Name: quantifying human monocyte chemotaxis in vitro and murine lymphocyte trafficking in vivo
Uploaded: 2017-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
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Questo lavoro è stato supportato dal programma di Bernard L. Schwartz per gli scienziati di medico presso la Rockefeller University, il fondo di sviluppo terapeutico Robertson presso la Rockefeller University e la Sackler Center per la biomedicina e nutrizione ricerca presso la Rockefeller University.

tutte le procedure sono state approvate dal Rockefeller University &#39; s istituzionale Animal Care e Comitato di uso. Tutti gli animali sono stati alloggiati in condizioni da organismi patogeni specifiche.
 1. chemiotassi In Vitro <ol><li>cultura THP-1 cellule 6 nel 1640 di Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) completati con 10% siero bovino fetale (FBS) e 4-(2-idrossietil) -1- acido piperazineethanesulfonic (HEPES; 25 mM) (completo di media), mantenendo la densità tra 0,5-1,0 x 10 6 cellule/mL.</li>
	<li>Coltura di cellule in un 35 mm piatto, etichetta 3,5 x 10 5 THP-1 cellule per condizione con calceina acetossimetil (calceina-AM; 2,5 µM) o altre adatta tintura fluorescente nei media completi a 37 ° C per 30 min. 
	Nota: Coloranti devono essere permeabile della membrana cellulare e compatibile con cellule vive etichettatura.</li>
	<li>Pre-caldo un lettore di piastra a 37 ° C. 
	Nota: Oltre a controllo di temperatura, funzione inferiore-lettura è anche richiesto. Vedere il punto 1.10.2 per un'alternativa a un lettore di piastra per la quantificazione della migrazione cellule.</li>
	<li>Mentre le cellule sono etichettatura, preparare la piastra di dosaggio e la camera bassa.
	Piastra <ol><li>uso una cultura di tessuto 24 pozzetti, con una condizione per pozzetto. Eseguire ogni condizione in triplice copia.</li>
		<li>Aggiungere 750 µ l di Hank &#39; s soluzione salina tamponata (HBSS) tamponata con 25mm HEPES e 0,1% di sieroalbumina bovina (BSA) per la piastra a 24 pozzetti. Questo serve come la condizione basale di controllo.
		<ol><li>Uso altri pozzi per le condizioni di comparatore, mantenendo sempre il volume totale nel vano inferiore a 750 µ l. 
			Nota: In questo esempio, umano monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) serve come controllo positivo per chemiotassi 7.
			<ol><li>Assemblare la miscela reagente combinando HBSS con 25mm HEPES, BSA (0,1%) e MCP-1 (75 ng/mL). Utilizzare siero bovino adulto (2,7% v / v) con MCP-1 come un controllo positivo aggiuntivo. 
				Nota: Concentrazione delle chemochine e chemochine dipenderà l'asse chemiotattica sotto studio. Liofilizzato di MCP-1 è risospeso in acqua distillata con BSA (0,1%) per fare una soluzione di riserva con una concentrazione finale di 50 μg/mL. Questo può essere diluito in acqua per una soluzione di lavoro di 10 μg/mL. Aggiungere 5,6 μL della soluzione per la camera inferiore.</li>
			</ol></li></ol></li> <li>Dopo aver completata la composizione delle sezioni inferiore, collocare un inserto poroso in ciascun pozzetto, assicurando che le schede dell'inserto allineano con le tacche della piastra. 
		Nota: Scegliere il formato del poro appropriato per gli inserti. Per i monociti e linfociti, un diametro dei pori di 3 μm si comporta bene. Alcuni tipi di cellule e/o sistemi di chemokine possono richiedere una superficie verniciata a matrice per migrazione ottimale. Ad esempio, per misurare la chemiotassi di monociti THP-1 verso MCP-1, fibronectina o rivestite con collagene inserti sono raccomandati. Per il lettore per la quantificazione, l'inserto deve avere un rivestimento luce-impermeant, come polietilene tereftalato, per impedire il rilevamento di migrazione non celle nella parte superiore dell'alloggiamento 8.</li>
	</ol></li> <li>Dopo incubazione le cellule per 30 min con calceina-AM, trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15mL. Cellule di centrifugare a 1.000 x g per 2 min. Ispezionare visivamente le cellule per confermare l'assorbimento di calceina-AM ( Figura 1).</li>
	<li>Rimuovere con cautela il supernatante utilizzando un aspiratore. Lavare le cellule con etichettate in privo di siero RPMI 1640 completati con 25mm HEPES. Centrifugare le cellule a 1.000 x g per 2 minuti e scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere le cellule in privo di siero RPMI 1640 completati con 25mm HEPES. Contare le celle e regolare il volume in modo che le cellule sono ad una concentrazione finale di 1.0-1.5 x 10 6 cellule/mL.</li>
	<li>Dispensare 250 μL della sospensione delle cellule nell'inserto (camera superiore).</li>
	<li>Dopo che tutte le camere superiori sono state riempite, delicatamente sollevare la piastra e ispezionare la parte inferiore per la presenza di bolle d'aria che potrebbero interferire con la migrazione e la rilevazione. Per rimuovere una bolla, prima di provare a rimuovere poi ri-posizionamento dell'inserto. In caso contrario, utilizzare un ago 27G per bucare la bolla e quindi riposizionare l'inserto.</li>
	<li>Collocare la piastra nel lettore di piastra preriscaldata 37 ° C.
