Name: quantifying human monocyte chemotaxis in vitro and murine lymphocyte trafficking in vivo
Uploaded: 2017-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על-ידי התוכנית ברנרד שוורץ ל' עבור הרופא מדענים האוניברסיטה רוקפלר, הקרן לפיתוח טיפולית רוברטסון באוניברסיטה רוקפלר, ואת מרכז ע ש סאקלר וההתערבות ומחקר תזונה- אוניברסיטת רוקפלר.

כל ההליכים אושרו על-ידי אוניברסיטת רוקפלר &#39; s אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש. כל החיות שוכנו בתנאים מסוימים ללא הפתוגן.
 1-ב חוץ גופית כימוטקסיס <ol><li>תרבות THP-1 תאים 6 בשנת 1640 המכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI 1640) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו- 4-(2-hydroxyethyl)-1- חומצה piperazineethanesulfonic (HEPES; 25 מ מ) (להשלים מדיה), שמירה על הצפיפות בין 0.5-1.0 x 10 6 תאים למ"ל.</li>
	צלחת <li>תרבית תאים 35 מ מ, תווית 3.5 x 10 תאים 5 THP-1 לכל תנאי עם acetoxymethyl calcein (calcein-אם; 2.5 מיקרומטר) או אחרים מתאימים הפלורסנט בתקשורת מלאה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות 
	הערה: צבעי חייב להיות קרום התא-חדיר ותואמת לחיות תאים תיוג.</li>
	<li>חם מראש קורא צלחת כדי 37 מעלות צלזיוס. 
	הערה: בנוסף בקרת טמפרטורה, פונקציונליות התחתון-קריאה נדרש גם. ראה שלב 1.10.2 עבור אלטרנטיבה קורא צלחת על כימות של נדידת תאים.</li>
	<li>בעוד תאים הם תיוג, להכין את צלחת assay והרכבים נמוך.
	צלחת <ol><li>שימוש בתרבות רקמה 24-. טוב, בתנאי אחד לכל טוב. לבצע כל תנאי דולר.</li>
		<li>750 להוסיף µL של האנק &#39; s Buffered תמיסת מלח (HBSS) באגירה מלאה עם 25 מ מ HEPES ו- 0.1% שור אלבומין (BSA) לצלחת 24-. טוב. זה משמש התנאי שליטה הבזליים.
		<ol><li>שימוש אחרים בארות תנאים השוואה, תמיד שמירה לנפח הכללי בתא התחתון-750 µL. 
			הערה: בדוגמה זו, האדם מונוציט chemoattractant חלבון-1 (MCP-1) משמש הפקד חיובי עבור כימוטקסיס 7.
			<ol><li>להרכיב התערובת מגיב על-ידי שילוב HBSS עם 25 מ מ HEPES, BSA (0.1%) ו MCP-1 (75 ng/mL). להשתמש בסרום שור למבוגרים (2.7% v / v) עם MCP-1 כפקד חיוביים נוספים של. 
				הערה: ריכוז כימוקין כימוקין יהיה תלוי על ציר chemotactic במחקר. Lyophilized MCP-1 resuspended מים מזוקקים עם BSA (0.1%) כדי להפוך פתרון מניות עם ריכוז סופי של 50 μg/mL. זה יכול להיות מדולל במים לפתרון עבודה של 10 μg/mL. להוסיף 5.6 μL של פתרון זה לתא התחתון.</li>
			</ol></li></ol></li> <li>בתום ההרכב של התאים התחתון, במקום הוספה נקבובי כל טוב, ולהבטיח הכרטיסיות של הקדמי ליישר עם החריצים של הצלחת- 
		הערה: בחר את גודל הנקבוביות המתאים עבור מוסיף. עבור ומונוציטים ו לימפוציטים, גודל הנקבוביות של 3 μm מבצע טוב. כמה סוגי תאים ו/או מערכות כימוקין עשויים לדרוש משטח מצופה מטריקס עבור העברה אופטימלית. לדוגמה, למדידת THP-1 כימוטקסיס מונוציט לכיוון MCP-1, fibronectin או מוסיף מצופים קולגן מומלצים. צלחת קורא עבור כימות, הוסף חייבת להיות ציפוי impermeant-אור, כגון פוליאתילן terephthalate, כדי למנוע גילוי של אי-העברת תאים העליונה הקאמרית 8.</li>
