Name: quantifying human monocyte chemotaxis in vitro and murine lymphocyte trafficking in vivo
Uploaded: 2017-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
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이 작품 의학 및 영양 연구에 대 한 록펠러 대학, 록펠러 대학에 로버트 슨 치료 개발 기금 그리고 Sackler 센터에서 의사 과학자에 대 한 버나드 L. 슈워츠 프로그램에 의해 지원 되었다는 록펠러 대학입니다.

모든 절차는 록펠러 대학에 의해 승인 되었다 &#39; 기관 동물 관리 및 사용 위원회. 모든 동물은 특정 병원 체 자유로운 조건에서 보관 되어 있었다.
 1. 체 외에서 Chemotaxis <ol><li>문화 THP-1 세포와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 4-(2-hydroxyethyl)-1 보충 로스웰 파크 기념 연구소 1640 (RPMI 1640)에 6- piperazineethanesulfonic 산 (HEPES; 25 m m) (미디어 완료), 0.5-1.0 x 10 6 셀/mL 사이 밀도 유지.</li>
	<li>에는 35 m m 세포 배양 접시, 30 분에 대 한 calcein acetoxymethyl (calcein-오전; 2.5 µ M) 또는 37 ° C에서 완전 한 미디어에 적합 한 형광 성 염료 다른 조건 당 3.5 x 10 라벨 5 THP-1 셀 
	참고: 염료 세포 막 투과성 및 라이브 셀 라벨와 호환 되어야 합니다.</li>
	<li>사전 따뜻한 플레이트 리더를 37 ° c. 
	참고: 뿐만 아니라 온도 제어, 하단-읽기 기능이입니다 또한 필요. 마이그레이션 단계 1.10.2 정량화에 대 한 플레이트 리더를 대안에 대 한 참조 셀.</li>
	<li>셀 라벨는 하는 동안 준비 시험 접시와 낮은 챔버.
	<ol><li>사용 24-잘 조직 배양 플레이트, 잘 당 한 상태. 3 중에 수행 하는 각 조건.</li>
		<li>행 크의 추가 750 µ L &#39; s Buffered 소금물 (HBSS) 24-잘 접시에 25 mM HEPES 및 0.1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 버퍼. 이 기저 제어 상태 역할을 합니다.
		비교 조건, 750 µ L에서 아래쪽 챔버에 전체 볼륨을 항상 유지에 대 한 <ol><li>다른 사용 우물. 
			참고:이 예제에서는 인간 monocyte chemoattractant 단백질-1 (MCP-1) 역할을 chemotaxis 7에 대 한 긍정적인 제어 합니다.
			<li>어셈블 시 혼합물 25 mm HEPES HBSS, BSA (0.1%), 및 MCP-1을 결합 하 여 <ol>(75 ng/mL). 성인 소 혈 청을 사용 하 여 (2.7 %v / v) 추가 긍정적인 컨트롤로 MCP-1. 
				참고: Chemokine 및 chemokine 농도 연구에서 혈 축에 따라 달라 집니다. 동결 건조 된 MCP-1 최종 농도 50 μ g/mL의 재고 솔루션 BSA (0.1%)와 증류수에 resuspended 이다. 이 작업 솔루션 10 μ g/mL의 물에 희석 수 있습니다. 더 낮은 약 실에이 솔루션의 5.6 μ 추가.</li>
			</ol></li></ol></li> <li>아래쪽 챔버의 구성이 완료 된 후 삽입 탭 플레이트의 노치와 정렬 있도록 각 잘 다공성 삽입 장소. 
		참고: 삽입에 대 한 적절 한 기 공 크기를 선택 하십시오. Monocytes, lymphocytes 3 μ m의 기 공 크기를 잘 수행합니다. 일부 세포 유형 및 chemokine 시스템은 최적의 마이그레이션에 대 한 매트릭스 코팅 표면이 필요할 수 있습니다. 예를 들어 측정 THP 1 monocyte chemotaxis MCP-1으로, fibronectin 또는 콜라겐 코팅 삽입은 것이 좋습니다. 정량에 대 한 플레이트 리더, 삽입 있어야 빛 impermeant 코팅, 폴 리 에틸렌 테 레프 탈 레이트, 등 비 마이그레이션의 탐지를 방지 하기 위해 상단에 셀 챔버 8.</li>
