Name: quantifying human monocyte chemotaxis in vitro and murine lymphocyte trafficking in vivo
Uploaded: 2017-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo at JoVE.com

Bu eser Bernard L. Schwartz Program tarafından Rockefeller Üniversitesi, Robertson terapötik geliştirme Fonu, Rockefeller Üniversitesi ve Sackler Merkezi'nde hekim bilim adamları için Biyomedikal ve beslenme araştırmaları için desteklenen Rockefeller Üniversitesi.

tüm yordamları Rockefeller Üniversitesi tarafından onaylanmıştır &#39; s kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi. Bütün hayvanlar patojen-Alerjik belirli koşullar altında muhafaza.
 1. In Vitro kemotaksisi <ol><li>kültür THP-1 hücreleri % 10 fetal sığır serum (FBS) ve 4-(2-hydroxyethyl) -1 ile 6 ' Roswell Park Memorial Enstitüsü 1640 (RPMI 1640)- piperazineethanesulfonic asit (HEPES; 25 mM) (tamamlamak medya), 0.5-1.0 x 10 6 hücre/mL arasında yoğunluk bakımı.</li>
	<li>İçinde bir 35 mm hücre kültürü çanağı, koşulu ile calcein acetoxymethyl (calcein-AM; 2.5 µM) veya diğer uygun floresan boya tam medya 37 ° C'de 30 dakika süreyle başına etiket 3.5 x 10 5 THP-1 hücre 
	Not: Boyalar hücre membran geçirgen ve canlı hücre etiketleme ile uyumlu olmalıdır.</li>
	<li>Öncesi sıcak plaka okuyucu 37 ° c 
	Not: sıcaklık kontrolü yanı sıra, alt-okuma işlevi de gereklidir. Geçiş adım 1.10.2 plaka okuyucu miktar için bir alternatif için bkz: hücre.</li>
	<li>Hücreleri etiketleme iken, tahlil plaka ve alt odası hazırlamak.
	<ol><li>Kullanım 24-iyi doku kültürü plakalı iyi başına tek bir şartla. Her koşul nüsha gerçekleştirmek.</li>
		<li>Ekleyin 750 µL Hank, &#39; s 25 mM HEPES ve % 0.1 sığır serum albümin ile (BSA) 24-şey plakasına arabelleğe Buffered tuz solüsyonu (HBSS). Bu Bazal denetim koşulu olarak hizmet vermektedir.
		<ol><li>Kullanımı diğer kuyular karşılaştırıcı koşullar, her zaman toplam 750 µL adlı alt Kamara hacmindeki sürdürmek için. 
			Not: Bu örnekte, insan monosit chemoattractant protein-1 (MCP-1) kemotaksisi 7 için pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir.
			<ol><li>Araya reaktif karışımı ile birleştirerek 25 mM HEPES ile HBSS, BSA (% 0,1) ve MCP-1 (75 ng/mL). Yetişkin sığır serum kullanın (% 2.7 v / v) MCP-1 ek bir olumlu denetim olarak. 
				Not: Kemokin ve Kemokin konsantrasyon kemotaktik ekseni altında eğitim bağlı olacaktır. Liyofilize MCP-1 50 μg/mL nihai bir konsantrasyon ile hisse senedi bir çözüm sağlamak için BSA (%0.1) ile distile suda resuspended. Bunun için çalışan bir çözüm olarak 10 μg/mL suda seyreltilmiş. Bu çözümün 5.6 μL alt odasına ekleyin.</li>
			</ol></li></ol></li> <li>Alt chambers bileşimi tamamlandıktan sonra her şey sekmeler ekleme plaka çentikler ile hizalamak sağlanması, gözenekli bir INSERT yerleştirin. 
		Not: için ekler uygun gözenek boyutu seçin. 3 mikron gözenek boyutunu monosit ve lenfositler için iyi bir performans sergiliyor. Bazı hücre tipleri ve/veya Kemokin sistemleri bir matris kaplı yüzey en iyi geçiş için gerekebilir. Örneğin, THP-1 monosit kemotaksisi MCP-1 doğru ölçmek için fibronektin veya ekler kolajen kaplı önerilir. Nefelometri için plaka okuyucu için ekleme, polietilen tereftalat gibi bir ışık impermeant kaplama sigara geçiş olarak algılanmasını önlemek için olması gerekir hücrelerin üst odası 8.</li>