	</ol></li> <li>לאחר המקננת תאים למשך 30 דקות עם calcein-AM, להעביר תא ההשעיה צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה תאים ב- 1000 g x עבור 2 דק לבדוק חזותית תאים כדי לאשר ספיגת של calcein-אם ( איור 1).</li>
	<li>הסר בזהירות את תגובת שיקוע באמצעות ליניקת אבק. רחץ תאים עם תוויות ללא סרום RPMI 1640 בתוספת HEPES 25 מ מ. צנטריפוגה תאים ב 1,000 x g למשך 2 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend תאים ללא סרום RPMI 1640 בתוספת HEPES 25 מ מ. לספור תאים, לכוונן את עוצמת הקול כך התאים נמצאים ריכוז סופי של 1.0-1.5 x 10 6 תאים למ"ל.</li>
	<li>250 לוותר על μL של התליה תא לתוך תותב (העליון קאמרית).</li>
	<li>לאחר כל צ'יימברס העליון היו מלאים, בעדינות להרים את הצלחת לבדוק את החלק התחתון לנוכחות של בועות אוויר שעלולות לפגוע ההעברה וזיהוי. כדי להסיר בועה, נסה תחילה הסרת ואז מיצוב מחדש את תותב. אם לא מוצלח, שימוש במחט 27 G לנקב את הבועה ולאחר מכן מקם מחדש את תותב.</li>
	<li>למקם את הצלחת לקורא צלחת מראש ומחוממת-37 מעלות צלזיוס.
	<ol><li>רכוש קריאות קרינה פלואורסצנטית מלמטה במרווחים 1-3 דקות. בעת השימוש calcein-AM, הגדר קרינה פלואורסצנטית אורכי גל עירור, פליטה-485 nm ו 520 nm, בהתאמה. בהתאם למערכת כימוקין וסוג התא, כימוטקסיס מתרחשת בדרך כלל יותר מ 1-4 h ( איור 2 א).</li>
		<li>כחלופה מדידות רציף באמצעות קורא-צלחת, תמונה הבארות באמצעות הפוכה פלורסנט במיקרוסקופ ( איור 2B) מסוגל עירור וזיהוי של אור-485 nm ו 520 nm, בהתאמה. השתמש הגדלה נמוכה כדי ללכוד את רוב החלק התחתון של הקדמי. לכמת תאים על-ידי עיבוד התמונות עם ImageJ או תוכנה דומה 9.</li>
	</ol></li></ol> 2. המאמצים העברה של מאתר לימפוציטים <ol><li>הכנה תאי התורם <ol><li>Anesthetize בשבוע 8-12-C57BL/6J הישן תורם זכר עכברים עם הרדמה איזופלוריין (1-3%) באמצעות מכשיר אידוי של. לאשר עומק ההרדמה המתאימה על ידי הבוהן-קמצוץ.</li>
		<li>הנח את העכבר במצב פרקדן. עושים חתך קו האמצע עם איזמל ואתר הטחול בחלל הצפק השמאלי העליון. לסלק כל הטחול, למקם את המדיה מלאה (RPMI בתוספת 10% FBS עד 25 מ מ HEPES; 1 mL/טחול) על קרח. המתת חסד התורם מרדימים בעלי חיים על ידי עריפת ראש.</li>
		<li>לטחון רקמת טחול בעדינות דרך רשת ניילון מיקרומטר 40 לתוך מדיה מלאה (1 מ"ל /spleen) באמצעות סוף פומפה מזרק כדי להפוך תא בודד השעיה והעברה של צינור חרוטי 15 mL-</li>
		<li>להוסיף 4 כרכים של אמוניום כלוריד האשלגן (ACK) פירוק מאגר ואת תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי lyse אריתרוציטים.</li>
		<li>Centrifuge התאים ב 1,000 x g למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר ולמחוק את תגובת שיקוע. אם אריתרוציטים נשארים בגדר, resuspend במאגר פירוק ACK, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה תאים ב 1,000 x g למשך 2 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>Resuspend התאים בתקשורת מלאה-ריכוז של 2-5 x 10 7 תאים למ"ל, ואז מסננים התליה תא דרך רשת ניילון 40 µm כדי להסיר שאריות תאים.</li>
		<li>תווית 1 x 10 7 תאים/נמען עכבר עם תואם הפלורסנט חיים תאים, זה יוסיף להישמר על קיבוע עוקבות, כגון 5-chloromethylfluorescein diacetate (ריכוז סופי 2 μM) 10 . דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות 