	</ol></li> <li>Calcein 오전와 30 분에 대 한 셀을 잠복기 후 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 2 분에 대 한 1000 x g에서 원심 분리기 세포 육안으로 직접 검사 calcein-오전 ( 그림 1)의 확인을 셀.</li>
	<li>신중 하 게 상쾌한 진공 흡 인기를 사용 하 여 제거 합니다. 혈 청 무료 RPMI 1640 HEPES 25 m m와 보완에 레이블된 셀을 씻어. 1000 x g 2 분 동안에 세포를 원심 및 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>Resuspend 셀 세럼 무료 RPMI 1640 HEPES 25 m m로 보완. 셀 및 셀 10 6 셀/mL x 1.0-1.5의 최종 농도에 볼륨 조정.</li>
	<li>삽입 (위 약 실)에 세포 현 탁 액의 분배 250 μ.</li>
	<li>모든 상단 챔버 채워 졌, 부드럽게 접시를 올리고 마이그레이션 및 탐지를 방해할 수 있는 공기 방울의 존재에 대 한 밑면을 검사 후. 거품을 제거 하려면 먼저 다음 다시 삽입 위치를 제거해 보십시오. 실패할 경우 27 G 니 들을 사용 하 여 거품을 찔린 다음 삽입 위치를.</li>
	<li>37 ° C에 미리 데워 진된 플레이트 리더에 접시를 놓습니다.
	<li>취득 형광 읽기 1-3 분 간격 아래에서 <ol>. Calcein 오전에 사용 하 여, 형광 흥분 및 방출 파장에서 설정 485 nm와 520 nm, 각각. 셀 유형 및 chemokine 시스템에 따라 chemotaxis 일반적으로 이상의 1-4 h ( 그림 2A) 발생 합니다.</li>
		<li>연속 측정 하는 대신 485에는 거꾸로 형광 현미경 ( 그림 2B) 흥분 하 고 빛의 감지를 사용 하 우물 이미지 플레이트 리더를 사용 하 여 및 520 nm, 각각. 낮은 확대를 사용 하 여 삽입의 밑면의 대부분을 잡으려고. ImageJ 또는 유사한 소프트웨어 9 이미지를 처리 하 여 셀을 계량.</li>
	</ol></li></ol> 2. Murine Lymphocytes 입양 전송 <ol><li>기증자 세포의 준비 <ol><li>Anesthetize 8-12 주-isoflurane 마 취 (1-3%)는 기화 기를 사용 하 여 오래 된 C57BL/6J 남성 기증자 쥐. 발가락-핀치에 의해 마 취의 적절 한 깊이 확인.</li>
		<li>부정사 위치에 마우스를 놓습니다. 메스와 중간 절 개를 만들고 상단 왼쪽된 복 막 공간에서 비장을 찾습니다. 삭제할 모든 비장 고 완벽 한 미디어 (RPMI 10 %FBS 25mm HEPES 보충, 1 mL/비장) 얼음에 합니다. 잘린에 의해 마 취 기증자 동물을 안락사.</li>
		<li>단일 셀 펜션과 전송 15 mL 원뿔 튜브에 게 주사기 플런저의 끝을 사용 하 여 완전 한 미디어 (1 mL /spleen)로 40 µ m 나일론 메시 부드럽게 통해 비장 조직 갈기.</li>
		<li>추가 4 염화 염화 칼륨 (ACK) 세포의 버퍼 볼륨과 lyse 적혈구를 실 온에서 5 분 동안 품 어.</li>
		<li>1000 x g 실 온에서 2 분 동안에 세포를 원심 고 상쾌한 삭제. 적혈구는 펠 릿에 남아, 경우 ACK 세포의 용 해 버퍼에서 resuspend, 실 온에서 5 분 동안 품 어, 1000 x g 2 분 동안에 세포를 원심 및 상쾌한 삭제.</li>
		<li>Resuspend 2 5 10 7 셀/mL, x의 농도에 완전 한 미디어에 셀 다음 40 µ m 나일론 메쉬 셀 파편 제거를 통해 세포 현 탁 액을 변형.</li>
		<li>레이블 1 형광 염료와 호환 10 7 셀/받는 사람 마우스 x 셀 생활과 그 5-chloromethylfluorescein diacetate (최종 농도 2 μ M) 10 등 이후 고정 시 유지 될 것 이다 . 30 분 동안 37 ° C에서 품 어 
		참고: 하나 이상의 세포 인구를 추적 하려면 추가 셀 인구와 다른 형광 성 염료를 사용 합니다. 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) 벤 조일와 기증자 세포의 부분을 표시 하는 예를 들어,) 아미노) tetramethylrhodamine (최종 농도 2 μ M) 11.</li>