	<ol><li>Letture di fluorescenza di acquisire dal fondo ad intervalli di 1-3 min. Quando si utilizza calceina-AM, impostare la fluorescenza lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione a 485 nm e 520 nm, rispettivamente. A seconda del sistema di tipo e chemochine cella, chemiotassi si verifica in genere oltre 1-4 h ( Figura 2A).</li>
		<li>Come alternativa alle misurazioni continue di immagine utilizzando un lettore di piastra, pozzi usando un microscopio fluorescente invertito ( Figura 2B), in grado di eccitazione e di rilevamento della luce a 485 nm e 520 nm, rispettivamente. Utilizzare un basso ingrandimento per acquisire la maggior parte della parte inferiore dell'inserto. Quantificare le cellule di elaborazione delle immagini con ImageJ o simili software 9.</li>
	</ol></li></ol> 2. Trasferimento adottivo di linfociti murini <ol><li>preparazione delle cellule erogarici <ol><li>Anesthetize 8-12 settimana-vecchi topi di donatore maschio C57BL/6J con isoflurano anestesia (1-3%) utilizzando un vaporizzatore. Confermare appropriata profondità dell'anestesia di punta-pizzico.</li>
		<li>Posizionare il mouse nella posizione supina. Fare un'incisione del midline con un bisturi e individuare la milza nello spazio peritoneale superiore di sinistra. Asportare la milza intera e metterli in media completi (RPMI completato con 10% FBS e 25mm HEPES; 1 mL/milza) su ghiaccio. Eutanasia di animali anestetizzati donatori per decapitazione.</li>
		<li>Macinare tessuto della milza delicatamente attraverso 40 µm in nylon mesh in completa per i media (1ml /spleen) usando l'estremità di un stantuffo della siringa per fare una cella singola sospensione e trasferimento di una provetta conica da 15 mL.</li>
		<li>Aggiungere 4 volumi di lisi di ammonio cloruro potassio (ACK) buffer e incubare per 5 min a temperatura ambiente per lisare gli eritrociti.</li>
		<li>Centrifugare le cellule a 1.000 x g per 2 min a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante. Se gli eritrociti rimangono nel pellet, risospendere in buffer di lisi ACK, incubare per 5 min a temperatura ambiente, centrifugare le cellule a 1.000 x g per 2 min e gettare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere le cellule in completa per i media ad una concentrazione di 2-5 x 10 7 cellule/mL, quindi colare la sospensione cellulare attraverso una rete di nylon di 40 µm per rimuovere i detriti cellulari.</li>
		<li>Etichetta 1 x 10 7 mouse di cellule/destinatario con un colorante fluorescente compatibile con cellule vive e che sarà mantenuto anche dopo la fissazione successiva, ad esempio 5-chloromethylfluorescein diacetato (concentrazione finale 2 μM) 10 . Incubare a 37 ° C per 30 min. 
		Nota: Per tenere traccia di più di una popolazione di cellule, utilizzare altri coloranti fluorescenti con popolazioni di altre cellule. Se, ad esempio, una porzione delle cellule erogarici possa essere etichettata con 5-(and-6)-(((4-chloromethyl) benzoile) ammino) tetrametilrodamina (concentrazione finale 2 μM) 11.</li>
		<li>Aggiungere 4 volumi HBSS completati con 25mm HEPES, poi Centrifugare a 1.000 x g per 2 minuti e scartare surnatante. Risospendere il pellet in HBSS completati con 25mm HEPES ad una concentrazione finale di 1 x 10 8 cellule/mL.
		<ol><li>Se si utilizza più di un colorante fluorescente, mantenere popolazioni cellulari separate fino al momento immediatamente precedente iniezione.</li>
			<li>Trasferire una piccola aliquota (10 μL) delle cellule di ogni colore a una soluzione fissante (1 mL) per compensazione di cytometry di flusso successivo.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Trasferimento dei linfociti <ol><li>anestetizzare 8-12 settimana-vecchio C57BL/6J topi maschi destinatari con isoflurano (1-3%) utilizzando un vaporizzatore; confermare la profondità dell'anestesia di punta-pizzico. Applicare unguento veterinario animale &#39; gli occhi per evitare l'essiccazione.</li>
		<li>Brevemente le cellule erogarici vortice (1 s) e trasferimento a siringa di iniezione da 1 mL con 27 G, 0,5 in ago, combinando le popolazioni delle cellule differenzialmente etichettati, se applicabile.
		<ol><li>Una piccola aliquota (10 μL): trasferimento di cellule miste a una soluzione fissante (1 mL) per le analisi di citometria a flusso successivo.</li>
		</ol></li> <li>Posto animali donatori in posizione prona. Applicare pressione caudale lieve sulla pelle dorsale per l'occhio, causando il bulbo oculare a sporgere leggermente.</li>
		<li>Dirigere l'ago medialmente e iniettare 100 µ l di sospensione cellulare donatore retrò-orbitally in ogni destinatario mouse. Cellule possono anche essere iniettate tramite vena caudale.</li>
		<li>, Gradualmente, ritirare l'ago per iniezione e posizionare il mouse da solo in una gabbia di recupero. Animale di monitor fino a quando ha riacquistato coscienza; una volta completamente recuperato ritorno l'animale all'housing sociale.</li>
