Unsere Methoden skizzieren eine einfache und wiederholte Methode zur Untersuchung der Nanotoxizität, wie z. B. die Untersuchung der Arten des Zelltodes und die Untersuchung der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies. Fluoreszenz aktivierte Zellsortierung ist ein strenges Format, das es uns ermöglicht, die Subpopulation von Zellen und die wachsenden verschiedenen Arten von Zelltod zu studieren. Die DHE-Sondenstudie ermöglicht es uns, reaktive Sauerstoffspezies zu erkennen und zu quantifizieren, gefolgt von Durchflusszytometrie, mikroskopischer Hochauflösender Bildgebung und koppelbasierter Fluoreszenzanalyse.
Zunächst sollte eine Eppendorf-Röhre mit Zinkoxid-Nanopartikeln in Zinkoxid-Nanopartikel-Stammlösung 15 Minuten lang in einen Beschallungsmittelor gegeben werden. Bereiten Sie Zinkoxid-Nanopartikel in verschiedenen Konzentrationen mit einem Milligramm pro Milliliter Zinkoxid-Nanopartikelbestand vor. Dann, in einem Biosicherheitsschrank, Samen MRC5 menschliche Lunge Fibroblasten auf drei Sechs-Well-Kulturplatten in der Konzentration von einem mal 10 bis die fünften Zellen pro Brunnen.
Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius. Nach einem Tag die Zellen acht Stunden, 16 Stunden oder 24 Stunden lang mit zwei Millilitern Zinkoxid-Nanopartikeln behandeln. Zu jedem Zeitpunkt die Zellen in einem 15-Milliliter-Zentrifugenrohr und Zentrifuge bei 300 mal g für fünf Minuten sammeln.
Waschen Sie die Zellpellets zweimal mit phosphatgepufferter Saline, und setzen Sie die Zellen dann mit 1X Bindungspuffer wieder auf. Als nächstes fügen Sie fünf Mikroliter FITC Annexin V Fleck in fünf Mikroliter Propidium Iodid DNA-Färbung. Bebrüte die gebeizten Zellen 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln.
Vor der Sortierung der Zellen durch Durchflusszytometrie, laden Sie die Proben mit einem zusätzlichen 400 Mikroliter 1X Bindungspuffer auf. Tabuulieren Sie das Balkendiagramm mit der erhaltenen Medianintensität. Verwenden Sie nun eine Pipette, um einen Milliliter Nanopartikel in verschiedenen Konzentrationen in Fläschchen hinzuzufügen, gefolgt von neun Millilitern Fliegenfutter, um eine Endkonzentration von 0,1 Milligramm pro Milliliter, 0,25 Milligramm pro Milliliter oder 0,5 Milligramm pro Milliliter Zinkoxid-Nanopartikel zu erreichen.
Pipette nach oben und unten, um gründlich zu mischen. Fliegennahrung, die Zinkoxid-Nanopartikel enthält, vor Gebrauch mindestens zwei bis drei Stunden abkühlen lassen. Dann anästhesieren erwachsene männliche und weibliche Fliegen in einer Durchstechflasche mit Kohlendioxid, und führen Fünf männliche Fliegen und fünf weibliche Fliegen in jede Durchstechflasche für fünf Tage.
Lassen Sie sie sich paaren und legen Sie Eier auf der Oberfläche des Lebensmittels. Nach der Anästhesisierung die Elternfliegen entfernen und die Eier bei Raumtemperatur weiterentwickeln lassen, die aus vier verschiedenen Entwicklungsstadien besteht. Embryonal, Larven, Pupal und Erwachsenenstadium.
Nach 72 bis 120 Stunden entwickeln sich frisch gelegte Eier zu späten dritten Insternlarven. Mit Zangen, sammeln Sie die Larven von der Wand der Fläschchen für Analysen. In einem Brunnen einer Sezierschale mit Dissektionsmedium oder PBS die Larven in die Lösung geben.
Verwenden Sie unter dem Stereomikroskop die Spitze der Zange, um ein winziges Loch zu bilden, und brechen Sie die Nagelhautschicht der Larven auf. Ziehen Sie vorsichtig den Darm heraus. Legen Sie den Darm in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr mit Schneiders Drosophila Medium.
Fügen Sie einen Mikroliter der DHE-Sonde hinzu und in der Dunkelheit bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubieren. Waschen Sie den Darm dreimal mit Schneiders Medium alle fünf Minuten. Montieren Sie den Darm auf Glasschlitten und liefern Sie mit 10 Mikroliter Antifade-Montagemedium, das DAPI enthält.
Erfassen Sie Bilder unter einem konfokalen Mikroskop. Um die Fluoreszenz zu messen, importieren Sie die erfassten Fluoreszenzbilder, die mit Fluoreszenzmikroskopie oder konfokaler Laserscanmikroskopie aufgenommen wurden, in die ImageJ-Software. Klicken Sie auf das Analysemenü, und wählen Sie die festgelegten Messungen aus.
Wählen Sie die Ausgabekennzahl aus, z. B. die integrierte Flächenintensität und den mittleren Grauwert. Wählen Sie einen Bereich ohne Fluoreszenz aus, um den Hintergrund festzulegen. Klicken Sie auf Maß.
Exportieren Sie die Daten in die Kalkulationstabelle, und bestimmen Sie die korrigierte Gesamtzellfluoreszenz. Erstellen Sie ein Balkendiagramm, und führen Sie statistische Analysen durch. In dieser Studie weisen Zinkoxid-Nanopartikel-behandelte Zellen einen höheren Anteil an frühen R3- oder späten apoptotischen R6-Zellen auf als Kontrollzellen R5. Nekrotische Zelltod wurde mit R4 bezeichnet. Der aus der Drosophila-Larve gewonnene Darm wurde in drei diskrete Domänen unterschiedlicher Entwicklungsherkunft unterteilt.
Nämlich das Vorgut, das Midgut und das Hintergut. DHE-Aktie neigt dazu, ziemlich schnell zu verfallen, so seien Sie vorsichtig mit der Aktienlösung, die Sie verwenden. Alternativ können Sie auch andere Sonden ausprobieren, z. B. die Zelle Roche, die entwickelt wurde, um den intrazellulären ROS in grünen Signalen zu erkennen, und das ist fotoierbarer als die DHE.
Unser Protokoll bietet einen allgemeinen Überblick über die Untersuchung der intrazellulären ROS-Produktion und die Quantifizierung des ROS-Levels für Nanotoxizitätsstudien. DMSO ist dafür bekannt, ein besseres Lösungsmittel für DHE als das PBS zu sein. DMSO ist jedoch giftig.
Daher möchte ich dem Benutzer raten, den gesamten Prozess für das Studium auf maximal 30 Minuten zu beschränken. Dies liegt daran, dass Sie ein falsch positives Ergebnis beobachten können, da DMSO den Zelltod verursachen kann.