	</ol></li> <li>Hücreler ile calcein-AM 30 dk için kuluçka sonra hücre süspansiyon 15 mL konik tüp aktarmak. 1000 x g 2 dakika süreyle santrifüj hücreleri kontrol edin calcein-AM ( şekil 1) alımını onaylamak için hücreleri.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde bir vakum aspiratör kullanarak süpernatant çıkarın. Serum-Alerjik RPMI HEPES 25 mM ile desteklenmiş 1640 etiketli hücreleri yıkayın. Santrifüj kapasitesi 1000 x g 2 min için hücreleri ve süpernatant atın.</li>
	<li>Serum-Alerjik RPMI HEPES 25 mM ile desteklenmiş 1640 hücrelerde resuspend. Say hücreleri ve böylece hücreleri 1.0-1.5 x 10 6 hücre/mL nihai bir konsantrasyon, ses seviyesini.</li>
	<li>Hücre süspansiyon Ekle (üst Kamara) içine dağıtmak 250 μL.</li>
	Sonra tüm üst odaları doldurulmuş, yavaşça plaka kaldırın ve alt geçiş ve algılama ile girişime neden olabilir hava kabarcıkları varlığı için kontrol edin <li>. Bir kabarcık kaldırmak için ilk önce Ekle yeniden konumlandırma kaldırmayı deneyin. İşlem başarısız olursa, kabarcık ponksiyon ve ekleme yeniden konumlandırmak için 27 G iğne kullanın.</li>
	<li>Plaka Önceden ısıtılmış 37 ° C plaka okuyucuya yerleştirin.
	<ol><li>Edinme Floresans okuma 1-3 dk aralıklarla alttan. Calcein-AM kullanırken, Floresans 485 uyarma ve emisyon dalga boylarında ayarla nm ve 520 nm, anılan sıraya göre. Hücre türü ve Kemokin sistemine bağlı olarak, kemotaksis genellikle 1-4 h ( şekil 2A) üzerinden ortaya çıkar.</li>
		<li>Sürekli ölçümler alternatif olarak plaka okuyucu kullanarak görüntü bir ters floresan mikroskop ( şekil 2B) uyarma ve ışık algılama yeteneğine sahip 485 kullanarak wells nm ve 520 nm, anılan sıraya göre. Düşük bir büyütme alt ucun çoğunluğu yakalamak için kullanın. Hücreleri ImageJ veya benzer yazılım 9 görüntülerle işleyerek ölçmek.</li>
	</ol></li></ol> 2. Evlat edinen Transfer, fare lenfosit <ol><li>donör hücreleri hazırlanması <ol><li>Anesthetize 8-12 hafta-bir Buharlaştırıcı kullanarak isoflurane anestezi (% 1-3) ile eski C57BL/6J erkek donör fareler. Toe-çimdik tarafından uygun anestezi derinliği onaylayın.</li>
		<li>, Sırtüstü pozisyonda fareyi getirin. Bir ensizyon bir neşter ile yapmak ve dalak üst sol Periton boşluğu bulun. Bütün dalak tüketim ve buz üzerinde tam medya (%10 FBS ve 25 mM HEPES RPMI; 1 mL/dalak) yerleştirin. İmzalat donör hayvanlar tarafından işten çıkarma ötenazi.</li>
		<li>Komple medya (1 mL /spleen) bir tek hücre süspansiyon ve transfer 15 mL konik tüp yapmak bir şırınga dalgıç sonuna kullanarak içine grind dalak doku 40 µm naylon mesh hafifçe ile.</li>
		<li>Amonyum klorür potasyum (ACK) lizis eklemek 4 hacimleri tampon ve eritrositler koşullar için oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 2 min için 1000 x g de hücreleri santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Eritrositler Pelet içinde kalırsanız, ACK lizis arabellekte resuspend, oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya, santrifüj kapasitesi 1000 x g 2 min için hücreleri ve süpernatant atın.</li>
		<li>2-5 x 10 7 hücre/mL bir konsantrasyon, komple medya hücrelerde resuspend, daha sonra hücre süspansiyon hücre artıkları kaldırmak için 40 µm naylon mesh ile süzün.</li>