	</ol></li> <li>Raccolta e l'analisi <ol><li>dopo 1 h, anestetizzare destinatari topi con isoflurano anestesia (1-3%) utilizzando un vaporizzatore; confermare la profondità dell'anestesia di punta-pizzico. Raccogliere la milza (o altri tessuti di interesse) (punto 2.1.2.) da ogni destinatario mouse e posto in un supporto completo (1 mL/destinatario). Eutanasia di animali anestetizzati per decapitazione. 
		Nota: Gli intervalli più lunghi prima del raccolto del tessuto aumenterà accumulo di tessuto attraverso almeno 24 h.</li>
		<li>Macinare tessuto della milza delicatamente attraverso 40 µm in nylon mesh in completa per i media usando la parte di un stantuffo della siringa per fare una cella singola sospensione e trasferimento per provetta conica da 15 mL.</li>
		<li>Aggiungere 4 volumi di lisi ACK buffer e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare la sospensione cellulare a 1.000 x g per 2 min a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere le cellule in colorazione buffer (tampone fosfato salino completato con 1% FBS). Contare le celle e regolare a una concentrazione finale di 3 x 10 7 cellule/mL. Trasferire 100 µ l di sospensione cellulare a un 96 pozzetti fondo piatto rotondo.</li>
		<li>Cellule di macchia per marcatori desiderati (vedere la tabella materiali) per l'analisi di citometria a flusso. Aggiungere anticorpi coniugati fluoroforo (Vedi la tabella materiali) contro marcatori desiderati e incubare a 4 ° C per 20 min al buio. Aggiungere 100 µ l tampone di colorazione, centrifugare le cellule a 1.000 x g per 3 minuti e scartare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere il pellet in 200 µ l tampone di colorazione, centrifugare le cellule a 1.000 x g per 3 minuti e scartare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere il pellet in macchiatura di 125 µ l tampone e acquisire campioni usando un cytometer di flusso utilizzando le procedure standard. 
		Nota: Il colorante verde viene eccitato da un laser a 488 nm e l'emissione viene rilevata con filtri dicroici 505 e 530/30. Il colorante arancio viene eccitato da un 561 nm e l'emissione viene rilevata da un filtro dicroico 582/15.
		<ol><li>Uso salvato le cellule dalla 2.1.8.2 per compensare ogni tintura fluorescente. 
			Nota: Utilizzando la compensazione basata sul tallone con fluorofori l'eccitazione e spettri di emissione delle tinture d'etichettatura corrispondenti si tradurrà in compensazione suboptimali.</li>
			<li>Utilizzare le celle di input salvate dal punto 2.2.2.1 per determinare con precisione il rapporto tra differenzialmente etichettato celle di input se si utilizza più di una popolazione con etichetta ( Figura 3). Calcolare la migrazione specifica del tessuto sulla base del rapporto di etichettati alle cellule senza etichetta ( Figura 4).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+chemokine+receptors:+positioning+cells+for+host+defense+and+immunity.">Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity.</a> Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li><li>Ponda, M. P., Breslow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+stimulation+of+CCR7+chemotaxis+due+to+coagulation+factor+XIIa-dependent+production+of+high-molecular-weight+kininogen+domain+5.">Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boyden+chamber+assay.">Boyden chamber assay.</a> Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).</li><li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+(THP-1).">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li><li>Leonard, E. J., Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+monocyte+chemoattractant+protein-1+(MCP-1).">Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1).</a> Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).</li><li>Crouch, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+fluorescence+based+assay+of+neurite+formation.">An automated fluorescence based assay of neurite formation.</a> J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+cell+cycle-dependent+changes+in+cell+thiol+level+by+combining+a+new+laser+dye+with+Hoechst+33342.">Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342.</a> Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).</li><li>West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+fixation+of+thiol-reactive+fluorescent+cytoplasmic+probes+for+tracking+cell+migration.">Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration.</a> J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).</li><li>Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+greater+chemotactic+network+for+lymphocyte+trafficking:+chemokines+and+beyond.">The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond.</a> Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Quantificazione della migrazione delle cellule immuni può essere compiuta usando semplice e veloce saggi sia in vitro che in vivo. Dimostriamo la chemiotassi in vitro di monociti umani in risposta un gradiente di MCP-1 e l'aumento di siero. In vivo, gli splenocytes murini donatore differenzialmente sono stati etichettati e a seguito di trasferimento adottivo, sono stati recuperati dal destinatari animali.
Utilizzando un lettore di piastra ha il vantaggio di...

