この作品は、生物医学、栄養学で、ロックフェラー大学、ロックフェラー大学でロバートソン治療開発基金、サックラー センターの医者科学者のバーナード ・ l ・ シュワルツ プログラムによって支えられた、ロックフェラー大学。

すべてのプロシージャは、ロックフェラー大学によって承認された &#39; s 機関動物ケアおよび使用委員会。すべての動物は、特定の病原体フリーの条件の下で収容された.
 1 体外 走 <ol><li>文化 THP 1 細胞 10% 牛胎児血清 (FBS) 及び 4-(2-ヒドロキシエチル)-1 を添加したロズウェル パーク記念研究所 1640 年 (RPMI 1640) 6-。piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES; 25 mM) (完全なメディア)、0.5 〜 1.0 x 10 6 セル/mL の密度を維持します</li>。
	<li>では 35 mm 細胞培養皿、30 分のカルセイン アセトキシメチルセファロスポリン (カルセイン AM; 2.5 μ M) または 37 ° C で完全な媒体の他の適切な蛍光染料を状態ごとにラベル 3.5 × 10 5 THP 1 セル 
	注: 色素は細胞膜透過性と生細胞ラベリングとの互換性である必要があります</li>。
	<li>前ウォーム プレート リーダー、37 ° C 
	注: 温度制御に加え下部の読み取り機能も必要です。移行の定量化のためのプレート リーダーに代わる 1.10.2 手順参照してくださいセル</li>。
	<li>細胞ラベリング、アッセイ プレートと下部室を準備します。
	<ol><li>使用 24 ウェル培養プレートは、ウェルあたり 1 つの条件。3 通の各条件を実行します</li>。
		<li>ハンクの追加 750 μ L &#39; s バッファー塩緩衝液 (HBSS) 25 mM HEPES と 0.1% ウシ血清アルブミン (BSA) で 24 ウェル プレートに。これは、基底のコントロールの条件として提供しています。
		750 μ L で下部室の容量を常に維持するコンパレータ条件 <ol><li>その他使用井戸. 
			注: この例では、ヒトの単球走化性因子蛋白質 1 (MCP 1) で走 7 のポジティブ コントロールとして機能します。
			<ol><li>25 mm HEPES HBSS、BSA (0.1%)、MCP 1 を組み合わせることによりアセンブル試薬の混合物 (75 ng/mL)。大人のウシ血清を使用 (2.7 %v/v) 付加的な肯定的な制御として MCP 1 。
				注: ケモカインとケモカイン濃度調査の下で走化性の軸に依存します。凍結乾燥 MCP 1 は最終濃度 50 μ g/mL の原液を作る BSA (0.1%) の蒸留水で再停止されます。これは作業溶液 10 μ g/mL に水で希釈することができます。下側の部屋にこのソリューションの 5.6 μ L を追加します</li>。
			</ol></li></ol></li> <li>下部チャンバーの構成が完了したら後は、挿入のタブがプレートの切り込みが合っていることを確認、各ウェルに多孔質の挿入を配置します 。
		注: 挿入の適切な気孔のサイズを選択します。単球とリンパ球は、3 μ m の孔径をよく実行します。いくつかの細胞のタイプおよび/またはケモカイン システムは、最適な移行のマトリックス コーティング表面を必要があります。たとえば、MCP 1 に向かって THP 1 単球走化性の測定、フィブロネクチン、コラーゲン コーティング チップをお勧めします。定量用のプレート リーダー、挿入でポリエチレンテレフタ レートなどの光非透過性のコーティングを持っている非移行の検出を防ぐためにする必要があります上のセル室 8.</li>
	</ol></li> <li>カルセイン AM と 30 分のための細胞を培養後細胞懸濁液を 15 mL の円錐管に転送します。1,000 x g で 2 分間遠心分離細胞カルセイン AM ( 図 1) の摂取量を確認するためのセルを調べます</li>。
	<li>は、真空吸引装置を使用して上清を慎重に取り外します。HEPES 25 mM を添加した無血清 RPMI 1640 年に標識細胞を洗浄します。2 分間 1,000 x g で細胞を遠心し、上澄みを廃棄します</li>。
	<li>HEPES 25 mM を添加した無血清 RPMI 1640 年に細胞を再懸濁します。セルをカウントし、セルが 1.0 〜 1.5 x 10 6 セル/mL の最終濃度になるように音量を調整します</li>。
	<li>挿入 (上院) に細胞懸濁液の分注 250 μ L.</li>
	すべての上部の小室が満たされた、優しく、プレートを持ち上げ、および移行と検出を妨げる空気泡の存在下の検査後は <li>。バブルを削除するには、最初に挿入を再配置を削除してください。失敗した場合は、バブルを穿刺し、再挿入を配置する 27 G 針を使用します</li>。
	<li>37 ° C に予め温めておいたプレート リーダーにプレートを置きます。
	<ol><li>1-3 分間隔で下から蛍光測定値を取得します。カルセイン AM を使用する場合設定、蛍光励起と放射波長 485 nm、520 nm、それぞれ。セル型およびケモカイン システムによって走化性は、通常 1-4 h 以上 ( 図 2 a) を発生します</li>。
		<li>連続測定する別の方法として、485 で倒立蛍光顕微鏡 ( 図 2 b) 励起と光の検出の能力を使用して井戸をイメージ プレート リーダーを使用して nm と 520 nm、それぞれ。低倍率を使用して、挿入の下側の大半を取り込みます。ImageJ または同様のソフトウェア 9 で画像を処理することによって細胞を定量化します</li>。