		הערה: כדי לעקוב אחר אוכלוסיית תא אחד או יותר, השתמש אחרים צבעי פלורסנט עם אוכלוסיות תאים נוספים. For example, חלק של תאי התורם יכול להיות מסומן באמצעות בנזואיל 5-(and-6)-(((4-chloromethyl)) אמינו) tetramethylrhodamine (ריכוז סופי 2 μM) 11-</li>
		<li>להוסיף 4 כרכים HBSS בתוספת 25 מ מ HEPES, ולאחר מכן צנטריפוגה ב g 1,000 x עבור 2 דקות ו להשליך תגובת שיקוע. Resuspend צנפה ב HBSS בתוספת HEPES 25 מ"מ עד ריכוז סופי של עונה 1 פרק 10 8 תאים/מ ל....
		<ol><li>אם משתמש אחד או יותר הפלורסנט, לשמור על אוכלוסיות תאים מופרדים עד מייד לפני הזרקת.</li>
			<li>העברה של aliquot קטן (10 μL) של תאים של כל צבע פתרון מקבע (1 מ"ל) פיצויים cytometry זרימה עוקבות.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>העברה של לימפוציטים <ol><li>עזים ומתנגד בשבוע 8-12-בת C57BL/6J זכר הנמען עכברים עם איזופלוריין (1-3%) באמצעות מכשיר אידוי של; לאשר עומק הרדמה על ידי הבוהן-קורט. חלות וטרינרי משחה חיה &#39; s עיניים כדי למנוע ייבוש.</li>
		<li>בקצרה מערבולת תורם תאי (1 s), העברת 1 מ"ל הזרקת מזרק עם G 27, 0.5 ב המחט, שילוב אוכלוסיות תאים עם תוויות באופן שונה, אם הדבר ישים.
		<ol><li>העברה של aliquot קטן (10 μL) של תאים מעורב פתרון מקבע (1 מ"ל) עבור ניתוחים cytometry זרימה עוקבות.</li>
		</ol></li> <li>מקום חיות לתורם בשכיבה. הפעילו לחץ מתון סימטרית על העור הגבי לעין, גורם של גלגל העין לבלוט מעט.</li>
		<li>לכוון את המחט medially, להזריק 100 µL של התורם תא השעיה רטרו-orbitally לתוך עכבר לכל הנמענים. גם יכול להיות מוזרק התאים דרך הווריד זנב של.</li>
		<li>בהדרגה לשלוף את המחט הזרקה, הנח העכבר לבד בתוך כלוב ההתאוששות. צג חיה עד זה שהכרתו; שהחלמת באופן מלא פעם לשוב החיה דיור חברתי.</li>
	</ol></li> <li>איסוף וניתוח <ol><li>לאחר 1 h, עזים ומתנגד הנמען עכברים עם הרדמה איזופלוריין (1-3%) באמצעות מכשיר אידוי של; לאשר עומק הרדמה על ידי הבוהן-קורט. הקציר הטחול (או רקמות אחרות עניין) (שלב 2.1.2.) של כל הנמענים העכבר ומקום לתוך המדיה מלאה (mL/נמען 1). המתת חסד מרדימים בעלי חיים על ידי עריפת ראש. 
		הערה: מרווחי לפני הקציר רקמות יגדל הצטברות רקמת דרך לפחות 24 ח'</li>
		<li>לטחון רקמת טחול בעדינות דרך רשת ניילון מיקרומטר 40 לתוך מדיה מלאה באמצעות סוף פומפה מזרק כדי להפוך תא בודד השעיה והעברה של צינור חרוטי 15 mL-</li>
		<li>להוסיף 4 כרכים של פירוק ACK מאגר, דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר. Centrifuge התליה תא ב 1,000 x g למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
		מאגר <li>תאים resuspend מכתים (תמיסת מלח באגירה פוספט בתוספת 1% FBS). לספור תאים ולהתאים את ריכוז הסופי של 3 x 10 7 תאים/מ ל.... להעביר 100 µL תא השעיה 96-ובכן סביב הצלחת התחתונה.</li>
