotaxis are fundamental for the mobilization and deployment of immune cells. For example, chemokines (chemotactic cytokines) can rapidly recruit circulating neutrophils and monocytes to extravascular sites of inflammation. Chemoattractant receptors belong to the large family of G protein-coupled receptors. How chemoattractant (i.e., ligand) gradients direct cell migration via G protein-coupled receptor signaling is not yet fully understood. In the field of immunology, neutrophils are popular model cells for studying chemotaxis in vitro. Here we describe a real-time two-dimensional (2D) chemotaxis assay tailored for mouse resident macrophages, which have traditionally been more difficult to study. Macrophages move at a slow pace of ~1 &#181;m/min on a 2D surface and are less well suited for point-source migration assays (e.g., migration towards the tip of a micropipette filled with chemoattractant) than neutrophils or Dictyostelium discoideum, which move an order of magnitude faster. Widely used Transwell assays are useful for studying the chemotactic activity of different substances, but do not provide information on cell morphology, velocity, or chemotactic navigation. Here we describe a time-lapse microscopy-based macrophage chemotaxis assay that allows quantification of cell velocity and chemotactic efficiency and provides a platform to delineate the transducers, signal pathways, and effectors of chemotaxis.

Here we describe methods using time-lapse, phase-contrast microscopy to image mouse resident peritoneal macrophages in a chemotactic complement C5a gradient. The protocols can be extended to other immune cells.

Zeitraffer-Bildgebung von Mausmakrophage Chemotaxis

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a ...

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an attractive therapeutic target in the clinical management of affected patients. In order to further optimize strategies aiming at therapeutic regulation of pathologically imbalanced tissue infiltration of pro-inflammatory immune cells, it will be of particular importance to achieve improved insights into disease- and organ-specific homing properties of peripheral lymphocytes. The here described experimental protocol allows to monitor lung accumulation of fluorescently labeled and adoptively transferred human lymphocytes in the context of papain-induced pulmonary inflammation. In contrast to standard in vitro assays frequently used for the analysis of immune cell migration and chemotaxis, the now introduced in vivo setting takes into account lung-specific aspects of tissue organization and the influence of the complex inflammatory scenario taking place in the living murine organism. Moreover, three-dimensional cross-sectional light-sheet fluorescence microscopic imaging does not only provide quantitative data on infiltrating immune cells, but also depicts the pattern of immune cell localization within the inflamed lung. Overall, we are able to introduce an innovative technique of high value for immunological research in the field of chronic inflammatory lung diseases, which can be easily applied by following the provided step-by-step protocol.

The here introduced protocol allows characterization of the lung homing capacity of primary human lymphocytes under in vivo inflammatory conditions. Pulmonary infiltration of adoptively transferred human immune cells in a mouse model of allergic inflammation can be imaged and quantified by light-sheet fluorescence microscopy of chemically cleared lung tissue.

Erweiterte Bildgebung der Lunge Homing menschlichen Lymphozyten in einem experimentellen In Vivo Modell der allergische Entzündung basierend auf Licht-Blatt Mikroskopie

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

Medizin

Aufklärung der T-Zell-Kinetik: Methoden zur Echtzeit-Migrationsanalyse

Real-Time In Vitro Migration Assay for Primary Murine CD8+ T Cells

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign bodies. T cell migration is a complex process that requires the coordination of many signal inputs from the environment and local immune cells, including chemokines, chemokine receptors, and adhesion molecules. Furthermore, T cell motility is influenced by dynamic surrounding environmental cues, which can alter activation state, transcriptional landscape, adhesion molecule expression, and more. In vivo, the complexity of these seemingly intertwined factors makes it difficult to distinguish individual signals that contribute to T cell migration. This protocol provides a string of methods from T cell isolation to computer-aided analysis to assess T cell migration in real-time&#160;under highly specific environmental conditions.&#160;These conditions&#160;may help&#160;elucidate mechanisms that regulate migration, improving our&#160;understanding of T cell kinetics and providing&#160;strong mechanistic evidence that is difficult&#160;to attain through animal experiments. A deeper understanding of the&#160;molecular interactions that impact cell&#160;migration is important to develop improved therapeutics.

Autor im Rampenlicht: Verständnis von Krankheitsmechanismen durch Echtzeitanalyse der T-Zell-Migration

This protocol providesa method of primary murine T cell isolation and time-lapse microscopy of T cell migration under specific environmental conditions with quantitative analysis.

Echtzeit-In-vitro-Migrationsassay für primäre murine CD8+ T-Zellen

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign ...

Quantifizierung der menschliche Monocyte Chemotaxis In Vitro und murinen Lymphozyten Menschenhandel In Vivo

Zusammenfassung

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Menschliche T-Lymphozyten-Isolierung, Kultur und Analyse der Migration In Vitro

Quantifizierung der Monocyte Seelenwanderung und Schaumbildung Zelle von Personen mit chronischen entzündlichen Erkrankungen

Laminar-Flow-based Assays, Rekrutierung von Leukozyten auf kultivierten vaskuläre Zellen und adhärenten Thrombozyten zu untersuchen

Gleichzeitige Untersuchung der Rekrutierung von Monocyte Subpopulationen unter Strömung In Vitro

Quantifizierung der monozytenchemotaktischen Aktivität in Vivo und Charakterisierung von Blutmonozyten abgeleiteten Makrophagen

Bewertung der Lymphozytenmigration in einem Ex-Vivo-Transmigrationssystem

Zeitraffer-Bildgebung von Mausmakrophage Chemotaxis

Erweiterte Bildgebung der Lunge Homing menschlichen Lymphozyten in einem experimentellen In Vivo Modell der allergische Entzündung basierend auf Licht-Blatt Mikroskopie

Echtzeit-In-vitro-Migrationsassay für primäre murine CD8+ T-Zellen

Echtzeit-In-vitro-Migrationsassay für primäre murine CD8+ T-Zellen