	</ol></li></ol> 2。マウスのリンパ転送養子 <ol><li><ol><li>麻酔 8-12 週の ドナー細胞の準備-気化器を用いたイソフルラン麻酔 (1-3%) と古い c57bl/6 j 男性ドナー マウス。つま先ピンチで適切な麻酔深度を確認します</li>。
		<li>は、仰臥位にマウスを配置します。メスで正中線切開、上左腹膜腔に脾臓を探します。全体の脾臓を切除し、氷の上完全なメディア (10 %fbs と 25 mM HEPES 添加 RPMI; 1 mL/脾臓) に配置します。斬首で麻酔をかけられたドナー動物の安楽死します</li>。
		<li>15 mL の円錐管に単一細胞懸濁液および伝達するシリンジのプランジャーの終わりを使用して完全なメディア (1 mL/spleen) に 40 μ m ナイロン メッシュを通して優しく脾臓組織を挽く</li>。
		<li>アンモニウム塩化カリウム (ACK) 換散の追加 4 ボリュームのバッファーし、赤血球を溶解するために室温で 5 分間インキュベートします</li>。
		<li>は常温で 2 分間 1,000 x g で細胞を遠心し、上澄みを廃棄します。赤血球は、ペレットに残る場合 ACK 換散バッファーで再懸濁します、室温で 5 分間インキュベート、2 分間 1,000 x g で細胞を遠心分離機、上澄みを廃棄します</li>。
		<li>2 - 5 10 7 セル/mL、倍濃度の完全なメディアの細胞を再懸濁します、細胞の残骸を削除する 40 μ m ナイロン メッシュを介して細胞懸濁液を株します</li>。
		蛍光染料との互換性を持つ 10 の 7 セル/受信者マウス x <li>ラベル 1 セルと 5 chloromethylfluorescein ジアセテート (最終濃度 2 μ M) 10 など、その後の固定に、保持されます。.37 ° C で 30 分間インキュベート 
		注: 2 つ以上の細胞集団を追跡するには、追加のセル人口をもつ他の蛍光染料を使用します。たとえば、ドナー細胞の一部が 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) ベンゾイルでラベル付けできますが) アミノ) tetramethylrhodamine (最終濃度 2 μ M) 11.</li>
		<li>追加 4 ボリューム HBSS 補足25 mM HEPES、し、1,000 x g で 2 分及び破棄上澄み間遠心します。1 x 10 の 8 セル/mL の最終的な集中に HEPES 25 mM を添加した HBSS でペレットを再懸濁します。
		<ol><li>1 つ以上の蛍光染料を使用している場合を維持注入直前まで区切られた細胞集団</li>。
			<li>以降の流れ cytometry 補償のための固定液 (1 mL) に各色の細胞の小さい因数 (10 μ L) を転送します</li>。
		</ol></li></ol></li> <li>リンパ球の転送 <ol><li>8-12 週の麻酔-古い c57bl/6 j 男性受信者マウスとイソフルレン (1-3%); 気化器を使用してつま先ピンチによって麻酔の深さを確認します。動物に獣医軟膏を適用 &#39; 乾燥を防ぐ s 目</li>。
		<li>簡単に渦ドナー細胞 (1 s) と該当する特異的標識細胞集団を組み合わせた 27 G、針で 0.5 と 1 mL 注射器に転送します。
		<ol><li>以降の流れフローサイトメトリー解析のための固定液 (1 mL) を混合セルの小さい因数 (10 μ L) を転送します</li>。
		</ol></li> <li>腹臥位でドナー動物を配置。わずかに突出した眼球を引き起こす目の背側の皮膚に軽度の尾圧力を適用します</li>。
		<li>は、内側に針を直接、各受信者のマウスにレトロな軌道のドナー細胞懸濁液 100 μ L を注入します。細胞を尾静脈から注射もできます</li>。
		<li>は徐々 に注射針を撤回し、回復ケージの中だけでマウスを置きます。それは意識を取り戻したまで動物を監視します。社会的なハウジングに一度完全に回復した戻る動物</li>。
	</ol></li> <li>の収集と分析 <ol><li>1 時間後麻酔気化器を用いたイソフルラン麻酔 (1-3%) と受信者マウス; つま先ピンチによって麻酔の深さを確認します。脾臓 (または興味の他の組織) の収穫 (ステップ 2.1.2。) から完全なメディア (1 mL/受信者) に各受信者のマウス。斬首で麻酔下の動物の安楽死します 。
		注: 組織収穫前に長い間隔は少なくとも 24 時間を通じて組織蓄積を増加が</li>
		<li>15 mL の円錐管に単一細胞懸濁液および伝達するシリンジのプランジャーのエンドを使用して完全なメディアに 40 μ m ナイロン メッシュを通して優しく脾臓組織を挽く</li>。
		ACK 換散の <li>追加 4 ボリュームは、バッファーに格納し、室温で 5 分間加温します。常温で 2 分間 1,000 x g で細胞懸濁液を遠心分離し、上澄みを廃棄します</li>。
		<li>染色の細胞を再懸濁しますバッファー (1% を添加したリン酸緩衝生理食塩水 FBS)。セルをカウントし、3 x 10 7 セル/mL の最終濃度に調整します。96 ウェル底板ラウンドに細胞懸濁液を 100 μ l 添加を転送します</li>。
		<li>染色細胞のフローサイトメトリーによる解析のための目的のマーカー (材料の表を参照してください)。目的のマーカーに対して蛍光標識抗体 (材料の表を参照) を追加し、, 暗闇の中 20 分のための 4 ° C で。100 μ L を追加バッファーを染色、3 分間 1,000 x g で細胞を遠心し、上澄みを廃棄します</li>。