		<li>הכתם תאים עבור סמני הרצוי (ראה טבלה של החומרים) לניתוח על ידי cytometry זרימה. מוסיפים נוגדנים fluorophore מצומדת (ראה טבלה של החומרים) נגד הסמנים הרצויים, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בחושך. להוסיף 100 µL מכתים מאגר, צנטריפוגה תאים ב 1,000 x g למשך 3 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>Resuspend בגדר ב 200 µL מכתים מאגר, צנטריפוגה תאים ב 1,000 x g למשך 3 דקות ולמחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>Resuspend בגדר ב 125 µL מכתים מאגר ולרכוש דוגמאות שימוש cytometer זרימה באמצעות הליכים סטנדרטיים. 
		הערה: הצבע הירוק הוא נרגש על ידי 488 ננומטר לייזר, הפליטה ומתגלה עם מסננים ודיקרואיק זוהר 505 ו- 530/30. הצבע הכתום נרגש 561 nm ו הפליטה מזוהה באמצעות מסנן ודיקרואיק זוהר 582/15.
		<ol><li>שימוש הציל תאים מכל 2.1.8.2 כדי לפצות על כל הפלורסנט. 
			הערה: באמצעות פיצוי מבוסס-חרוז עם fluorophores תואמים את עירור ואת ספקטרום הפליטה של צבעים תיוג תגרום פיצוי שיוצרת.</li>
			<li>השתמש תאי קלט ששמרת משלב 2.2.2.1 במדויק לקבוע את היחס שבין באופן שונה עם התווית תאי קלט אם משתמש אחד או יותר שכותרתו האוכלוסייה ( איור 3). לחשב רקמות ספציפיות ההעברה המבוססים על היחס של תווית לתאים ללא תווית ( איור 4).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+chemokine+receptors:+positioning+cells+for+host+defense+and+immunity.">Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity.</a> Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li><li>Ponda, M. P., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+stimulation+of+CCR7+chemotaxis+due+to+coagulation+factor+XIIa-dependent+production+of+high-molecular-weight+kininogen+domain+5.">Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boyden+chamber+assay.">Boyden chamber assay.</a> Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).</li><li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li><li>Leonard, E. J., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+monocyte+chemoattractant+protein-1+(MCP-1).">Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1).</a> Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).</li><li>Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+fluorescence+based+assay+of+neurite+formation.">An automated fluorescence based assay of neurite formation.</a> J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+cell+cycle-dependent+changes+in+cell+thiol+level+by+combining+a+new+laser+dye+with+Hoechst+33342.">Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342.</a> Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).</li><li>West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+fixation+of+thiol-reactive+fluorescent+cytoplasmic+probes+for+tracking+cell+migration.">Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration.</a> J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).</li><li>Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+greater+chemotactic+network+for+lymphocyte+trafficking:+chemokines+and+beyond.">The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond.</a> Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).</li></ol>