		5-chloromethylfluorescein diacetate (son konsantrasyonu 2 mikron) 10 gibi sonraki fiksasyon üzerine korunur ve <li>Etiket 1 x 10 7 hücreler/alıcı fare ile floresan boya ile uyumlu hücreleri canlı . 30 dakika süreyle 37 ° C'de kuluçkaya 
		Not: birden fazla hücre nüfus izlemek için ek hücre popülasyonlarının ile diğer floresan boyalar kullanın. Donör hücreleri bir kısmını 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) benzoil ile şekillendirebilir etiketlenir) amino) tetramethylrhodamine (son konsantrasyonu 2 mikron) 11.</li>
		<li>Eklemek 4 birimleri ile HBSS takıma 25 mM HEPES, sonra 2 dk ve atma süpernatant için 1000 x g, santrifüj. Pelet HEPES 25 mM için 1 x 10 8 hücre/mL nihai bir konsantrasyon ile takıma HBSS resuspend.
		<ol><li>Birden fazla floresan boya kullanıyorsanız, hemen önce enjeksiyon kadar ayrılmış hücre popülasyonlarının devam.</li>
			<li>Küçük aliquot (10 μL) sonraki Akış Sitometresi tazminat için bir sabitleştirici çözüm (1 mL) her renk hücrelerinin transfer.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Lenfositler transfer <ol><li>8-12 hafta anestezi-eski C57BL/6J erkek alıcı fareler bir Buharlaştırıcı; kullanarak isoflurane (% 1-3) ile ayak-çimdik tarafından anestezi derinliği onaylayın. Hayvan veteriner merhem uygulamak &#39; kurutma önlemek için gözleri.</li>
		<li>Kısaca girdap donör hücreleri (1 s) ve 1 mL enjeksiyon şırınga ile 27 G, iğne, 0.5 differentially etiketli hücre popülasyonlarının, varsa birleştirerek aktarmak.
		<ol><li>Küçük aliquot (10 μL) sonraki Akış Sitometresi Analizi için sabitleştirici çözüm (1 mL) karışık hücrelerinin transfer.</li>
		</ol></li> <li>Yüzükoyun sígara donör hayvanlar koyun. Biraz çıkıntı gözün neden göze dorsal cilt hafif Kaudal basınç uygulamak.</li>
		<li>İğne da doğrudan ve donör hücre süspansiyon, 100 µL retro-orbitally her alıcı fare enjekte. Hücre-de var enjekte kuyruk damar yolu ile.</li>
		<li>Yavaş yavaş enjeksiyon iğne geri çekilin ve fare kurtarma kafeste tek başına yerleştirin. Bilinci yerine geldi kadar hayvan izlemek; bir kez tam olarak kurtarılan dönüş hayvan sosyal konut.</li>
	</ol></li> <li>Toplama ve analiz <ol><li>sonra 1 h, isoflurane anestezi (1-%3) ile alıcı fareler bir Buharlaştırıcı kullanarak anestezi; anestezi derinliği toe-çimdik tarafından onaylamak. Dalak (ya da diğer doku ilgi) hasat (Adım 2.1.2.) her alıcı fare ve komple medya (1 mL/alıcı) yerine. İmzalat hayvanlar tarafından işten çıkarma ötenazi. 
		Not: Doku hasat öncesinde daha uzun aralıklarla en az 24 h ile doku birikimi artacak</li>
		<li>Eziyet dalak doku 40 µm naylon mesh ile yavaşça içine bir tek hücre süspansiyon ve transfer için 15 mL konik tüp yapmak bir şırınga dalgıç sonuna kullanarak komple medya.</li>
		ACK lizis <li>eklemek 4 hacimleri tampon ve oda sıcaklığında 5 dk kuluçkaya. 1000 x g oda sıcaklığında 2 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.</li>
		<li>Boyama resuspend hücreler arabellek (fosfat tamponlu tuz %1 ile desteklenmiş FBS). Hücreleri saymak ve 3 x 10 7 hücre/mL nihai bir konsantrasyon için ayarlayın. Bir 96-kuyu alt plaka yuvarlak hücre süspansiyon, 100 µL transfer.</li>