		<li>200 μ L でペレットを再懸濁しますバッファーを染色、3 分間 1,000 x g で細胞を遠心し、上澄みを廃棄します</li>。
		<li>125 μ L 染色でペレットを再懸濁しますバッファーし、流れの cytometer 標準手順を使用を使用してサンプルを取得します 。
		注: 緑色の染料は 488 nm レーザーによって励起し、505 と 530/30 ダイクロイック フィルターで放出が検出されました。オレンジ色の染料は、561 によって興奮している nm と放出が 582/15 ダイクロイック フィルターによって検出されます。
		<ol><li>を使用して各蛍光色素を補うために 2.1.8.2 から細胞を保存します 。
			注: 励起および標識色素の発光スペクトルと一致する fluorophores が付いているビードに基づく補償を用いた準最適補償になります</li>。
			<li>の比を正確に判断するのに場合は 1 つ以上のラベル付き人口 ( 図 3) を使用して差動入力セルというラベルの付いたステップ 2.2.2.1 から保存した入力セルを使用します。計算の比率に基づく組織特定移行細胞 ( 図 4) ラベルが付けられます</li>。
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+chemokine+receptors:+positioning+cells+for+host+defense+and+immunity.">Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity.</a> Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li><li>Ponda, M. P., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+stimulation+of+CCR7+chemotaxis+due+to+coagulation+factor+XIIa-dependent+production+of+high-molecular-weight+kininogen+domain+5.">Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boyden+chamber+assay.">Boyden chamber assay.</a> Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).</li><li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li><li>Leonard, E. J., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+monocyte+chemoattractant+protein-1+(MCP-1).">Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1).</a> Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).</li><li>Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+fluorescence+based+assay+of+neurite+formation.">An automated fluorescence based assay of neurite formation.</a> J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+cell+cycle-dependent+changes+in+cell+thiol+level+by+combining+a+new+laser+dye+with+Hoechst+33342.">Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342.</a> Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).</li><li>West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+fixation+of+thiol-reactive+fluorescent+cytoplasmic+probes+for+tracking+cell+migration.">Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration.</a> J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).</li><li>Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+greater+chemotactic+network+for+lymphocyte+trafficking:+chemokines+and+beyond.">The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond.</a> Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).</li></ol>