		<li>추가 4 볼륨 HBSS 보충 25mm HEPES, 다음 2 분 및 폐기 상쾌한 1000 x g에서 원심 분리기. HBSS HEPES 25 m m 1 x 10 8 셀/mL의 최종 농도에 보충에 펠 릿을 resuspend.
		<ol><li>하나 이상의 형광 염료를 사용 하는 경우 계속 주입 직전까지 분리 하는 세포 인구.</li>
			<li>이후의 흐름 cytometry 보상 통 솔루션 (1 mL)을 각 색의 세포의 작은 약 수 (10 μ) 전송.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>림프 톨의 전송 <ol><li>8-12 주 Anesthetize-isoflurane (1-3%);는 기화 기를 사용 하 여의 오래 된 C57BL/6J 남성 받는 사람 마우스 발가락 핀치에 의해 마 취의 깊이 확인. 동물에 수의 연 고를 적용 &#39; 건조 방지 하기 위해 s 눈.</li>
		<li>짧게 소용돌이 기증자 세포 (1 s) 및 1 mL 주입 주사기 27 g, 바늘, 0.5에 해당 하는 경우 차동 레이블이 세포 인구를 결합.
		<ol><li>이후의 흐름 cytometry 분석 통 솔루션 (1 mL) 혼합된 셀의 작은 약 수 (10 μ) 전송.</li>
		</ol></li> <li>기증자 동물 발생 하기 쉬운 위치에 배치. 눈, 약간 내 다 눈알을 일으키는 등 피부에 가벼운 꼬리 압력 적용.</li>
		<li>Medially 바늘을 직접 하 고 각 받는 사람 마우스에 복고풍 orbitally 기증자 세포 현 탁 액의 100 µ L를 주입. 셀도 꼬리 정 맥을 통해 주입 할 수 있습니다.</li>
		<li>는 점차적으로 주사 바늘을 철회 하 고 복구에 혼자 마우스를 놓습니다. 그것은 의식; 회복 될 때까지 동물을 모니터링 일단 완전히 복구 된 반환 동물 사회 주택.</li>
	</ol></li> <li>수집 및 분석 <ol><li>1 시간 후 anesthetize 한 기화 기를 사용 하 여 받는 사람 마우스 isoflurane 마 취 (1-3%)와 함께, 발가락-핀치에 의해 마 취의 깊이 확인. 비장 (또는 관심의 다른 조직) 수확 (2.1.2 단계.) 각 받는 사람 마우스와 완전 한 미디어 (1 mL/받는 사람)에 장소에서. 잘린에 의해 마 취 동물을 안락사. 
		참고: 조직 수확 전에 더 긴 간격으로 적어도 24 h. 통해 조직 축적 증가</li>
		<li>주사기 플런저의 끝을 사용 하 여 단일 세포 현 탁 액 및 전송 15 mL 원뿔 튜브에 게 완전 한 미디어로 40 µ m 나일론 메시 부드럽게 통해 비장 조직 갈기.</li>
		<li>추가 4 볼륨 ACK 세포의 버퍼링 하 고 실 온에서 5 분을 품 어. 실 온에서 2 분 동안 1000 x g에 세포 현 탁 액을 원심 및 상쾌한 삭제.</li>
		<li>얼룩에서 resuspend 셀 버퍼 (인산 염 버퍼 염 분 보충 1 %FBS). 셀 고 3 x 10 7 셀/mL의 최종 농도를 조정 합니다. 세포 현 탁 액의 100 µ L 하단 플레이트 라운드 96 잘 전송.</li>
		<li>Cytometry에 의해 분석을 위해 원하는 마커 (재료의 표 참조)에 대 한 얼룩 셀. 원하는 표시에 대 한 fluorophore 활용 된 항 체 (재료의 표 참조)를 추가 하 고 어둠 속에서 20 분 동안 4 ° C에서 품 어. 100 µ L를 추가 3 분 1000 x g에서 세포를 원심 버퍼, 얼룩 및 삭제는 상쾌한.</li>
		<li>200 µ L에 펠 릿을 resuspend 3 분 1000 x g에서 세포를 원심 버퍼, 얼룩 및 삭제는 상쾌한.</li>
		<li>Resuspend 125 µ L 얼룩에 펠 릿 버퍼 및 표준 절차를 사용 하 여 교류 cytometer를 사용 하 여 샘플을 수집. 
		참고: 녹색 염료 488 nm 레이저에 의해 흥분 되 고 방출 505 530/30 dichroic 필터 감지. 주황색 염료는 561에 의해 흥분 및 방출 582/15의 dichroic 필터에 의해 검출 된다.
		<ol><li>2.1.8.2 각 형광 성 염료에 대 한 보상에서 사용 저장 셀. 