		<li>Leke hücreler için istediğiniz işaretçileri (malzemeleri tablo görmek) göre Akış Sitometresi Analizi için. Fluorophore-Birleşik antikorlar (malzemeleri tablo görmek) karşı istediğiniz işaretleyicileri ekleyin ve 20 dakika içinde belgili tanımlık karanlık 4 ° C'de kuluçkaya. 100 µL eklemek arabellek boyama, santrifüj kapasitesi 1000 x g 3 dk için hücreleri ve süpernatant atın.</li>
		<li>Pelet 200 µL resuspend tampon boyama, santrifüj kapasitesi 1000 x g 3 dk için hücreleri ve süpernatant atın.</li>
		<li>Resuspend 125 µL boyama içinde Pelet tampon ve Standart prosedürler kullanarak Akış Sitometresi kullanarak örnekleri elde. 
		Not: Yeşil boya 488 nm lazer tarafından heyecan ve emisyon 505 ve 530/30 dikroik filtreleriyle algılanır. Turuncu boya tarafından 561 heyecanlı nm ve emisyon 582/15 dikroik filtre tarafından algılandı.
		<ol><li>Kaydedilmiş hücreleri floresan her boya için telafi etmek için 2.1.8.2 gelen. 
			Not: boncuk tabanlı tazminat eşleme uyarma ve emisyon spectra etiketleme boyalar, fluorophores ile kullanılması olarak suboptimal tazminat sonuçlanır.</li>
			<li>Adım 2.2.2.1 kaydedilen giriş hücrelerden doğru oranını belirlemek için birden fazla etiketli nüfus ( şekil 3) kullanıyorsanız giriş hücresi differentially etiketli kullanın. Etiketlenmemiş hücrelere ( şekil 4) etiketli doku belirli geçiş oranı üzerinde dayalı hesaplamak.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+chemokine+receptors:+positioning+cells+for+host+defense+and+immunity.">Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity.</a> Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li><li>Ponda, M. P., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+stimulation+of+CCR7+chemotaxis+due+to+coagulation+factor+XIIa-dependent+production+of+high-molecular-weight+kininogen+domain+5.">Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boyden+chamber+assay.">Boyden chamber assay.</a> Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).</li><li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li><li>Leonard, E. J., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+monocyte+chemoattractant+protein-1+(MCP-1).">Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1).</a> Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).</li><li>Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+fluorescence+based+assay+of+neurite+formation.">An automated fluorescence based assay of neurite formation.</a> J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+cell+cycle-dependent+changes+in+cell+thiol+level+by+combining+a+new+laser+dye+with+Hoechst+33342.">Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342.</a> Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).</li><li>West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+fixation+of+thiol-reactive+fluorescent+cytoplasmic+probes+for+tracking+cell+migration.">Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration.</a> J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).</li><li>Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+greater+chemotactic+network+for+lymphocyte+trafficking:+chemokines+and+beyond.">The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond.</a> Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).</li></ol>