著者がある何も開示するには

単純なを使用して免疫細胞の移動の定量化を行うことが、急速なin vitroとin vivoの両方を試金します。血清により MCP 1 グラデーションや増大に応えてひと単球の走化性を示す.生体内でドナー脾細胞特異的ラベル付けされたし、次の養子転送受信者動物から回収されました。
プレート リーダーを使用していくつかの時間のポイントをサンプリン?...

堅牢な免疫障害、感染症への対応し、自己寛容を生成するために細胞の種類の多数の複雑な時空調整が必要です。いくつかのダース ケモカイン受容体と対応する ligands が発見されているし、特定セルによって特徴づけられる提供する分子機構は特定の時間に特定の組織に向けることができます。したがって、走化性と移行を勉強して、免疫学の研究の不可欠なコンポーネントです。確かに、説明の in vitroアッセイは最近加速 C-C ケモカイン 19 と 213に向かって T 細胞の走化性走化性因子を識別するためにスクリーニング用具として使用されました。ここで説明したメソッドの目的が免疫細胞走化性の in vitroとin vivoの定量的評価を許可します。
ボイテン (細胞の遊走と浸潤) 区域の試金はセル移行4,5を評価するための安価な再現性のある、かつ迅速な方法です。標準の分析では、参院は細胞を播種し、セルが移行先下院から多孔質挿入で区切られています。希望の時間に挿入の下側に移行して細胞を固定し、光顕微鏡による定量を染色できます。しかし、そのような測定は動的なデータ コレクションを排除するシングル エンド ポイント データ収集を制限、分析のための最適な時点を決定する広範な最適化を必要とすることができます。ここでは、いくつかの適応、走化性の in vitroのリアルタイム、定量的および多重測定を許可するを説明します。
研究生体内機能の終了点を使用するすなわち与えられた組織コンパートメント内のセルの特定の蓄積。事前にラベル付けされたドナー細胞は、養子の転送を介して受信者の動物に導入されます。これらのドナー細胞は、フローサイトメトリーによる受信者組織収穫後その後識別できます。また提示は、単一の受信者動物内の別のセル型の人身売買の決定は、共同ラベリング戦略です。このメソッドは、細胞の注入、および生理学的な動物間の可変性をアカウントから動物間の変動を排除します。