Robusta immunità richiede il complesso coordinamento temporale e spaziale di una miriade di tipi di cellule al fine di rispondere in modo appropriato alla lesione, infezione e generare auto-tolleranza. Parecchi dozzina recettori per le chemochine e loro corrispondenti ligandi sono stati scoperti e caratterizzati fornendo meccanismi molecolari da cui le cellule specifiche possono essere diretto in un tessuto specifico in un momento specifico. Pertanto, studiare chemiotassi e migrazione è una componente indispensabile di ricerca in immunologia. Infatti, l'analisi descritta in vitro è stata recentemente usata come uno strumento di screening per identificare un cofattore chemiotattico che accelera la chemiotassi delle cellule T verso C-C chemochine 19 e 213. Lo scopo dei metodi descritti qui sono per consentire valutazioni quantitative della chemiotassi delle cellule immuni in vitro e in vivo.
L'analisi della camera di Boyden (migrazione cellulare e invasione) è un metodo poco costoso, riproducibile e rapido per valutare la migrazione cellulare4,5. In analisi standard, camera superiore è seminata con le cellule ed è separata da un inserto poroso da un alloggiamento più basso, in cui le cellule migrano. Al momento desiderato, le cellule che hanno migrato alla parte inferiore dell'inserto possono essere fissa e macchiate per quantificazione di microscopia chiara. Tuttavia, tali misure vincolano la raccolta di dati di un singolo punto di fine, che preclude la raccolta di dati dinamica e possono richiedere la vasta ottimizzazione per determinare il punto di tempo ottimale per l'analisi. Qui, diversi adattamenti sono descritti che consentono misurazioni in tempo reale, quantitative e multiplex di chemiotassi in vitro.
Per in vivo gli studi, viene utilizzato un punto di fine funzionale, vale a dire l'accumulo specifico delle cellule in un vano dato tessuto. Le cellule erogarici pre-etichettata vengono introdotti in animali destinatari attraverso trasferimento adottivo. Queste cellule del donatore possono essere identificate successivamente tramite flusso cytometry dopo il raccolto di destinatario del tessuto. È anche presentata una strategia co-etichettatura che consente per la determinazione del traffico di tipi differenti delle cellule all'interno di un singolo animale destinatario. Questo metodo elimina la variazione inter-animale da iniezione di cellule e conti per fisiologica variabilità.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture flask</td><td>Corning</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1430</td><td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td></tr><tr><td>Cell culture dish</td><td>Corning</td><td>1007</td><td></td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>Corning</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroblok Fibronectin Insert</td><td>Corning</td><td>CB354597</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9998S</td><td></td></tr><tr><td>Human Recombinant MCP-1</td><td>Peprotech</td><td>300-04</td><td></td></tr><tr><td>Adult bovine Serum</td><td>Sigma</td><td>B9433</td><td></td></tr><tr><td>HBSS with calcium and magnesium; no phenol red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M2e plate reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX71 inverted fluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein animal health</td><td>11695-6776-2</td><td>Isofluorane anesthesia</td></tr><tr><td>Cell strainer 40um nylon</td><td>Falcon Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysing buffer</td><td>Quality Biological</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Orange CMTMR Dye</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2927</td><td>Excitation: 541nm, Emission: 565nm</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA Dye</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C2925</td><td>Excitation: 485nm, Emission: 520nm</td></tr><tr><td>5ml syringe</td><td>BD Syringe</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>1ml TB syringe</td><td>BD Syringe</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 cell line</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>100228</td><td>Excitation: 405nm, Emission: 421nm</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>115540</td><td>Excitation: 405nm, Emission: 603nm</td></tr><tr><td>96-well round bottom plate</td><td>Corning</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>LSRII</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Flow cytometer</td></tr></tbody></table>