			참고: fluorophores 여기 및 라벨 염료의 방출 스펙트럼과 구슬 기반 보상을 사용 하 여 차선 보상 발생 합니다.</li>
			<li>사용 하 여 단계 2.2.2.1에서에서 저장 된 입력된 셀의 비율을 정확 하 게 결정 경우 하나 이상의 레이블이 인구 ( 그림 3)를 사용 하 여 차동 입력된 셀을 표시. 레이블이 없는 셀 ( 그림 4)에 표시 된 계산의 비율에 따라 조직 특정 마이그레이션.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+chemokine+receptors:+positioning+cells+for+host+defense+and+immunity.">Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity.</a> Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li><li>Ponda, M. P., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+stimulation+of+CCR7+chemotaxis+due+to+coagulation+factor+XIIa-dependent+production+of+high-molecular-weight+kininogen+domain+5.">Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boyden+chamber+assay.">Boyden chamber assay.</a> Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).</li><li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li><li>Leonard, E. J., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+monocyte+chemoattractant+protein-1+(MCP-1).">Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1).</a> Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).</li><li>Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+fluorescence+based+assay+of+neurite+formation.">An automated fluorescence based assay of neurite formation.</a> J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+cell+cycle-dependent+changes+in+cell+thiol+level+by+combining+a+new+laser+dye+with+Hoechst+33342.">Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342.</a> Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).</li><li>West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+fixation+of+thiol-reactive+fluorescent+cytoplasmic+probes+for+tracking+cell+migration.">Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration.</a> J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).</li><li>Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+greater+chemotactic+network+for+lymphocyte+trafficking:+chemokines+and+beyond.">The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond.</a> Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).</li></ol>