Yazarlar ifşa yoktur

Miktar bağışıklık hücre göç basit kullanılarak gerçekleştirilebilir ve hızlı içinde in vitro ve in vivodeneyleri. Serum tarafından bir MCP-1 degrade ve büyütme karşısında insan monosit vitro kemotaksisi göstermektedir. Vivo, donör fare splenocytes differentially etiketli ve evlat edinen transferi alıcı hayvanlardan ele geçmiştir.
Bir plaka okuyucu kullanarak birkaç zaman Puan örnekleme avantajı vardır (her 30 olarak sık s) ve g...

Güçlü bağışıklık uygun şekilde karşılık vermek için yaralanma, enfeksiyon ve self-tolerance oluşturmak için hücre tiplerinin sayısız karmaşık zamansal ve mekansal koordinasyon gerektirir. Birkaç düzine Kemokin reseptörleri ve onların karşılık gelen ligandlar keşfettim ve belirli hücreleri tarafından karakterize sağlayan moleküler mekanizmaları belirli bir zamanda belirli bir doku yönlendirilebilir. Böylece, kemotaksis ve geçiş eğitim İmmünoloji araştırma vazgeçilmez bir bileşendir. Nitekim, açıklanan vitro tahlil son zamanlarda T-hücrelerin kemotaksis C-C kemokinler 19. ve 213doğru hızlandırır kemotaktik kofaktör tanımlamak için bir tarama aracı olarak kullanıldı. Yöntem tanımlamak burada amacı olan bağışıklık hücre kemotaksisi vitro ve içinde vivonicel Değerlendirmeler izin vermek için.
Boyden (hücre göç ve işgali) odası tahlil hücre geçiş4,5değerlendirmek için ucuz, tekrarlanabilir ve hızlı bir yöntemdir. Standart tahlil üst odası hücrelerle tohumlari ve içine hücrelerin göç daha düşük bir odası den gözenekli bir ekleme tarafından ayrılmış. İstediğiniz saatte ekleme alt geçiş hücreleri sabit ve Nefelometri için ışık mikroskobu ile lekeli. Ancak, bu tür ölçümleri veri toplama dinamik veri toplama engellemektedir tek bir bitiş noktası için sınırlamak ve geniş en iyi duruma getirme analizi için en uygun zaman noktayı belirlemek için gerektirebilir. Burada, çeşitli uyarlamalar gerçek zamanlı, nicel ve çoğaltılmış ölçümlerinin kemotaksisi vitroizin açıklanmıştır.
Vivo çalışmalar için işlevsel bir bitiş noktası kullanılır, yani belirli birikimi hücre içinde verilen doku bölme. Önceden etiketli donör hücreleri evlat edinen transferi yoluyla alıcı hayvanların içine tanıtıldı. Bu donör hücreleri daha sonra alıcı doku Hasattan sonra Akış Sitometresi tarafından tespit edilebilir. Ayrıca farklı hücre türleri içinde tek bir alıcı hayvan kaçakçılığı belirlenmesi için izin veren co etiketleme bir stratejidir. Bu yöntem hücre enjeksiyon ve fizyolojik arası hayvan değişkenlik hesaplarında arası hayvan varyasyon ortadan kaldırır.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture flask</td><td>Corning</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1430</td><td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td></tr><tr><td>Cell culture dish</td><td>Corning</td><td>1007</td><td></td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>Corning</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroblok Fibronectin Insert</td><td>Corning</td><td>CB354597</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9998S</td><td></td></tr><tr><td>Human Recombinant MCP-1</td><td>Peprotech</td><td>300-04</td><td></td></tr><tr><td>Adult bovine Serum</td><td>Sigma</td><td>B9433</td><td></td></tr><tr><td>HBSS with calcium and magnesium; no phenol red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M2e plate reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX71 inverted fluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein animal health</td><td>11695-6776-2</td><td>Isofluorane anesthesia</td></tr><tr><td>Cell strainer 40um nylon</td><td>Falcon Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysing buffer</td><td>Quality Biological</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Orange CMTMR Dye</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2927</td><td>Excitation: 541nm, Emission: 565nm</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA Dye</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2925</td><td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td></tr><tr><td>5ml syringe</td><td>BD Syringe</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>1ml TB syringe</td><td>BD Syringe</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 cell line</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>100228</td><td>Excitation: 405nm, Emission: 421nm</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>115540</td><td>Excitation: 405nm, Emission: 603nm</td></tr><tr><td>96-well round bottom plate</td><td>Corning</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>LSRII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Flow cytometer</td></tr></tbody></table>

quantifying human monocyte chemotaxis in vitro and murine lymphocyte trafficking in vivo

Kemotaksis geçiş boyunca belirli bir kimyasal degrade1değil. Kemokinler hücresel anatomik ve temporal özgüllük2ile ticareti teşvik kemotaktik sitokinler vardır. Kemotaksis lenfositler kritik bir fonksiyonudur ve kantitatif olabilir diğer bağışıklık hücreleri içinde vitrodeğerlendirildi. Bu el yazması Kemotaksis, değerlendirilmesi izin yöntemleri açıklar vitro ve in vivo, hücre satırları ve yerel hücreleri de dahil olmak üzere farklı hücre türleri için. Vitro, plaka tabanlı biçimi çeşitli koşullar aynı anda içinde karşılaştırma izin verir gerçek zamanlı, 1-4 h. vitro tahlil koşullar olarak tanıtmak agonistleri ve antagonistleri, manipüle içinde tamamlandı ve su kuyusu aynı derecede kemotaksis rasgele hareket olduğu chemokinesis ayırt etmek. Vivo kaçakçılığı değerlendirmeler için bağışıklık hücreleri birden çok floresan boyalar ile etiketli ve evlat edinen transfer için kullanılan. Fark hücrelerinin etiketleme karma hücre popülasyonlarının böylece varyans azaltmak ve hayvanlar için yeterince güçlü bir deney gerekli sayısını azaltarak aynı hayvan içine sunulmasına olanak sağlar. Az 1 h olarak geçiş içine lenfoid doku oluşur ve birden fazla doku bölmeleri tatmak mümkündür. Akış Sitometresi doku hasat takip birden çok hücre tipleri göçmen kalıpları hızlı ve nicel analiz için sağlar.