quantifying human monocyte chemotaxis in vitro and murine lymphocyte trafficking in vivo

La chemiotassi è migrazione lungo un gradiente chimico specifico1. Le chemochine sono citochine chemiotattiche che promuovono il traffico cellulare con specificità anatomiche e temporale2. La chemiotassi è una funzione critica dei linfociti e altre cellule immuni che possono essere quantitativamente valutata in vitro. Questo manoscritto descrive i metodi che consentono la valutazione della chemiotassi, sia in vitro che in vivo, per tipi cellulari diversi tra cui linee cellulari e cellule native. Lo in vitro, formato basato su piastra permette il confronto delle diverse condizioni contemporaneamente in tempo reale e può essere completato entro 1-4 h. In vitro analisi condizioni possono essere manipolate per introdurre gli agonisti e antagonisti, come bene come differenziare la chemiotassi da chemokinesis, che è il movimento casuale. Per le valutazioni traffico in vivo , le cellule immuni possono essere contrassegnate con le tinture fluorescenti più e utilizzate per trasferimento adottivo. L'etichettatura differenziale delle cellule consente di popolazioni di cellule miste ad essere introdotti nello stesso animale, quindi diminuendo la varianza e riducendo il numero di animali necessari per un esperimento adeguatamente alimentato. Migrazione nel tessuto linfoide si verifica in meno di 1 h e compartimenti multipli possono essere campionati. Citometria a flusso successivo vendemmia del tessuto permette un'analisi rapida e quantitativa dei flussi migratori di più tipi di cellule.

Quando si utilizza il colorante calceina-AM, ispezione visiva delle cellule confermerà l'assorbimento etichetta (Figura 1). Letture di fluorescente automatizzate terrà traccia migrazione come transito di cellule sulla parte inferiore dell'inserto nel corso del tempo. Questi dati mostrano chiaramente un'induzione della migrazione cellulare verso MCP-1, così come un aumento di questa risposta dal siero (Figura 2A). A seconda del...

