Das Protokoll stellt einen wichtigen Schritt dar, um Drosophila als Standardmodell für chemische Sicherheitstests zu etablieren und neue Ansätze zu entwickeln, die gemeinhin als NAMs bezeichnet werden. Das Protokoll beschreibt eine effiziente und kostengünstige Methode, bei der flüssige Medien verwendet werden, um die Auswirkungen einer chemischen Vergiftung auf die Lebensfähigkeit von adulter Drosophila melanogaster zu bewerten. Beginnen Sie damit, vier Blätter Zellulose-Chromatographiepapier der Güteklasse eins zu stapeln und sie in zwei Zoll breite Streifen zu schneiden.
Stanzen Sie blumenförmige Filterpapiereinsätze mit einem 1,5-Zoll-Papierstanzer aus, der einen blumenförmigen Farbstoff enthält. Schieben Sie den Filterpapierstapel mit einem unlackierten Holzdübel von 22 x 220 Millimetern Durchmesser auf den Boden eines Polypropylen-Fläschchens mit einem Durchmesser von 28,5 Millimetern. Stellen Sie sicher, dass sich der Stapel sicher am Boden der Durchstechflasche befindet.
Bewahren Sie die vorbereiteten Durchstechflaschen in Plastik- oder Pappschalen auf und legen Sie die Schalen bis zur Verwendung in große Plastiktüten. Öffnen Sie das Glasfläschchen mit den Fliegen, setzen Sie es auf das Maul des vorbereiteten Plastikfläschchens und übertragen Sie sortierte geschlechtsspezifische Fliegen in das Hungerfläschchen, indem Sie den Boden des Plastikfläschchens gegen eine Tischplatte klopfen. Verschließen Sie das Plastikfläschchen mit einem Celluloseacetatstopfen oder -flügel und notieren Sie alle Fliegen, die bei diesem Transfer verloren gegangen sind.
Markieren Sie die Hungerfläschchen mit weiblichen Fliegen mit einem Streifen. Um ein versehentliches Vermischen zu vermeiden, lassen Sie die Durchstechflaschen mit den Mailfliesen unbeschriftet. Bereiten Sie die Feuchtigkeitskammer für die Übernacht vor, indem Sie sechs Standard-Papiertücher auf den Boden legen.
Tränken Sie dann die Papiertücher mit 100 Millilitern Wasser und legen Sie das Plastikgitter über die nassen Handtücher, um sicherzustellen, dass die Fläschchen nicht mit den getränkten Papiertüchern in Berührung kommen. Nachdem Sie die Schalen mit den Hungerfläschchen in horizontaler Position innerhalb der Feuchtigkeitskammer platziert haben, übertragen Sie die Feuchtigkeitskammer zur Inkubation über Nacht in einen 25 Grad Celsius heißen Inkubator. Um die Fläschchen mit chemischer Exposition vorzubereiten, übertragen Sie vier Durchstechflaschen mit ausgehungerten weiblichen Fliegen mit 20 Fliegen pro Durchstechflasche in vier Durchstechflaschen mit jeder chemischen Konzentration.
Beschriften Sie diese Fläschchen als weiblich. Bereiten Sie Fläschchen mit blauem Farbstoff vor, indem Sie für jede chemische Konzentration ein Fläschchen mit ausgehungerten weiblichen Fliegen in ein blaues Expositionsfläschchen umfüllen. Beschriften Sie diese Durchstechflasche als weiblich.
Notieren Sie die Anzahl der Fliegen, die sich nach dem Transfer in jeder Durchstechflasche befinden, und notieren Sie die Anzahl, die gestorben oder entkommen ist. Normalerweise sollten alle 20 Fliegen über Nacht verhungern und übertragen werden. Stellen Sie die Expositionsfläschchen horizontal in eine frisch vorbereitete Feuchtigkeitskammer, bevor Sie die Kammer in einen 25 Grad Celsius heißen Inkubator mit ca. 60 % Luftfeuchtigkeit und einem 12 bis 12 Stunden Hell-Dunkel-Zyklus stellen.
Untersuchen Sie die Expositionsfläschchen 24 und 48 Stunden nach Beginn der Chemikalienexposition. Zählen und notieren Sie die toten Fliegen in jedem Fläschchen zu jedem Zeitpunkt. Um festzustellen, ob exponierte Fliegen nach 24 Stunden nach der chemischen Exposition die blauen Expositionsmedien in den blauen Expositionsfläschchen verzehrt haben, untersuchen Sie die Fläschchenwände auf Anzeichen von blauem Kot, die als kleine Punkte an der Seite des Expositionsfläschchens und des Fluges erscheinen.
Als nächstes betäuben Sie die Fliegen mit Kohlendioxid, bevor Sie den Bauch auf das Vorhandensein von blauem Farbstoff untersuchen. Untersuchen Sie die Fliegen auf abnormales Fressverhalten wie Aufstoßen, Aufblähen der Pflanzen und Zusammenbruch der Darmbarrierefunktion. Wenn Sie fertig sind, entsorgen Sie alle kontaminierten Fläschchen, Filterpapier, Stopfen und Fliegen in den entsprechenden Behältern für chemische Abfälle.
Wenn lebende Fliegen in den Fläschchen verbleiben, frieren Sie die Fläschchen ein, bevor Sie sie in den richtigen Abfallbehälter werfen. Die Wirksamkeit des Protokolls wurde bestimmt, indem adulte Organe oder männliche und weibliche Fliegen dem Bereich von Natriumarsonitkonzentrationen von null bis zwei Millimolar ausgesetzt wurden, um die Letalität nach 48 Stunden Exposition zu bestimmen. In nachfolgenden Experimenten wurden null bis fünf millimolare Konzentrationen ausgewählt, die die Dosis-Wirkungs-Kurve von Natriumarsonit genauer definierten.
Basierend auf diesem Modell betrug die endgültige tödliche Dosis oder LD 10, LD 25 und LD 50 von männlichen Fliegen, die mit Natriumarsonit gefüttert wurden, 0,30 Millimolaren, 0,50 Millimolar bzw. 0,65 Millimolaren. Diese Werte waren bei weiblichen Fliegen mit einer LD 10 von 0,30 Millimolaren, einer LD 25 von 0,65 Millimolar und einer LD 50 von 0,90 Millimolaren etwas höher. Bei den männlichen und weiblichen Fliegen, die mit 1%F D und C blau gefüttert wurden, die Natriumarsonitlösungen enthielten, wurde das aufgenommene Futter gelegentlich in Dosen von mehr als 0,2 Millimolar für Weibchen und 0,5 Millimolar für Männchen ausgewürgt, was darauf hindeutet, dass Regurgitation die Schlüsselrolle bei der Krätzefilia-Reaktion auf eine Arsenvergiftung spielen könnte.
Nach diesem Expositionsprotokoll können die Fliegen leicht für weitere Analysen, einschließlich genomischer und metabolomischer Studien, gesammelt werden. Dieses Protokoll ist der erste Schritt zur Etablierung der Fruchtfliege Drosophila melanogaster als gemeinsames genetisches Modell für die Durchführung groß angelegter Studien zur Präzisionstoxikologie.