저자 공개할 게 없다

면역 세포 이동의 정량화는 간단한를 사용 하 여 수행할 수 있습니다 그리고 신속한 분석 실험 체 외에서 그리고 vivo에서모두. 혈 청에 의해 인간 monocytes MCP-1 그라디언트 및 확대에 대 한 응답에서의 chemotaxis 생체 외에서 설명합니다. Vivo에서, 기증자 murine splenocytes 차동 표시 했다 고 입양 전송 다음 받는 사람 동물에서 발견 했다.
몇 시간 포인트 샘?...

강력한 면역에는 부상, 감염에 적절 하 게 응답 하 고 생성 하는 self-tolerance 세포 유형의 수많은 복잡 한 시간적 및 공간 조정을 필요 합니다. 여러 다스 chemokine 수용 체와 그들의 해당 ligands 발견 되었습니다 하 고 특정 셀에 의해 특징이 제공 분자 기계 장치는 특정 시간에 특정 조직으로 지시 될 수 있다. 따라서, 공부 chemotaxis 및 마이그레이션 면역학 연구의 필수적인 구성 요소 이다. 실제로, 설명 체 외에서 분석 결과 가속 C C 19와 21 발산3으로 T-세포의 chemotaxis 혈 공동 인자를 식별 하기 위해 심사 도구로 사용 최근 했다. 여기에 설명 된 방법의 목적은 면역 세포 chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 vivo에서의 정량적 평가 허용 하는.
Boyden (셀 이동과 침략) 챔버 분석 결과 셀 마이그레이션4,5을 평가 하기 위한, 재현, 저렴 하 고 빠른 방법입니다. 표준 분석 결과에서 상단 챔버 셀, 시드 고 낮은 챔버로 셀 이동에서 다공성 삽입으로 구분 됩니다. 원하는 시간에 셀 삽입의 밑면 마이그레이션한 고정 고 가벼운 현미경 검사 법에 의해 정량에 대 한 스테인드 될 수 있습니다. 그러나, 이러한 측정 동적 데이터 수집 하는 걸로 단일 끝점으로 데이터 수집을 제한 하 고 분석을 위한 최적의 시간 점을 결정 광범위 한 최적화를 요구할 수 있습니다. 여기, 여러 적응 chemotaxis에서 생체 외에서의 실시간, 양적 및 다중화 측정을 허용 하는 설명 합니다.
Vivo에서 학문에 대 한 기능 끝점 사용 됩니다, 즉 주어진된 조직에 세포의 특정 축적. 사전 분류 기증자 세포 입양 전송을 통해 받는 사람 동물에 소개 된다. 이러한 기증자 세포 이후에 받는 조직 수확 후 cytometry로 식별할 수 있습니다. 또한 다른 종류의 세포는 단일 받는 사람 동물 내에서 인신 매매의 결정에 대 한 수 있도록 공동 상표 전략이 이다. 이 방법은 셀 주입, 및 생리 간 동물 다양성에 대 한 계정에서 동물 간 편차를 제거합니다.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture flask</td><td>Corning</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1430</td><td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td></tr><tr><td>Cell culture dish</td><td>Corning</td><td>1007</td><td></td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>Corning</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroblok Fibronectin Insert</td><td>Corning</td><td>CB354597</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9998S</td><td></td></tr><tr><td>Human Recombinant MCP-1</td><td>Peprotech</td><td>300-04</td><td></td></tr><tr><td>Adult bovine Serum</td><td>Sigma</td><td>B9433</td><td></td></tr><tr><td>HBSS with calcium and magnesium; no phenol red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M2e plate reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX71 inverted fluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein animal health</td><td>11695-6776-2</td><td>Isofluorane anesthesia</td></tr><tr><td>Cell strainer 40um nylon</td><td>Falcon Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysing buffer</td><td>Quality Biological</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Orange CMTMR Dye</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2927</td><td>Excitation: 541nm, Emission: 565nm</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA Dye</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2925</td><td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td></tr><tr><td>5ml syringe</td><td>BD Syringe</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>1ml TB syringe</td><td>BD Syringe</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 cell line</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>100228</td><td>Excitation: 405nm, Emission: 421nm</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>115540</td><td>Excitation: 405nm, Emission: 603nm</td></tr><tr><td>96-well round bottom plate</td><td>Corning</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>LSRII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Flow cytometer</td></tr></tbody></table>

quantifying human monocyte chemotaxis in vitro and murine lymphocyte trafficking in vivo

Chemotaxis는 특정 화학 그라데이션1따라 마이그레이션. 발산은 해부학과 시간적 특이성2세포질 매매 홍보 혈 cytokines. Chemotaxis는 세포의 중요 한 기능 그리고 양이 많게 될 수 있는 다른 면역 세포에 생체 외평가. 이 원고 chemotaxis의 평가 허용 하는 방법에 설명 합니다 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서, 셀 라인 및 기본 셀을 포함 하 여 다양 한 셀 형식에 대 한. 생체 외에서플레이트 기반 포맷 허용 몇 가지 조건 동시에 비교 실시간, 1-4 헤 체 외에서 분석 결과 조건 주 작동 근 그리고 길 항 근, 소개를 조작할 수 있습니다 내에서 완료 될 수 있습니다 그리고 뿐만 아니라 chemokinesis에서 chemotaxis 차별화는 임의 운동. Vivo에서 인신 매매 평가, 대 한 면역 세포는 여러 형광 염료로 표시 고 입양 전송에 사용 될 수 있습니다. 셀의 차동 라벨 혼합된 셀 인구 함으로써 분산 감소 하 고 적절 하 게 구동된 실험에 필요한 동물의 수를 줄이고 동일한 동물에 소개 될 수 있습니다. 1 시간 만큼 적게 발생 하는 림프 조직으로 마이그레이션 하 고 여러 조직 구획을 샘플링할 수 있다. Cytometry 조직 수확에 따라 여러 종류의 세포 철새 패턴의 급속 한 양적 분석 할 수 있습니다.