Calcein-AM boya kullanırken, hücre görsel muayene etiketi alımı (şekil 1) onaylayın. Otomatik floresan okuma zaman içinde ucun alt üzerine hücreleri transit olarak geçiş izler. Bu veriler, serum (şekil 2A) tarafından bir indüksiyon hücre göç MCP-1 doğru hem de bu yanıt bir büyütme açıkça gösteriyor. Göçmen uyarıcı gücüne bağlı olarak, en az 15 dk önce sinyal artışı bir gecikme yoktur. Floresa...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo at JoVE.com

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

İnsan monosit kemotaksisi Vitro ve In Vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının

Lenfosit kemotaksis ve geçiş kantitatif değerlendirilmesi için protokolleri İmmünoloji araştırma için önemli araçlardır. Burada, bir vitro Protokolü izni gerçek zamanlı, hücre göç değerlendirilmesi yanı sıra bir tamamlayıcı vivo içinde teknik etkinleştirme izlemeyle yerli hücreleri dalak multiplexed açıklanmıştır.

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

quantifying-human-monocyte-chemotaxis-vitro-murine-lymphocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

7.1K Görüntüleme.  The Rockefeller University. Lenfosit kemotaksis ve geçiş kantitatif değerlendirilmesi için protokolleri İmmünoloji araştırma için önemli araçlardır. Burada, bir vitro Protokolü izni gerçek zamanlı, hücre göç değerlendirilmesi yanı sıra bir tamamlayıcı vivo içinde teknik etkinleştirme izlemeyle yerli hücreleri dalak multiplexed açıklanmıştır.

Video: Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Göç İnsan T Lenfosit İzolasyon, Kültür ve Analiz In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the transmigration of innate immune monocytes to inflammatory sites of deposited lipid called fatty streaks, which are present in arterial walls of medium to large arteries. The key pathogenic feature of lesions at this early stage of atherosclerosis is the maturation of monocytes which migrate into arteries to form foam cells or lipid-laden macrophages. Considerable evidence supports the hypothesis that risk of atherosclerosis is increased by chronic inflammatory conditions accompanying diseases such as rheumatoid arthritis and HIV, as well as general ageing, and that this risk is predicted by monocyte activation. While mouse models provide a good platform to investigate the role of monocytes in atherogenesis in vivo, they require genetic alteration of natural cholesterol metabolism and drastic alteration of normal mouse diets, and have limited suitability for the study of atherogenic influences of human comorbid diseases. This motivated us to develop a human in vitro model to measure the atherogenic potential of monocytes isolated from individuals with defined disease states. Currently, human in vitro models are limiting in that they evaluate monocyte transmigration and foam cell formation in isolation. Here we describe a protocol in which monocytes isolated from patient blood transmigrate across human endothelial cells into a type 1 collagen matrix, and their propensity to mature into foam cells in the presence or absence of exogenous lipid is measured. The protocol has been validated for the use of human monocytes purified from individuals with HIV infection and elderly HIV uninfected individuals. This model is versatile and allows monocyte transmigration and foam cell formation to be evaluated using either microscopy or flow cytometry as well as allowing the assessment of atherogenic factors present in serum or plasma.

We describe a protocol to measure transmigration by monocytes across human endothelial monolayers and their subsequent maturation into foam cells. This provides a versatile method to assess the atherogenic properties of monocytes isolated from people with different disease conditions and to evaluate factors in blood which may enhance this propensity.

Miktar monosit hicret ve köpük hücre oluşumu kronik inflamatuar koşullara sahip bireylerden

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

Lökosit işe kültürlü damar hücreleri ve yapışık trombositler üzerinde araştırmak için Laminar akış tabanlı deneyleri

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

Monosit altgrupları Vitro akışında altında alımı eş zamanlı çalışma

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of monocyte-derived macrophages can impair wound healing. We showed that high fat and high sugar diets promote monocyte priming and dysfunction, converting healthy blood monocytes into a hyper chemotactic phenotype poised to differentiate into macrophages with dysregulated activation profiles and impaired phenotypic plasticity. The over-recruitment of monocyte-derived macrophages and recruitment of macrophages with dysregulated activation profiles is believed to be a major contributor to the development of chronic inflammatory diseases associated with metabolic disorders, including atherosclerosis and obesity. The goal of this protocol is to quantify the chemotactic activity of blood monocytes as a biomarker for monocyte priming and dysfunction and to characterize the macrophage phenotype blood monocytes are poised to differentiate into in these mouse models. Using single cell Western blot analysis, we show that after 24 h 33%of cells recruited into MCP-1-loaded basement membrane-derived gel plugs injected into mice are monocytes and macrophages; 58% after day 3. However, on day 5, monocyte and macrophage numbers were significantly decreased. Finally, we show that this assays also allows for the isolation of live macrophages from the surgically retrieved basement membrane-derived gel plugs, which can then be subjected to subsequent characterization by single cell Western blot analysis.