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture flask</td><td>Corning</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1430</td><td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td></tr><tr><td>Cell culture dish</td><td>Corning</td><td>1007</td><td></td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>Corning</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroblok Fibronectin Insert</td><td>Corning</td><td>CB354597</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9998S</td><td></td></tr><tr><td>Human Recombinant MCP-1</td><td>Peprotech</td><td>300-04</td><td></td></tr><tr><td>Adult bovine Serum</td><td>Sigma</td><td>B9433</td><td></td></tr><tr><td>HBSS with calcium and magnesium; no phenol red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M2e plate reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX71 inverted fluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein animal health</td><td>11695-6776-2</td><td>Isofluorane anesthesia</td></tr><tr><td>Cell strainer 40um nylon</td><td>Falcon Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysing buffer</td><td>Quality Biological</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Orange CMTMR Dye</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2927</td><td>Excitation: 541nm, Emission: 565nm</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA Dye</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2925</td><td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td></tr><tr><td>5ml syringe</td><td>BD Syringe</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>1ml TB syringe</td><td>BD Syringe</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 cell line</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>100228</td><td>Excitation: 405nm, Emission: 421nm</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>115540</td><td>Excitation: 405nm, Emission: 603nm</td></tr><tr><td>96-well round bottom plate</td><td>Corning</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>LSRII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Flow cytometer</td></tr></tbody></table>

quantifying human monocyte chemotaxis in vitro and murine lymphocyte trafficking in vivo

走化性は、特定の化学勾配1に沿って移行です。ケモカインは、解剖学的および時間的特異性2細胞人身売買を促進する走化性サイトカインです。走化性リンパ球の重要な機能は、定量的にすることができます他の免疫細胞を体外評価。この原稿は、走化性の評価を可能にする方法をについて説明します体外と体内の細胞やネイティブ細胞など多様な細胞型の両方。体外、プレート ベースの形式が許可で同時にいくつかの条件の比較、リアルタイム 1-4 h.の in vitroアッセイとしてアゴニストおよびアンタゴニストを導入する条件を操作ことができます以内に完了することができますと同様ランダム運動である chemokinesis からの走化性を区別します。生体内で人身売買評価、免疫細胞を複数の蛍光色素を標識し、養子の転送に使用できます。同じ動物、差異が減少し、十分に動力を与えられた実験に必要な動物の数を減らすことに導入される混合セル人口の細胞の差動ラベリングが可能です。1 h ほどでリンパ組織への移行が発生し、複数の組織コンパートメントをサンプリングすることができます。フローサイトメトリー組織収穫できます複数の細胞のタイプの移住性パターンの迅速かつ定量的な分析。

カルセイン AM 染料を使用している場合、セルの外観検査はラベル取り込み (図 1) を確認します。自動蛍光測定値は時間をかけて挿入の下側のセル転送中の移行を追跡します。これらのデータでは、血清 (図 2 a) によって、MCP 1 に向かって細胞遊走の誘導だけでなく、この応答の増強を明確に示します。渡り鳥の刺激の強さ?...

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Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

ひと単球走化性の in VitroおよびIn Vivoマウス リンパ球の定量化

リンパ球走化性と移行の定量的評価のためのプロトコルは、免疫学の研究のための重要なツールです。ここでは、リアルタイムで、多重セル移行の評価だけでなく、生体内で相補的な技術有効にする追跡ネイティブ細胞の脾臓に、体外のプロトコルを説明します。

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

quantifying-human-monocyte-chemotaxis-vitro-murine-lymphocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

7.1K ビュー.  The Rockefeller University. リンパ球走化性と移行の定量的評価のためのプロトコルは、免疫学の研究のための重要なツールです。ここでは、リアルタイムで、多重セル移行の評価だけでなく、生体内で相補的な技術有効にする追跡ネイティブ細胞の脾臓に、体外のプロトコルを説明します。

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Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

移行のヒトTリンパ球の単離、培養および解析インビトロ</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