המחברים אין לחשוף

כימות של נדידת תאים חיסוניים יכול להתבצע באמצעות פשוטה, מהירה מבחני גם בתוך vitro וגם ויוו. נדגים את כימוטקסיס במבחנה של ומונוציטים האדם בתגובה שיפוע MCP-1 ו הגדלת מאת סרום. In vivo, splenocytes מאתר התורם באופן שונה עם תווית, בעקבות העברת המאמצת, ששוחזרו מחיות הנמען.
ש?...

חסינות חסון דורש התיאום הגיאופוליטיות והמרחביות טמפורלית מורכב של מספר עצום של סוגי תאים על מנת להגיב כראוי על פציעה, זיהום, ליצור self-tolerance. מספר הקולטנים כימוקין עשרות וליגנדים המקביל שלהם התגלו, המנגנונים המולקולריים מתן מאופיין על ידי אילו תאים מסוים ויכולה להיות מכוונת לתוך רקמה ספציפית בזמן מסוים. לפיכך, לומד כימוטקסיס והעברה היא מרכיב הכרחי של מחקר באימונולוגיה. אכן, וזמינותו שתואר במבחנה לאחרונה שימשה ככלי מיון לזיהוי קופקטור chemotactic שמאיץ כימוטקסיס של תאי-T לכיוון נוגדנים 19 ו- 21 C-C3. מטרת בשיטות המתוארות כאן הם להתיר הערכות כמותיות של תאים חיסוניים כימוטקסיס במבחנה , בתוך vivo.
וזמינותו קאמרית בוידן (נדידת תאים, הפלישה) היא שיטה זולה, הדירים מהירה להערכת תא העברה4,5. ב וזמינותו סטנדרטי, התא העליון הוא נזרע עם תאים, מופרדת באמצעות הוספה נקבובי מ. התא התחתון, שאליו העברת התאים. בזמן הרצוי, תאים היגרו בצד התחתון של הקדמי יכול להיות קבוע, עבור כימות מוכתמת מיקרוסקופ אור. אולם, מדידות כאלה להגביל איסוף נתונים נקודת סיום יחיד, שמונע את איסוף נתונים דינאמי, באפשרותך לדרוש אופטימיזציה מקיפה כדי לקבוע את נקודת הזמן האופטימלי לניתוח. . הנה, מספר עיבודים מתוארים כי היתר בזמן אמת, כמותיים, מרובבת מדידות של כימוטקסיס במבחנה.
ללימודים ויוו , משמש נקודת סיום פונקציונלית, כלומר הצטברות תאים בתא רקמות נתון ספציפי. תאי התורם מראש שכותרתו יוכנסו חיות נמען באמצעות העברת המאמצת. אלה בתאי התורם לאחר מכן ניתן לזהות על ידי cytometry זרימה לאחר הקציר רקמות הנמען. הציג גם היא אסטרטגיה משותפת תיוג המאפשר קביעת סחר לסוגי תאים שונים בתוך חיה נמען בודד. שיטה זו מבטלת את הווריאציה בין בעלי חיים הזרקת תאים, ואת חשבונות עבור הפיזיולוגיות השתנות בין בעלי חיים.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture flask</td><td>Corning</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1430</td><td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td></tr><tr><td>Cell culture dish</td><td>Corning</td><td>1007</td><td></td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>Corning</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroblok Fibronectin Insert</td><td>Corning</td><td>CB354597</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9998S</td><td></td></tr><tr><td>Human Recombinant MCP-1</td><td>Peprotech</td><td>300-04</td><td></td></tr><tr><td>Adult bovine Serum</td><td>Sigma</td><td>B9433</td><td></td></tr><tr><td>HBSS with calcium and magnesium; no phenol red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M2e plate reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX71 inverted fluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein animal health</td><td>11695-6776-2</td><td>Isofluorane anesthesia</td></tr><tr><td>Cell strainer 40um nylon</td><td>Falcon Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysing buffer</td><td>Quality Biological</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Orange CMTMR Dye</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2927</td><td>Excitation: 541nm, Emission: 565nm</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA Dye</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2925</td><td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td></tr><tr><td>5ml syringe</td><td>BD Syringe</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>1ml TB syringe</td><td>BD Syringe</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 cell line</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>100228</td><td>Excitation: 405nm, Emission: 421nm</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>115540</td><td>Excitation: 405nm, Emission: 603nm</td></tr><tr><td>96-well round bottom plate</td><td>Corning</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>LSRII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Flow cytometer</td></tr></tbody></table>

quantifying human monocyte chemotaxis in vitro and murine lymphocyte trafficking in vivo

כימוטקסיס הוא העברה לאורך כימי מסוים מעבר צבע1. נוגדנים הם ציטוקינים chemotactic לקדם סחר הסלולר עם ירידה לפרטים אנטומיים, זמני2. כימוטקסיס הוא פונקציה קריטית של לימפוציטים, תאים חיסוניים אחרים זה יכול להיות באופן כמותי מוערך ב חוץ גופית. כתב יד זה מתאר שיטות המתירים הערכת כימוטקסיס, גם במבחנה וגם ויוו, עבור סוגי תאים מגוונים כולל שורות תאים ותאים מקורית. ה במבחנה, עיצוב מבוסס על צלחת מאפשר השוואת בו-זמנית בתוך מספר תנאים בזמן אמת, ואת יכולה להסתיים תוך 1-4 ח' במבחנה assay תנאים ניתן לטפל להציג אגוניסטים ו antagonists, כמו גם להבדיל כימוטקסיס chemokinesis, וזו תנועה אקראית. עבור ויוו הערכות סחר, תאים חיסוניים יכול להיות עם צבעי פלורסנט מרובים תוויות, המשמש להעברת המאמצת. תיוג דיפרנציאלית של תאים מאפשר לאוכלוסיות לתא מעורב להיות מוחדרים החיה אותו, ובכך להקטין את השונות, להפחית את מספר בעלי החיים הדרושים עבור ניסוי מופעל כראוי. הגירה לתוך רקמת הלימפה מתרחשת בתוך פחות משעה ולאחר מספר תאי רקמות ניתן לטעום. Cytometry זרימה לאחר הקציר רקמות מאפשר ניתוח מהיר ולא כמותית של דפוסי הנדידה סוגי תאים מרובים.