Here we present a protocol to quantify the chemotactic activity of blood monocytes in mouse models, to assess the effects of nutritional, pharmacological and genetic interventions on blood monocyte and to characterize the blood monocytes derived macrophages in mouse models using monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-loaded basement membrane-derived gel plugs.

İn Vivo Monosit Kemotaktik Aktivitenin Ölçülmesi ve Kan Monosit Türevi Makrofajların Karakterizasyonu

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex vivo transmigration system. Group 2 innate lymphoid cells (ILC2) and CD4+ T helper cells were isolated from spleens and lungs of chicken egg ovalbumin (OVA)-challenged BALB/c mice. We confirmed the expression of CCR4 on both CD4+ T cells and ILC2, comparatively. CCL17 and CCL22 are the known ligands for CCR4; therefore, using this ex vivo transmigration method we examined CCL17- and CCL22-induced movement of CCR4+ lymphocytes. To establish chemokine gradients, CCL17 and CCL22 were placed in the bottom chamber of the transmigration system. Isolated lymphocytes were then added to top chambers and over a 48 h period the lymphocytes actively migrated through 3 &#181;m pores towards the chemokine in the bottom chamber. This is an effective system for determining the chemokinetics of lymphocytes, but, understandably, does not mimic the complexities found in the in vivo organ microenvironments. This is one limitation of the method that can be overcome by the addition of in situ imaging of the organ and lymphocytes under study. In contrast, the advantage of this method is that is can be performed by an entry-level technician at a much more cost-effective rate than live imaging. As therapeutic compounds become available to enhance migration, as in the case of tumor infiltrating cytotoxic immune cells, or to inhibit migration, perhaps in the case of autoimmune diseases where immunopathology is of concern, this method can be used as a screening tool. In general, the method is effective if the chemokine of interest is consistently generating chemokinetics at a statistically higher level than the media control. In such cases, the degree of inhibition/enhancement by a given compound can be determined as well.

In this protocol, lymphocytes are placed in the top chamber of a transmigration system, separated from the bottom chamber by a porous membrane. Chemokine is added to the bottom chamber, which induces active migration along a chemokine gradient. After 48 h, lymphocytes are counted in both chambers to quantitate transmigration.

Ex Vivo Transmigration Sisteminde Lenfosit Göçünün Değerlendirilmesi

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Time-lapse Imaging of Mouse Macrophage Chemotaxis

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a chemical. Chemokinesis and chemotaxis are fundamental for the mobilization and deployment of immune cells. For example, chemokines (chemotactic cytokines) can rapidly recruit circulating neutrophils and monocytes to extravascular sites of inflammation. Chemoattractant receptors belong to the large family of G protein-coupled receptors. How chemoattractant (i.e., ligand) gradients direct cell migration via G protein-coupled receptor signaling is not yet fully understood. In the field of immunology, neutrophils are popular model cells for studying chemotaxis in vitro. Here we describe a real-time two-dimensional (2D) chemotaxis assay tailored for mouse resident macrophages, which have traditionally been more difficult to study. Macrophages move at a slow pace of ~1 &#181;m/min on a 2D surface and are less well suited for point-source migration assays (e.g., migration towards the tip of a micropipette filled with chemoattractant) than neutrophils or Dictyostelium discoideum, which move an order of magnitude faster. Widely used Transwell assays are useful for studying the chemotactic activity of different substances, but do not provide information on cell morphology, velocity, or chemotactic navigation. Here we describe a time-lapse microscopy-based macrophage chemotaxis assay that allows quantification of cell velocity and chemotactic efficiency and provides a platform to delineate the transducers, signal pathways, and effectors of chemotaxis.

Here we describe methods using time-lapse, phase-contrast microscopy to image mouse resident peritoneal macrophages in a chemotactic complement C5a gradient. The protocols can be extended to other immune cells.

Fare Makrofaj Kemotaksisinin Hızlandırılmış Görüntülemesi

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a ...