免疫・感染学

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the transmigration of innate immune monocytes to inflammatory sites of deposited lipid called fatty streaks, which are present in arterial walls of medium to large arteries. The key pathogenic feature of lesions at this early stage of atherosclerosis is the maturation of monocytes which migrate into arteries to form foam cells or lipid-laden macrophages. Considerable evidence supports the hypothesis that risk of atherosclerosis is increased by chronic inflammatory conditions accompanying diseases such as rheumatoid arthritis and HIV, as well as general ageing, and that this risk is predicted by monocyte activation. While mouse models provide a good platform to investigate the role of monocytes in atherogenesis in vivo, they require genetic alteration of natural cholesterol metabolism and drastic alteration of normal mouse diets, and have limited suitability for the study of atherogenic influences of human comorbid diseases. This motivated us to develop a human in vitro model to measure the atherogenic potential of monocytes isolated from individuals with defined disease states. Currently, human in vitro models are limiting in that they evaluate monocyte transmigration and foam cell formation in isolation. Here we describe a protocol in which monocytes isolated from patient blood transmigrate across human endothelial cells into a type 1 collagen matrix, and their propensity to mature into foam cells in the presence or absence of exogenous lipid is measured. The protocol has been validated for the use of human monocytes purified from individuals with HIV infection and elderly HIV uninfected individuals. This model is versatile and allows monocyte transmigration and foam cell formation to be evaluated using either microscopy or flow cytometry as well as allowing the assessment of atherogenic factors present in serum or plasma.

We describe a protocol to measure transmigration by monocytes across human endothelial monolayers and their subsequent maturation into foam cells. This provides a versatile method to assess the atherogenic properties of monocytes isolated from people with different disease conditions and to evaluate factors in blood which may enhance this propensity.

単球輪廻と慢性炎症性疾患を持つ個人から泡沫細胞の形成の定量化

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

培養血管細胞と付着性血小板白血球動員を調査する層流に基づく試金

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

体外流れ球サブポピュレーションの募集の同時研究

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of monocyte-derived macrophages can impair wound healing. We showed that high fat and high sugar diets promote monocyte priming and dysfunction, converting healthy blood monocytes into a hyper chemotactic phenotype poised to differentiate into macrophages with dysregulated activation profiles and impaired phenotypic plasticity. The over-recruitment of monocyte-derived macrophages and recruitment of macrophages with dysregulated activation profiles is believed to be a major contributor to the development of chronic inflammatory diseases associated with metabolic disorders, including atherosclerosis and obesity. The goal of this protocol is to quantify the chemotactic activity of blood monocytes as a biomarker for monocyte priming and dysfunction and to characterize the macrophage phenotype blood monocytes are poised to differentiate into in these mouse models. Using single cell Western blot analysis, we show that after 24 h 33%of cells recruited into MCP-1-loaded basement membrane-derived gel plugs injected into mice are monocytes and macrophages; 58% after day 3. However, on day 5, monocyte and macrophage numbers were significantly decreased. Finally, we show that this assays also allows for the isolation of live macrophages from the surgically retrieved basement membrane-derived gel plugs, which can then be subjected to subsequent characterization by single cell Western blot analysis.

Here we present a protocol to quantify the chemotactic activity of blood monocytes in mouse models, to assess the effects of nutritional, pharmacological and genetic interventions on blood monocyte and to characterize the blood monocytes derived macrophages in mouse models using monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-loaded basement membrane-derived gel plugs.