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Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Quantificazione del linfocita murino traffico In Vivo e chemiotassi del monocito umano In Vitro

Protocolli per la valutazione quantitativa della chemiotassi dei linfociti e la migrazione sono strumenti importanti per la ricerca in immunologia. Qui, un protocollo in vitro è descritto che permette in tempo reale, multiplexed valutazione della migrazione cellulare, così come un complementare in vivo tecnica abilitazione rilevamento di cellule native alla milza.

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

7.1K Views.  The Rockefeller University. Protocolli per la valutazione quantitativa della chemiotassi dei linfociti e la migrazione sono strumenti importanti per la ricerca in immunologia. Qui, un protocollo in vitro è descritto che permette in tempo reale, multiplexed valutazione della migrazione cellulare, così come un complementare in vivo tecnica abilitazione rilevamento di cellule native alla milza.

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Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Isolamento linfociti T umani, la cultura e l&#39;analisi delle migrazioni In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the transmigration of innate immune monocytes to inflammatory sites of deposited lipid called fatty streaks, which are present in arterial walls of medium to large arteries. The key pathogenic feature of lesions at this early stage of atherosclerosis is the maturation of monocytes which migrate into arteries to form foam cells or lipid-laden macrophages. Considerable evidence supports the hypothesis that risk of atherosclerosis is increased by chronic inflammatory conditions accompanying diseases such as rheumatoid arthritis and HIV, as well as general ageing, and that this risk is predicted by monocyte activation. While mouse models provide a good platform to investigate the role of monocytes in atherogenesis in vivo, they require genetic alteration of natural cholesterol metabolism and drastic alteration of normal mouse diets, and have limited suitability for the study of atherogenic influences of human comorbid diseases. This motivated us to develop a human in vitro model to measure the atherogenic potential of monocytes isolated from individuals with defined disease states. Currently, human in vitro models are limiting in that they evaluate monocyte transmigration and foam cell formation in isolation. Here we describe a protocol in which monocytes isolated from patient blood transmigrate across human endothelial cells into a type 1 collagen matrix, and their propensity to mature into foam cells in the presence or absence of exogenous lipid is measured. The protocol has been validated for the use of human monocytes purified from individuals with HIV infection and elderly HIV uninfected individuals. This model is versatile and allows monocyte transmigration and foam cell formation to be evaluated using either microscopy or flow cytometry as well as allowing the assessment of atherogenic factors present in serum or plasma.

We describe a protocol to measure transmigration by monocytes across human endothelial monolayers and their subsequent maturation into foam cells. This provides a versatile method to assess the atherogenic properties of monocytes isolated from people with different disease conditions and to evaluate factors in blood which may enhance this propensity.

Quantificazione della trasmigrazione del monocito e formazione delle cellule della gomma piuma da individui con condizioni infiammatorie croniche

Coronary artery disease (CAD) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Atherosclerosis, a leading cause of CAD, is initiated by the ...

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

Analisi di flusso laminare-based per indagare il reclutamento leucocitario su cellule vascolari coltivate e piastrine aderenti

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

Studio simultaneo del reclutamento di sottopopolazioni monocito sotto flusso In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of monocyte-derived macrophages can impair wound healing. We showed that high fat and high sugar diets promote monocyte priming and dysfunction, converting healthy blood monocytes into a hyper chemotactic phenotype poised to differentiate into macrophages with dysregulated activation profiles and impaired phenotypic plasticity. The over-recruitment of monocyte-derived macrophages and recruitment of macrophages with dysregulated activation profiles is believed to be a major contributor to the development of chronic inflammatory diseases associated with metabolic disorders, including atherosclerosis and obesity. The goal of this protocol is to quantify the chemotactic activity of blood monocytes as a biomarker for monocyte priming and dysfunction and to characterize the macrophage phenotype blood monocytes are poised to differentiate into in these mouse models. Using single cell Western blot analysis, we show that after 24 h 33%of cells recruited into MCP-1-loaded basement membrane-derived gel plugs injected into mice are monocytes and macrophages; 58% after day 3. However, on day 5, monocyte and macrophage numbers were significantly decreased. Finally, we show that this assays also allows for the isolation of live macrophages from the surgically retrieved basement membrane-derived gel plugs, which can then be subjected to subsequent characterization by single cell Western blot analysis.