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an attractive therapeutic target in the clinical management of affected patients. In order to further optimize strategies aiming at therapeutic regulation of pathologically imbalanced tissue infiltration of pro-inflammatory immune cells, it will be of particular importance to achieve improved insights into disease- and organ-specific homing properties of peripheral lymphocytes. The here described experimental protocol allows to monitor lung accumulation of fluorescently labeled and adoptively transferred human lymphocytes in the context of papain-induced pulmonary inflammation. In contrast to standard in vitro assays frequently used for the analysis of immune cell migration and chemotaxis, the now introduced in vivo setting takes into account lung-specific aspects of tissue organization and the influence of the complex inflammatory scenario taking place in the living murine organism. Moreover, three-dimensional cross-sectional light-sheet fluorescence microscopic imaging does not only provide quantitative data on infiltrating immune cells, but also depicts the pattern of immune cell localization within the inflamed lung. Overall, we are able to introduce an innovative technique of high value for immunological research in the field of chronic inflammatory lung diseases, which can be easily applied by following the provided step-by-step protocol.

The here introduced protocol allows characterization of the lung homing capacity of primary human lymphocytes under in vivo inflammatory conditions. Pulmonary infiltration of adoptively transferred human immune cells in a mouse model of allergic inflammation can be imaged and quantified by light-sheet fluorescence microscopy of chemically cleared lung tissue.

Akciğer yolu bulabilen insan lenfosit içinde deneysel bir alerjik iltihap ışık sayfalık mikroskobu üzerinde dayalı, Vivo modeli görüntüleme gelişmiş

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

Tıp

T-Hücresi Kinetiğinin Aydınlatılması: Gerçek Zamanlı Migrasyon Analizi Yöntemleri

Real-Time In Vitro Migration Assay for Primary Murine CD8+ T Cells

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign bodies. T cell migration is a complex process that requires the coordination of many signal inputs from the environment and local immune cells, including chemokines, chemokine receptors, and adhesion molecules. Furthermore, T cell motility is influenced by dynamic surrounding environmental cues, which can alter activation state, transcriptional landscape, adhesion molecule expression, and more. In vivo, the complexity of these seemingly intertwined factors makes it difficult to distinguish individual signals that contribute to T cell migration. This protocol provides a string of methods from T cell isolation to computer-aided analysis to assess T cell migration in real-time&#160;under highly specific environmental conditions.&#160;These conditions&#160;may help&#160;elucidate mechanisms that regulate migration, improving our&#160;understanding of T cell kinetics and providing&#160;strong mechanistic evidence that is difficult&#160;to attain through animal experiments. A deeper understanding of the&#160;molecular interactions that impact cell&#160;migration is important to develop improved therapeutics.

Yazar Spotlight: T Hücresi Göçünün Gerçek Zamanlı Analizi ile Hastalık Mekanizmalarını Anlamak

This protocol providesa method of primary murine T cell isolation and time-lapse microscopy of T cell migration under specific environmental conditions with quantitative analysis.

Primer Murin CD8 + T Hücreleri için Gerçek Zamanlı İn Vitro Migrasyon Testi

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign ...

İnsan monosit kemotaksisi Vitro ve In Vivo kaçakçılığı fare lenfosit miktarının

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Göç İnsan T Lenfosit İzolasyon, Kültür ve Analiz In Vitro

Miktar monosit hicret ve köpük hücre oluşumu kronik inflamatuar koşullara sahip bireylerden

Lökosit işe kültürlü damar hücreleri ve yapışık trombositler üzerinde araştırmak için Laminar akış tabanlı deneyleri

Monosit altgrupları Vitro akışında altında alımı eş zamanlı çalışma

İn Vivo Monosit Kemotaktik Aktivitenin Ölçülmesi ve Kan Monosit Türevi Makrofajların Karakterizasyonu

Ex Vivo Transmigration Sisteminde Lenfosit Göçünün Değerlendirilmesi

Fare Makrofaj Kemotaksisinin Hızlandırılmış Görüntülemesi

Akciğer yolu bulabilen insan lenfosit içinde deneysel bir alerjik iltihap ışık sayfalık mikroskobu üzerinde dayalı, Vivo modeli görüntüleme gelişmiş

Primer Murin CD8 + T Hücreleri için Gerçek Zamanlı İn Vitro Migrasyon Testi

Primer Murin CD8 + T Hücreleri için Gerçek Zamanlı İn Vitro Migrasyon Testi