Calcein 오전 염료를 사용 하는 경우 셀의 시각적 검사 레이블 통풍 관 (그림 1)를 확인 합니다. 자동화 된 형광 판독 시간이 지남에 삽입의 아래쪽에 셀 교통으로 마이그레이션을 추적 합니다. 이러한 데이터는 명확 하 게 혈 청 (그림 2A)에 의해이 응답의 확대 뿐만 아니라 MCP-1으로 셀 이동의 유도 표시. 철새 자극의 강도 따라, 신?...

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Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

인간 Monocyte Chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 Vivo에서 인신 매매 Murine 림프 구 측정

림프 구 chemotaxis 및 마이그레이션에 대 한 양적 평가 대 한 프로토콜은 면역학 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 여기, 생체 외에서 프로토콜 허용 실시간, 다중화 세포 이동의 평가 뿐만 아니라 상호 보완적인 vivo에서 기술 활성화 추적 기본 셀의 비장에 설명 되어 있습니다.

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

7.1K 조회수.  The Rockefeller University. 림프 구 chemotaxis 및 마이그레이션에 대 한 양적 평가 대 한 프로토콜은 면역학 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 여기, 생체 외에서 프로토콜 허용 실시간, 다중화 세포 이동의 평가 뿐만 아니라 상호 보완적인 vivo에서 기술 활성화 추적 기본 셀의 비장에 설명 되어 있습니다.

비디오: Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

마이 그 레이션의 인간 T 림프구 분리, 문화 및 분석 체외에서</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

연구

면역학 및 감염병학

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the transmigration of innate immune monocytes to inflammatory sites of deposited lipid called fatty streaks, which are present in arterial walls of medium to large arteries. The key pathogenic feature of lesions at this early stage of atherosclerosis is the maturation of monocytes which migrate into arteries to form foam cells or lipid-laden macrophages. Considerable evidence supports the hypothesis that risk of atherosclerosis is increased by chronic inflammatory conditions accompanying diseases such as rheumatoid arthritis and HIV, as well as general ageing, and that this risk is predicted by monocyte activation. While mouse models provide a good platform to investigate the role of monocytes in atherogenesis in vivo, they require genetic alteration of natural cholesterol metabolism and drastic alteration of normal mouse diets, and have limited suitability for the study of atherogenic influences of human comorbid diseases. This motivated us to develop a human in vitro model to measure the atherogenic potential of monocytes isolated from individuals with defined disease states. Currently, human in vitro models are limiting in that they evaluate monocyte transmigration and foam cell formation in isolation. Here we describe a protocol in which monocytes isolated from patient blood transmigrate across human endothelial cells into a type 1 collagen matrix, and their propensity to mature into foam cells in the presence or absence of exogenous lipid is measured. The protocol has been validated for the use of human monocytes purified from individuals with HIV infection and elderly HIV uninfected individuals. This model is versatile and allows monocyte transmigration and foam cell formation to be evaluated using either microscopy or flow cytometry as well as allowing the assessment of atherogenic factors present in serum or plasma.

We describe a protocol to measure transmigration by monocytes across human endothelial monolayers and their subsequent maturation into foam cells. This provides a versatile method to assess the atherogenic properties of monocytes isolated from people with different disease conditions and to evaluate factors in blood which may enhance this propensity.