בעת שימוש calcein-אם צבע, בדיקה ויזואלית של תאים יאשר תווית ספיגת (איור 1). קריאות פלורסנט אוטומטיות יעקבו הגירה כמו תאי המעבר אל החלק התחתון של הקדמי לאורך זמן. נתונים אלו מראים בבירור אינדוקציה של נדידת תאים לכיוון MCP-1, כמו גם על הגדלת של תגובה זו על ידי סרום (<s...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo at JoVE.com

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

לכימות מונוציט האנושי כימוטקסיס במבחנה , לימפוציט מאתר סחר In Vivo

פרוטוקולים עבור הערכה כמותית של לימפוציטים כימוטקסיס והעברה הן כלי חשוב עבור מחקר באימונולוגיה. . הנה, פרוטוקול במבחנה מתואר כי היתרים בזמן אמת, מרובב הערכה של נדידת תאים, כמו גם משלימים ויוו טכניקה המאפשרת מעקב של תאים מקורית על הטחול.

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

quantifying-human-monocyte-chemotaxis-vitro-murine-lymphocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

7.1K Views.  The Rockefeller University. פרוטוקולים עבור הערכה כמותית של לימפוציטים כימוטקסיס והעברה הן כלי חשוב עבור מחקר באימונולוגיה. . הנה, פרוטוקול במבחנה מתואר כי היתרים בזמן אמת, מרובב הערכה של נדידת תאים, כמו גם משלימים ויוו טכניקה המאפשרת מעקב של תאים מקורית על הטחול.

Video: Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

האדם בידוד T לימפוציטים, התרבות ניתוח של הגירה במבחנה</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the transmigration of innate immune monocytes to inflammatory sites of deposited lipid called fatty streaks, which are present in arterial walls of medium to large arteries. The key pathogenic feature of lesions at this early stage of atherosclerosis is the maturation of monocytes which migrate into arteries to form foam cells or lipid-laden macrophages. Considerable evidence supports the hypothesis that risk of atherosclerosis is increased by chronic inflammatory conditions accompanying diseases such as rheumatoid arthritis and HIV, as well as general ageing, and that this risk is predicted by monocyte activation. While mouse models provide a good platform to investigate the role of monocytes in atherogenesis in vivo, they require genetic alteration of natural cholesterol metabolism and drastic alteration of normal mouse diets, and have limited suitability for the study of atherogenic influences of human comorbid diseases. This motivated us to develop a human in vitro model to measure the atherogenic potential of monocytes isolated from individuals with defined disease states. Currently, human in vitro models are limiting in that they evaluate monocyte transmigration and foam cell formation in isolation. Here we describe a protocol in which monocytes isolated from patient blood transmigrate across human endothelial cells into a type 1 collagen matrix, and their propensity to mature into foam cells in the presence or absence of exogenous lipid is measured. The protocol has been validated for the use of human monocytes purified from individuals with HIV infection and elderly HIV uninfected individuals. This model is versatile and allows monocyte transmigration and foam cell formation to be evaluated using either microscopy or flow cytometry as well as allowing the assessment of atherogenic factors present in serum or plasma.

We describe a protocol to measure transmigration by monocytes across human endothelial monolayers and their subsequent maturation into foam cells. This provides a versatile method to assess the atherogenic properties of monocytes isolated from people with different disease conditions and to evaluate factors in blood which may enhance this propensity.

כימות של גלגול מונוציט ויצירת תאי קצף מאנשים עם מצבים דלקתיים כרוניים

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

מבחני מבוסס זרימה שכבתית לחקור ליקוציט גיוס על תאים בתרבית וסקולרית, טסיות חסיד

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

מחקר בו זמנית של הגיוס של מונוציט Subpopulations תחת זרימה במבחנה

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of monocyte-derived macrophages can impair wound healing. We showed that high fat and high sugar diets promote monocyte priming and dysfunction, converting healthy blood monocytes into a hyper chemotactic phenotype poised to differentiate into macrophages with dysregulated activation profiles and impaired phenotypic plasticity. The over-recruitment of monocyte-derived macrophages and recruitment of macrophages with dysregulated activation profiles is believed to be a major contributor to the development of chronic inflammatory diseases associated with metabolic disorders, including atherosclerosis and obesity. The goal of this protocol is to quantify the chemotactic activity of blood monocytes as a biomarker for monocyte priming and dysfunction and to characterize the macrophage phenotype blood monocytes are poised to differentiate into in these mouse models. Using single cell Western blot analysis, we show that after 24 h 33%of cells recruited into MCP-1-loaded basement membrane-derived gel plugs injected into mice are monocytes and macrophages; 58% after day 3. However, on day 5, monocyte and macrophage numbers were significantly decreased. Finally, we show that this assays also allows for the isolation of live macrophages from the surgically retrieved basement membrane-derived gel plugs, which can then be subjected to subsequent characterization by single cell Western blot analysis.