Here we present a protocol to quantify the chemotactic activity of blood monocytes in mouse models, to assess the effects of nutritional, pharmacological and genetic interventions on blood monocyte and to characterize the blood monocytes derived macrophages in mouse models using monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1)-loaded basement membrane-derived gel plugs.

Quantificazione dell'attività chemiotatica monocite in vivo e caratterizzazione dei macrofagi derivati monociti del sangue

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex vivo transmigration system. Group 2 innate lymphoid cells (ILC2) and CD4+ T helper cells were isolated from spleens and lungs of chicken egg ovalbumin (OVA)-challenged BALB/c mice. We confirmed the expression of CCR4 on both CD4+ T cells and ILC2, comparatively. CCL17 and CCL22 are the known ligands for CCR4; therefore, using this ex vivo transmigration method we examined CCL17- and CCL22-induced movement of CCR4+ lymphocytes. To establish chemokine gradients, CCL17 and CCL22 were placed in the bottom chamber of the transmigration system. Isolated lymphocytes were then added to top chambers and over a 48 h period the lymphocytes actively migrated through 3 &#181;m pores towards the chemokine in the bottom chamber. This is an effective system for determining the chemokinetics of lymphocytes, but, understandably, does not mimic the complexities found in the in vivo organ microenvironments. This is one limitation of the method that can be overcome by the addition of in situ imaging of the organ and lymphocytes under study. In contrast, the advantage of this method is that is can be performed by an entry-level technician at a much more cost-effective rate than live imaging. As therapeutic compounds become available to enhance migration, as in the case of tumor infiltrating cytotoxic immune cells, or to inhibit migration, perhaps in the case of autoimmune diseases where immunopathology is of concern, this method can be used as a screening tool. In general, the method is effective if the chemokine of interest is consistently generating chemokinetics at a statistically higher level than the media control. In such cases, the degree of inhibition/enhancement by a given compound can be determined as well.

In this protocol, lymphocytes are placed in the top chamber of a transmigration system, separated from the bottom chamber by a porous membrane. Chemokine is added to the bottom chamber, which induces active migration along a chemokine gradient. After 48 h, lymphocytes are counted in both chambers to quantitate transmigration.

Valutazione della migrazione dei linfociti in un sistema di trasmigrazione Ex Vivo

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Time-lapse Imaging of Mouse Macrophage Chemotaxis

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a chemical. Chemokinesis and chemotaxis are fundamental for the mobilization and deployment of immune cells. For example, chemokines (chemotactic cytokines) can rapidly recruit circulating neutrophils and monocytes to extravascular sites of inflammation. Chemoattractant receptors belong to the large family of G protein-coupled receptors. How chemoattractant (i.e., ligand) gradients direct cell migration via G protein-coupled receptor signaling is not yet fully understood. In the field of immunology, neutrophils are popular model cells for studying chemotaxis in vitro. Here we describe a real-time two-dimensional (2D) chemotaxis assay tailored for mouse resident macrophages, which have traditionally been more difficult to study. Macrophages move at a slow pace of ~1 &#181;m/min on a 2D surface and are less well suited for point-source migration assays (e.g., migration towards the tip of a micropipette filled with chemoattractant) than neutrophils or Dictyostelium discoideum, which move an order of magnitude faster. Widely used Transwell assays are useful for studying the chemotactic activity of different substances, but do not provide information on cell morphology, velocity, or chemotactic navigation. Here we describe a time-lapse microscopy-based macrophage chemotaxis assay that allows quantification of cell velocity and chemotactic efficiency and provides a platform to delineate the transducers, signal pathways, and effectors of chemotaxis.

Here we describe methods using time-lapse, phase-contrast microscopy to image mouse resident peritoneal macrophages in a chemotactic complement C5a gradient. The protocols can be extended to other immune cells.

Immagine time-lapse di Mouse Macrophage Chemotaxis

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a ...