Monocyte 환생 및 개인 만성 염증 성 조건에서 거품 세포 형성의 정량화

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

생체 외에서 흐름 아래 Monocyte 모집단의 채용의 동시 연구

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of monocyte-derived macrophages can impair wound healing. We showed that high fat and high sugar diets promote monocyte priming and dysfunction, converting healthy blood monocytes into a hyper chemotactic phenotype poised to differentiate into macrophages with dysregulated activation profiles and impaired phenotypic plasticity. The over-recruitment of monocyte-derived macrophages and recruitment of macrophages with dysregulated activation profiles is believed to be a major contributor to the development of chronic inflammatory diseases associated with metabolic disorders, including atherosclerosis and obesity. The goal of this protocol is to quantify the chemotactic activity of blood monocytes as a biomarker for monocyte priming and dysfunction and to characterize the macrophage phenotype blood monocytes are poised to differentiate into in these mouse models. Using single cell Western blot analysis, we show that after 24 h 33%of cells recruited into MCP-1-loaded basement membrane-derived gel plugs injected into mice are monocytes and macrophages; 58% after day 3. However, on day 5, monocyte and macrophage numbers were significantly decreased. Finally, we show that this assays also allows for the isolation of live macrophages from the surgically retrieved basement membrane-derived gel plugs, which can then be subjected to subsequent characterization by single cell Western blot analysis.

Here we present a protocol to quantify the chemotactic activity of blood monocytes in mouse models, to assess the effects of nutritional, pharmacological and genetic interventions on blood monocyte and to characterize the blood monocytes derived macrophages in mouse models using monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-loaded basement membrane-derived gel plugs.

생체 내에서 단핵구 화학 적 활동의 정량화 및 혈액 단핵구 유래 대식세포의 특성화

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex vivo transmigration system. Group 2 innate lymphoid cells (ILC2) and CD4+ T helper cells were isolated from spleens and lungs of chicken egg ovalbumin (OVA)-challenged BALB/c mice. We confirmed the expression of CCR4 on both CD4+ T cells and ILC2, comparatively. CCL17 and CCL22 are the known ligands for CCR4; therefore, using this ex vivo transmigration method we examined CCL17- and CCL22-induced movement of CCR4+ lymphocytes. To establish chemokine gradients, CCL17 and CCL22 were placed in the bottom chamber of the transmigration system. Isolated lymphocytes were then added to top chambers and over a 48 h period the lymphocytes actively migrated through 3 &#181;m pores towards the chemokine in the bottom chamber. This is an effective system for determining the chemokinetics of lymphocytes, but, understandably, does not mimic the complexities found in the in vivo organ microenvironments. This is one limitation of the method that can be overcome by the addition of in situ imaging of the organ and lymphocytes under study. In contrast, the advantage of this method is that is can be performed by an entry-level technician at a much more cost-effective rate than live imaging. As therapeutic compounds become available to enhance migration, as in the case of tumor infiltrating cytotoxic immune cells, or to inhibit migration, perhaps in the case of autoimmune diseases where immunopathology is of concern, this method can be used as a screening tool. In general, the method is effective if the chemokine of interest is consistently generating chemokinetics at a statistically higher level than the media control. In such cases, the degree of inhibition/enhancement by a given compound can be determined as well.

In this protocol, lymphocytes are placed in the top chamber of a transmigration system, separated from the bottom chamber by a porous membrane. Chemokine is added to the bottom chamber, which induces active migration along a chemokine gradient. After 48 h, lymphocytes are counted in both chambers to quantitate transmigration.

Ex Vivo 트랜스이민 시스템에서 림프구 마이그레이션 평가

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Time-lapse Imaging of Mouse Macrophage Chemotaxis

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a chemical. Chemokinesis and chemotaxis are fundamental for the mobilization and deployment of immune cells. For example, chemokines (chemotactic cytokines) can rapidly recruit circulating neutrophils and monocytes to extravascular sites of inflammation. Chemoattractant receptors belong to the large family of G protein-coupled receptors. How chemoattractant (i.e., ligand) gradients direct cell migration via G protein-coupled receptor signaling is not yet fully understood. In the field of immunology, neutrophils are popular model cells for studying chemotaxis in vitro. Here we describe a real-time two-dimensional (2D) chemotaxis assay tailored for mouse resident macrophages, which have traditionally been more difficult to study. Macrophages move at a slow pace of ~1 &#181;m/min on a 2D surface and are less well suited for point-source migration assays (e.g., migration towards the tip of a micropipette filled with chemoattractant) than neutrophils or Dictyostelium discoideum, which move an order of magnitude faster. Widely used Transwell assays are useful for studying the chemotactic activity of different substances, but do not provide information on cell morphology, velocity, or chemotactic navigation. Here we describe a time-lapse microscopy-based macrophage chemotaxis assay that allows quantification of cell velocity and chemotactic efficiency and provides a platform to delineate the transducers, signal pathways, and effectors of chemotaxis.