Here we present a protocol to quantify the chemotactic activity of blood monocytes in mouse models, to assess the effects of nutritional, pharmacological and genetic interventions on blood monocyte and to characterize the blood monocytes derived macrophages in mouse models using monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-loaded basement membrane-derived gel plugs.

הכמת של פעילות כימוכתית מונוציט בVivo ואפיון מקרופאגים הנגזרים מונוציט

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex vivo transmigration system. Group 2 innate lymphoid cells (ILC2) and CD4+ T helper cells were isolated from spleens and lungs of chicken egg ovalbumin (OVA)-challenged BALB/c mice. We confirmed the expression of CCR4 on both CD4+ T cells and ILC2, comparatively. CCL17 and CCL22 are the known ligands for CCR4; therefore, using this ex vivo transmigration method we examined CCL17- and CCL22-induced movement of CCR4+ lymphocytes. To establish chemokine gradients, CCL17 and CCL22 were placed in the bottom chamber of the transmigration system. Isolated lymphocytes were then added to top chambers and over a 48 h period the lymphocytes actively migrated through 3 &#181;m pores towards the chemokine in the bottom chamber. This is an effective system for determining the chemokinetics of lymphocytes, but, understandably, does not mimic the complexities found in the in vivo organ microenvironments. This is one limitation of the method that can be overcome by the addition of in situ imaging of the organ and lymphocytes under study. In contrast, the advantage of this method is that is can be performed by an entry-level technician at a much more cost-effective rate than live imaging. As therapeutic compounds become available to enhance migration, as in the case of tumor infiltrating cytotoxic immune cells, or to inhibit migration, perhaps in the case of autoimmune diseases where immunopathology is of concern, this method can be used as a screening tool. In general, the method is effective if the chemokine of interest is consistently generating chemokinetics at a statistically higher level than the media control. In such cases, the degree of inhibition/enhancement by a given compound can be determined as well.

In this protocol, lymphocytes are placed in the top chamber of a transmigration system, separated from the bottom chamber by a porous membrane. Chemokine is added to the bottom chamber, which induces active migration along a chemokine gradient. After 48 h, lymphocytes are counted in both chambers to quantitate transmigration.

הערכה של הגירה לימפוציט במערכת הגירה לשעבר של Vivo

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Time-lapse Imaging of Mouse Macrophage Chemotaxis

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a chemical. Chemokinesis and chemotaxis are fundamental for the mobilization and deployment of immune cells. For example, chemokines (chemotactic cytokines) can rapidly recruit circulating neutrophils and monocytes to extravascular sites of inflammation. Chemoattractant receptors belong to the large family of G protein-coupled receptors. How chemoattractant (i.e., ligand) gradients direct cell migration via G protein-coupled receptor signaling is not yet fully understood. In the field of immunology, neutrophils are popular model cells for studying chemotaxis in vitro. Here we describe a real-time two-dimensional (2D) chemotaxis assay tailored for mouse resident macrophages, which have traditionally been more difficult to study. Macrophages move at a slow pace of ~1 &#181;m/min on a 2D surface and are less well suited for point-source migration assays (e.g., migration towards the tip of a micropipette filled with chemoattractant) than neutrophils or Dictyostelium discoideum, which move an order of magnitude faster. Widely used Transwell assays are useful for studying the chemotactic activity of different substances, but do not provide information on cell morphology, velocity, or chemotactic navigation. Here we describe a time-lapse microscopy-based macrophage chemotaxis assay that allows quantification of cell velocity and chemotactic efficiency and provides a platform to delineate the transducers, signal pathways, and effectors of chemotaxis.

Here we describe methods using time-lapse, phase-contrast microscopy to image mouse resident peritoneal macrophages in a chemotactic complement C5a gradient. The protocols can be extended to other immune cells.