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an attractive therapeutic target in the clinical management of affected patients. In order to further optimize strategies aiming at therapeutic regulation of pathologically imbalanced tissue infiltration of pro-inflammatory immune cells, it will be of particular importance to achieve improved insights into disease- and organ-specific homing properties of peripheral lymphocytes. The here described experimental protocol allows to monitor lung accumulation of fluorescently labeled and adoptively transferred human lymphocytes in the context of papain-induced pulmonary inflammation. In contrast to standard in vitro assays frequently used for the analysis of immune cell migration and chemotaxis, the now introduced in vivo setting takes into account lung-specific aspects of tissue organization and the influence of the complex inflammatory scenario taking place in the living murine organism. Moreover, three-dimensional cross-sectional light-sheet fluorescence microscopic imaging does not only provide quantitative data on infiltrating immune cells, but also depicts the pattern of immune cell localization within the inflamed lung. Overall, we are able to introduce an innovative technique of high value for immunological research in the field of chronic inflammatory lung diseases, which can be easily applied by following the provided step-by-step protocol.

The here introduced protocol allows characterization of the lung homing capacity of primary human lymphocytes under in vivo inflammatory conditions. Pulmonary infiltration of adoptively transferred human immune cells in a mouse model of allergic inflammation can be imaged and quantified by light-sheet fluorescence microscopy of chemically cleared lung tissue.

Formazione immagine dei linfociti umani di Homing polmonare in un sperimentale In Vivo modello di infiammazione allergica basato su microscopia luce-scheda Avanzate

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an ...

Medicina

Chiarire la cinetica delle cellule T: metodi per l'analisi della migrazione in tempo reale

Real-Time In Vitro Migration Assay for Primary Murine CD8+ T Cells

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign bodies. T cell migration is a complex process that requires the coordination of many signal inputs from the environment and local immune cells, including chemokines, chemokine receptors, and adhesion molecules. Furthermore, T cell motility is influenced by dynamic surrounding environmental cues, which can alter activation state, transcriptional landscape, adhesion molecule expression, and more. In vivo, the complexity of these seemingly intertwined factors makes it difficult to distinguish individual signals that contribute to T cell migration. This protocol provides a string of methods from T cell isolation to computer-aided analysis to assess T cell migration in real-time&#160;under highly specific environmental conditions.&#160;These conditions&#160;may help&#160;elucidate mechanisms that regulate migration, improving our&#160;understanding of T cell kinetics and providing&#160;strong mechanistic evidence that is difficult&#160;to attain through animal experiments. A deeper understanding of the&#160;molecular interactions that impact cell&#160;migration is important to develop improved therapeutics.

Autore in primo piano: Comprendere i meccanismi della malattia attraverso l'analisi in tempo reale della migrazione delle cellule T

This protocol providesa method of primary murine T cell isolation and time-lapse microscopy of T cell migration under specific environmental conditions with quantitative analysis.

Saggio di migrazione in vitro in tempo reale per cellule T CD8+ murine primarie

The adaptive immune response is reliant on a T cell&#39;s ability to migrate through blood, lymph, and tissue&#160;in response to pathogens and foreign ...

Quantificazione del linfocita murino traffico In Vivo e chemiotassi del monocito umano In Vitro

Riepilogo

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Isolamento linfociti T umani, la cultura e l'analisi delle migrazioni In Vitro

Quantificazione della trasmigrazione del monocito e formazione delle cellule della gomma piuma da individui con condizioni infiammatorie croniche

Analisi di flusso laminare-based per indagare il reclutamento leucocitario su cellule vascolari coltivate e piastrine aderenti

Studio simultaneo del reclutamento di sottopopolazioni monocito sotto flusso In Vitro

Quantificazione dell'attività chemiotatica monocite in vivo e caratterizzazione dei macrofagi derivati monociti del sangue

Valutazione della migrazione dei linfociti in un sistema di trasmigrazione Ex Vivo

Immagine time-lapse di Mouse Macrophage Chemotaxis

Formazione immagine dei linfociti umani di Homing polmonare in un sperimentale In Vivo modello di infiammazione allergica basato su microscopia luce-scheda Avanzate

Saggio di migrazione in vitro in tempo reale per cellule T CD8+ murine primarie

Saggio di migrazione in vitro in tempo reale per cellule T CD8+ murine primarie