生体内における単球血球活性の定量化と血液単球由来マクロファージの特性化

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex vivo transmigration system. Group 2 innate lymphoid cells (ILC2) and CD4+ T helper cells were isolated from spleens and lungs of chicken egg ovalbumin (OVA)-challenged BALB/c mice. We confirmed the expression of CCR4 on both CD4+ T cells and ILC2, comparatively. CCL17 and CCL22 are the known ligands for CCR4; therefore, using this ex vivo transmigration method we examined CCL17- and CCL22-induced movement of CCR4+ lymphocytes. To establish chemokine gradients, CCL17 and CCL22 were placed in the bottom chamber of the transmigration system. Isolated lymphocytes were then added to top chambers and over a 48 h period the lymphocytes actively migrated through 3 &#181;m pores towards the chemokine in the bottom chamber. This is an effective system for determining the chemokinetics of lymphocytes, but, understandably, does not mimic the complexities found in the in vivo organ microenvironments. This is one limitation of the method that can be overcome by the addition of in situ imaging of the organ and lymphocytes under study. In contrast, the advantage of this method is that is can be performed by an entry-level technician at a much more cost-effective rate than live imaging. As therapeutic compounds become available to enhance migration, as in the case of tumor infiltrating cytotoxic immune cells, or to inhibit migration, perhaps in the case of autoimmune diseases where immunopathology is of concern, this method can be used as a screening tool. In general, the method is effective if the chemokine of interest is consistently generating chemokinetics at a statistically higher level than the media control. In such cases, the degree of inhibition/enhancement by a given compound can be determined as well.

In this protocol, lymphocytes are placed in the top chamber of a transmigration system, separated from the bottom chamber by a porous membrane. Chemokine is added to the bottom chamber, which induces active migration along a chemokine gradient. After 48 h, lymphocytes are counted in both chambers to quantitate transmigration.

排ビボ移行システムにおけるリンパ球移動の評価

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Time-lapse Imaging of Mouse Macrophage Chemotaxis

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a chemical. Chemokinesis and chemotaxis are fundamental for the mobilization and deployment of immune cells. For example, chemokines (chemotactic cytokines) can rapidly recruit circulating neutrophils and monocytes to extravascular sites of inflammation. Chemoattractant receptors belong to the large family of G protein-coupled receptors. How chemoattractant (i.e., ligand) gradients direct cell migration via G protein-coupled receptor signaling is not yet fully understood. In the field of immunology, neutrophils are popular model cells for studying chemotaxis in vitro. Here we describe a real-time two-dimensional (2D) chemotaxis assay tailored for mouse resident macrophages, which have traditionally been more difficult to study. Macrophages move at a slow pace of ~1 &#181;m/min on a 2D surface and are less well suited for point-source migration assays (e.g., migration towards the tip of a micropipette filled with chemoattractant) than neutrophils or Dictyostelium discoideum, which move an order of magnitude faster. Widely used Transwell assays are useful for studying the chemotactic activity of different substances, but do not provide information on cell morphology, velocity, or chemotactic navigation. Here we describe a time-lapse microscopy-based macrophage chemotaxis assay that allows quantification of cell velocity and chemotactic efficiency and provides a platform to delineate the transducers, signal pathways, and effectors of chemotaxis.

Here we describe methods using time-lapse, phase-contrast microscopy to image mouse resident peritoneal macrophages in a chemotactic complement C5a gradient. The protocols can be extended to other immune cells.

マウスマクロファージ・ケモタクシスのタイムラプスイメージング

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a ...

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an attractive therapeutic target in the clinical management of affected patients. In order to further optimize strategies aiming at therapeutic regulation of pathologically imbalanced tissue infiltration of pro-inflammatory immune cells, it will be of particular importance to achieve improved insights into disease- and organ-specific homing properties of peripheral lymphocytes. The here described experimental protocol allows to monitor lung accumulation of fluorescently labeled and adoptively transferred human lymphocytes in the context of papain-induced pulmonary inflammation. In contrast to standard in vitro assays frequently used for the analysis of immune cell migration and chemotaxis, the now introduced in vivo setting takes into account lung-specific aspects of tissue organization and the influence of the complex inflammatory scenario taking place in the living murine organism. Moreover, three-dimensional cross-sectional light-sheet fluorescence microscopic imaging does not only provide quantitative data on infiltrating immune cells, but also depicts the pattern of immune cell localization within the inflamed lung. Overall, we are able to introduce an innovative technique of high value for immunological research in the field of chronic inflammatory lung diseases, which can be easily applied by following the provided step-by-step protocol.