פקיעה זמן הדמיה של העכבר מקרופאג כימוטקסיס

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a ...

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an attractive therapeutic target in the clinical management of affected patients. In order to further optimize strategies aiming at therapeutic regulation of pathologically imbalanced tissue infiltration of pro-inflammatory immune cells, it will be of particular importance to achieve improved insights into disease- and organ-specific homing properties of peripheral lymphocytes. The here described experimental protocol allows to monitor lung accumulation of fluorescently labeled and adoptively transferred human lymphocytes in the context of papain-induced pulmonary inflammation. In contrast to standard in vitro assays frequently used for the analysis of immune cell migration and chemotaxis, the now introduced in vivo setting takes into account lung-specific aspects of tissue organization and the influence of the complex inflammatory scenario taking place in the living murine organism. Moreover, three-dimensional cross-sectional light-sheet fluorescence microscopic imaging does not only provide quantitative data on infiltrating immune cells, but also depicts the pattern of immune cell localization within the inflamed lung. Overall, we are able to introduce an innovative technique of high value for immunological research in the field of chronic inflammatory lung diseases, which can be easily applied by following the provided step-by-step protocol.

The here introduced protocol allows characterization of the lung homing capacity of primary human lymphocytes under in vivo inflammatory conditions. Pulmonary infiltration of adoptively transferred human immune cells in a mouse model of allergic inflammation can be imaged and quantified by light-sheet fluorescence microscopy of chemically cleared lung tissue.

הדמיה של לימפוציטים אנושיים יונת ריאות ב ניסיוני במודל Vivo של דלקת אלרגית בהתבסס על מיקרוסקופ אור גיליונות מתקדמות

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

Medicine

הבהרת קינטיקה של תאי T: שיטות לניתוח נדידה בזמן אמת

Real-Time In Vitro Migration Assay for Primary Murine CD8+ T Cells

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign bodies. T cell migration is a complex process that requires the coordination of many signal inputs from the environment and local immune cells, including chemokines, chemokine receptors, and adhesion molecules. Furthermore, T cell motility is influenced by dynamic surrounding environmental cues, which can alter activation state, transcriptional landscape, adhesion molecule expression, and more. In vivo, the complexity of these seemingly intertwined factors makes it difficult to distinguish individual signals that contribute to T cell migration. This protocol provides a string of methods from T cell isolation to computer-aided analysis to assess T cell migration in real-time&#160;under highly specific environmental conditions.&#160;These conditions&#160;may help&#160;elucidate mechanisms that regulate migration, improving our&#160;understanding of T cell kinetics and providing&#160;strong mechanistic evidence that is difficult&#160;to attain through animal experiments. A deeper understanding of the&#160;molecular interactions that impact cell&#160;migration is important to develop improved therapeutics.

מחבר זרקור: הבנת מנגנוני מחלה באמצעות ניתוח בזמן אמת של נדידת תאי T

This protocol providesa method of primary murine T cell isolation and time-lapse microscopy of T cell migration under specific environmental conditions with quantitative analysis.

בדיקת הגירה חוץ גופית בזמן אמת עבור תאי T ראשוניים מסוג +CD8

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign ...

לכימות מונוציט האנושי כימוטקסיס במבחנה , לימפוציט מאתר סחר In Vivo

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

האדם בידוד T לימפוציטים, התרבות ניתוח של הגירה במבחנה

כימות של גלגול מונוציט ויצירת תאי קצף מאנשים עם מצבים דלקתיים כרוניים

מבחני מבוסס זרימה שכבתית לחקור ליקוציט גיוס על תאים בתרבית וסקולרית, טסיות חסיד

מחקר בו זמנית של הגיוס של מונוציט Subpopulations תחת זרימה במבחנה

הכמת של פעילות כימוכתית מונוציט בVivo ואפיון מקרופאגים הנגזרים מונוציט

הערכה של הגירה לימפוציט במערכת הגירה לשעבר של Vivo

פקיעה זמן הדמיה של העכבר מקרופאג כימוטקסיס

הדמיה של לימפוציטים אנושיים יונת ריאות ב ניסיוני במודל Vivo של דלקת אלרגית בהתבסס על מיקרוסקופ אור גיליונות מתקדמות

בדיקת הגירה חוץ גופית בזמן אמת עבור תאי T ראשוניים מסוג +CD8

בדיקת הגירה חוץ גופית בזמן אמת עבור תאי T ראשוניים מסוג +CD8