Diese Arbeit wurde von Betriebskostenzuschüssen von Savoy-Stiftung und der Heilung-Epilepsie-Stiftung unterstützt und durch Ausrüstung gewährt der kanadischen Stiftung für Innovation E.R (confocal Mikroskop) und G.H (Spinning Disk confocal Mikroskop). E.r. erhält einen Karriere-Award von der Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S; Clinician-Scientist Award) sowie von der Canadian Institute for Health Research (CIHR; Young Investigator Award). G.h. ist ein senior Scholar des FRQ-S. L.E ist der Empfänger des Steriade-Savoy Postdoc Training Award der Savoy-Stiftung, Postdoc Training CHU Sainte-Justine Stiftungspreis und FRQ-S Postdoc Bildungspreis, in Partnerschaft mit der Stiftung der Sterne. Dieses Projekt wurde vom Gehirn Kanada durch Kanada Brain Research Fund, mit finanzieller Unterstützung von Health Canada, verliehen an l.e. ermöglicht

Alle Experimente mit Tieren vom Comité Institutionnel des Bonnes Pratiques Avec Les Animaux de Recherche (CIBPAR) am Forschungszentrum CHU Sainte-Justine genehmigt und wurden im Einklang mit dem Canadian Council über Animal Care Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren (Ed. 2).
Das hier beschriebene Protokoll wurde optimiert für Elektroporation von Embryonen im embryonalen Tag (e) 13,5, zu einem Zeitpunkt wann MGE abgeleitet INs aktiv erzeugt werden, bevor die Spitze der CGE abgeleitet INs Produktion45,46. Darüber hinaus nutzen wir um die Elektroporation in Richtung GABAergic INs-bias, Förderer selektiv in INs (zum Beispiel der Dlx5/6 -Veranstalter mit seiner minimalen Enhancer)47ausgedrückt.
1. Vorbereitung der Lösungen für Electroporation und organotypischen Slice Kulturen
<ol><li>125 mL sterilen Nährmedium vorzubereiten.<ol>
<li>125 mL regelmäßige Neuron-spezifische Kulturmedium zu messen (siehe Tabelle der Materialien für die Formulierung) in eine sterilisierte Flasche in einen zuvor UV-sterilisiert Biosafety Schrank mit 70 % Ethanol besprüht. Fügen Sie 2,25 mL 50 x serumfreien Neuron-spezifische Ergänzung, 1,75 mL 200mM Glutamin (Endkonzentration von 0,5 mM) und 6,25 mL Hitze-inaktivierten Pferd Serum zuvor regelmäñig unter sterilen Bedingungen. Gut durchmischen, Aliquote in 15 mL sterile konische Rohre und Lagerung bei 4 ° C. Hinweis: Präparierten Nährmedium kann bis zu 3 Wochen bei 4 ° c aufbewahrt werden</li>
		<li>Teilen Sie eine 100 X Botteinstein n-2 Formulierung48 -Stammlösung in 150 µL-Aliquots unter sterilen Bedingungen und bei-20 ° C bis zum Gebrauch einfrieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie 1 L des sterilen künstlichen Liquor cerebrospinalis (ACFS).<ol>
<li>800 mL destilliertem Wasser in einer 1 L Becher zu messen. Fügen Sie 25,67 g Saccharose, 5,08 g Natriumchlorid (NaCl) 2,18 g Natriumbicarbonat (Nahco33) 1,80 g Glukose, 0,19 g Kaliumchlorid (KCl), 0,15 g monobasic wasserfreies Natriumphosphat (NaH2PO4), 1 mL 1 M Lager CaCl2 .2H2O und 2 mL 1 M MgSO4.7H2O. unter Rühren auflösen bei Raumtemperatur lagern. Fügen Sie destilliertes Wasser zu einem Gesamtvolumen von 1 L.</li>
		<li>Mit einem 0,22 µm-Filter, Filtern Sie die Lösung in eine sterile Flasche in eine sterilisierte Biosafety Kabinett und bei 4 ° C für bis zu 1 Monat aufbewahren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie eine frische Lösung von 4 % Agarose in ACFS vor jedem Experiment.<ol>
<li>Messen Sie 25 mL der vorbereiteten ACFS in einem 50 mL sterile konische Rohr zu und fügen Sie 1 g Niedrigschmelzende Punkt Agarose.</li>
		<li>Wärme für 45 s in der Mikrowelle. Um zu vermeiden, Verschütten, unterbrechen Sie Heizung Alle 3-4 s, beim Kochen beginnt, öffnen Sie das Rohr um den Druck aus, schließen Sie ihn wieder und agitieren manuell die Agarose mischen zu lassen. Wiederholen Sie, bis die Agarose-Lösung homogen ist. Halten Sie die Agarose-Lösung bei 42 ° C, während der Rest des Experiments, Erstarrung zu vermeiden. Hinweis: Höhere Temperaturen beschädigen Hirngewebe.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung der Plasmide Injektionslösung
<ol><li>Ziehen Sie eine Glaspipette Mikroinjektion<ol>
<li>Mikropipette Abzieher mit den richtigen Parametern eingestellt, die Glas-Kapillare in den zur Verfügung gestellten Raum zu sichern und stellen Sie sicher, dass es mit dem Filament zentriert ist.</li>
		<li>Drücken Sie die Schaltfläche "ziehen".</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig die neugebildeten Mikroinjektion Pipetten aus der Hitze Puller und in einer Box oder einem sauberen Petrischale bis zur weiteren Verwendung zur Vermeidung von Schäden die Spitze.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aufbau der Biosicherheit Schrank mit allen Instrumenten benötigt dafür experimentieren (siehe Abbildung 1A), Sprühen Sie großzügig alle Instrumente in der Biosicherheit Schrank mit 70 % Ethanol und Sterilisieren die Instrumente und die Umwelt mit UV-Licht für 15-20 min.</li>