Here we describe methods using time-lapse, phase-contrast microscopy to image mouse resident peritoneal macrophages in a chemotactic complement C5a gradient. The protocols can be extended to other immune cells.

마우스 대식세포 화학의 시간 경과 화상 진찰

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a ...

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an attractive therapeutic target in the clinical management of affected patients. In order to further optimize strategies aiming at therapeutic regulation of pathologically imbalanced tissue infiltration of pro-inflammatory immune cells, it will be of particular importance to achieve improved insights into disease- and organ-specific homing properties of peripheral lymphocytes. The here described experimental protocol allows to monitor lung accumulation of fluorescently labeled and adoptively transferred human lymphocytes in the context of papain-induced pulmonary inflammation. In contrast to standard in vitro assays frequently used for the analysis of immune cell migration and chemotaxis, the now introduced in vivo setting takes into account lung-specific aspects of tissue organization and the influence of the complex inflammatory scenario taking place in the living murine organism. Moreover, three-dimensional cross-sectional light-sheet fluorescence microscopic imaging does not only provide quantitative data on infiltrating immune cells, but also depicts the pattern of immune cell localization within the inflamed lung. Overall, we are able to introduce an innovative technique of high value for immunological research in the field of chronic inflammatory lung diseases, which can be easily applied by following the provided step-by-step protocol.

The here introduced protocol allows characterization of the lung homing capacity of primary human lymphocytes under in vivo inflammatory conditions. Pulmonary infiltration of adoptively transferred human immune cells in a mouse model of allergic inflammation can be imaged and quantified by light-sheet fluorescence microscopy of chemically cleared lung tissue.

고급 폐 유도 빛 시트 현미경 검사 법에 따라 알레르기 염증의 Vivo 모델에서 실험에서 인간 림프 톨의 이미징

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

의학

T-Cell Kinetics의 해명: 실시간 이동 분석 방법

Real-Time In Vitro Migration Assay for Primary Murine CD8+ T Cells

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign bodies. T cell migration is a complex process that requires the coordination of many signal inputs from the environment and local immune cells, including chemokines, chemokine receptors, and adhesion molecules. Furthermore, T cell motility is influenced by dynamic surrounding environmental cues, which can alter activation state, transcriptional landscape, adhesion molecule expression, and more. In vivo, the complexity of these seemingly intertwined factors makes it difficult to distinguish individual signals that contribute to T cell migration. This protocol provides a string of methods from T cell isolation to computer-aided analysis to assess T cell migration in real-time&#160;under highly specific environmental conditions.&#160;These conditions&#160;may help&#160;elucidate mechanisms that regulate migration, improving our&#160;understanding of T cell kinetics and providing&#160;strong mechanistic evidence that is difficult&#160;to attain through animal experiments. A deeper understanding of the&#160;molecular interactions that impact cell&#160;migration is important to develop improved therapeutics.

저자 스포트라이트: T 세포 이동의 실시간 분석을 통한 질병 메커니즘 이해

This protocol providesa method of primary murine T cell isolation and time-lapse microscopy of T cell migration under specific environmental conditions with quantitative analysis.

일차 쥐 CD8+ T 세포에 대한 Real-Time In Vitro Migration Assay

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign ...

인간 Monocyte Chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 Vivo에서 인신 매매 Murine 림프 구 측정

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생체 내에서 단핵구 화학 적 활동의 정량화 및 혈액 단핵구 유래 대식세포의 특성화

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일차 쥐 CD8+ T 세포에 대한 Real-Time In Vitro Migration Assay

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