The here introduced protocol allows characterization of the lung homing capacity of primary human lymphocytes under in vivo inflammatory conditions. Pulmonary infiltration of adoptively transferred human immune cells in a mouse model of allergic inflammation can be imaged and quantified by light-sheet fluorescence microscopy of chemically cleared lung tissue.

In Vivo 光シート顕微鏡観察に基づくアレルギー性炎症の実験的肺ホーミング ヒトリンパ球のイメージング高度な

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

医学

T細胞動態の解明:リアルタイム移動解析の方法

Real-Time In Vitro Migration Assay for Primary Murine CD8+ T Cells

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign bodies. T cell migration is a complex process that requires the coordination of many signal inputs from the environment and local immune cells, including chemokines, chemokine receptors, and adhesion molecules. Furthermore, T cell motility is influenced by dynamic surrounding environmental cues, which can alter activation state, transcriptional landscape, adhesion molecule expression, and more. In vivo, the complexity of these seemingly intertwined factors makes it difficult to distinguish individual signals that contribute to T cell migration. This protocol provides a string of methods from T cell isolation to computer-aided analysis to assess T cell migration in real-time&#160;under highly specific environmental conditions.&#160;These conditions&#160;may help&#160;elucidate mechanisms that regulate migration, improving our&#160;understanding of T cell kinetics and providing&#160;strong mechanistic evidence that is difficult&#160;to attain through animal experiments. A deeper understanding of the&#160;molecular interactions that impact cell&#160;migration is important to develop improved therapeutics.

著者スポットライト:T細胞遊走のリアルタイム解析による疾患メカニズムの理解

This protocol providesa method of primary murine T cell isolation and time-lapse microscopy of T cell migration under specific environmental conditions with quantitative analysis.

マウス初代CD8+ T細胞のリアルタイムin vitro遊走アッセイ

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign ...

ひと単球走化性の in VitroおよびIn Vivoマウスリンパ球の定量化

要約

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移行のヒトTリンパ球の単離、培養および解析インビトロ

単球輪廻と慢性炎症性疾患を持つ個人から泡沫細胞の形成の定量化

培養血管細胞と付着性血小板白血球動員を調査する層流に基づく試金

体外流れ球サブポピュレーションの募集の同時研究

生体内における単球血球活性の定量化と血液単球由来マクロファージの特性化

排ビボ移行システムにおけるリンパ球移動の評価

マウスマクロファージ・ケモタクシスのタイムラプスイメージング

In Vivo 光シート顕微鏡観察に基づくアレルギー性炎症の実験的肺ホーミングヒトリンパ球のイメージング高度な

マウス初代CD8+ T細胞のリアルタイムin vitro遊走アッセイ

マウス初代CD8+ T細胞のリアルタイムin vitro遊走アッセイ

ひと単球走化性の in VitroおよびIn Vivoマウス リンパ球の定量化

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単球輪廻と慢性炎症性疾患を持つ個人から泡沫細胞の形成の定量化

培養血管細胞と付着性血小板白血球動員を調査する層流に基づく試金

体外流れ球サブポピュレーションの募集の同時研究

生体内における単球血球活性の定量化と血液単球由来マクロファージの特性化

排ビボ移行システムにおけるリンパ球移動の評価

マウスマクロファージ・ケモタクシスのタイムラプスイメージング

In Vivo 光シート顕微鏡観察に基づくアレルギー性炎症の実験的肺ホーミング ヒトリンパ球のイメージング高度な

マウス初代CD8+ T細胞のリアルタイムin vitro遊走アッセイ

マウス初代CD8+ T細胞のリアルタイムin vitro遊走アッセイ

ひと単球走化性の in VitroおよびIn Vivoマウスリンパ球の定量化

In Vivo 光シート顕微鏡観察に基づくアレルギー性炎症の実験的肺ホーミングヒトリンパ球のイメージング高度な