	<li>Während der Sterilisation Schritt tauen Sie Plasmide auf Eis (4 ° C auf).</li>
	<li>Messen Sie 10 µL des Plasmids aus einer Stammlösung (4 µg/µL) in eine saubere 1,5 mL Zentrifugenröhrchen. 0,01 % der schnell grün FCF hinzufügen. Vorsichtig mischen, kurz drehen und halten Sie auf dem Eis bis zur Verwendung. Hinweis: Maxi-Prep DNA sollte nach der Hersteller-Protokoll mit einem Endotoxin-freie Maxi-Prep Kit vorbereitet werden. DNA kann in TE-Puffer oder Nuklease-freie solubilisiert werden H2O und die Vorbereitung des Plasmids mit Farbstoff Lösung kann jedoch nicht unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden müssen. Plasmide von Maxi-Prep sollte regelmäñig, mehrere Gefrier-tau-Zyklen zu vermeiden. Regelmäñig Plasmide sollte mit der Farbstoff nicht mehr, dass 2 h vor Gebrauch gemischt werden und sollten nicht für die weitere Verwendung eingefroren werden.</li>
	<li>Bereiten Sie nach der Sterilisation die Nano-Injektor wie folgt vor.<ol>
<li>Wählen Sie eines der zuvor vorbereiteten Mikroinjektion Glaspipette gespeichert in einem sauberen Box oder Petrischale und kleine Pinzette verwenden, schneiden Sie die PIPETTENSPITZE abgeschrägte gewissermaßen einen Außendurchmesser von ca. 15 µm zu erreichen. Hinweis: Der hier gegebenen Außendurchmesser ist eine ungefähre Maßnahme, um dem Benutzer eine Vorstellung davon, was wir in unseren Experimenten nutzen und wurde optimiert, um das piercing des Schädels Injektionslösung Plasmid ohne Beschädigung des Gehirns, wobei für das Fluid zu erleichtern Laden und Freigabe der DNA. Der äußere Durchmesser kann gemessen werden, durch die geschnittene Spitze der Mikroinjektion Glaspipette apposed um eine mikrometrische Maßstabsleiste unter dem Hellfeld-Mikroskop betrachten.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Spritze, um die Mikropipette mit Mineralöl aus seinem unpulled Ende (um die Luft zu vertreiben) zu füllen.</li>
		<li>Legen Sie die gefüllten Glas Mikropipette im Nano-Injektor durch Anweisungen des Herstellers.</li>
		<li>Leere 2/3rds der das Glas Mikropipette (wobei genug Öl, um Lufteintritt zu verhindern).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sorgfältig einfügen Sie vorbereitete Mikropipette in das Röhrchen mit dem Plasmid/Farbstofflösung und füllen Sie das Glas Mikropipette mit Plasmid/Farbstofflösung.</li>
</ol>3. Sammlung von Mäuseembryonen von trächtigen Weibchen
<ol><li>Zuchthündinnen täglich um zu beurteilen für vaginale einstecken, vorzugsweise zur gleichen Zeit täglich (am frühen Nachmittag) zu überwachen. Tag e0.5 entspricht dem ersten Tag als ein vaginaler Stecker beobachtet wird. Hinweis: Die hier beschriebenen Experimente können in Wildtyp Mäusen durchgeführt werden. Jedoch, um die Identifizierung der MGE zu erleichtern und alle GABAergic INs (oder bestimmte Teilmengen wie MGE abgeleitet INs) zu kennzeichnen, Transgene Tiere können verwendet werden (z.B.: GAD67EGFP; Dlx5/6Cre mit einem Cre-Reporter-Allel, etc.47,49). In diesem Fall sollte das experimentelle Plasmid injiziert zum Ausdruck bringen eine andere Fluorophore (zum Beispiel mCherry oder TdTomato) ermöglichen die Visualisierung der transfizierten INs (gelb), die mit nicht-transfizierten INs (grün) verglichen werden kann.</li>
	<li>Das Weibchen an embryonalen Tag e13.5 durch Hals Luxation zu opfern. Hinweis: Zum Zeitpunkt des Opfers Anästhetika können Auswirkungen auf Migration und Überleben50,51 und sollte vermieden werden.</li>
	<li>Embryonen wie folgt per Kaiserschnitt zu sammeln.<ol>
<li>Sprühen Sie den weiblichen Bauch großzügig mit 70 % Ethanol. Hochziehen Sie die Bauchhaut mit einer sterilen Pinzette und mit der anderen Hand verwenden Sie sterilisierte chirurgische Scheren, schneiden Sie die Haut aus dem Bauch.</li>
		<li>Hochziehen Sie mit einem zweiten paar sterilisierte Pinzette und Schere die Bauch-Faszie und schneiden Sie es vorsichtig die Gebärmutter zu vermeiden.</li>
		<li>Mit einer dritten sterilisierte Pinzette und Schere, ziehen Sie die uterine Hörner und schneiden Sie sie aus der Beckenhöhle. Legen Sie die seziert uterine Hörner in einer sterilen 60 mm Petrischale gefüllt mit neuronalen basierende Kulturmedium mit Aminosäuren, Vitaminen und anorganische Salze (siehe Tabelle der Materialien für handelsübliches Produkt) ergänzt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie in einem sterilen Biosafety Kabinett zwei Paare von feinen Pinzette (eins in jeder Hand) zu sezieren die Embryonen aus der Plazenta und isolieren die Köpfe durch Enthauptung.</li>
	<li>Schrägschnitt eine sterile 3 mL Kunststoff Transfer PIPETTENSPITZE Aspirieren Sie die Köpfe und Transfer in eine neue sterile Petrischale 60 mm mit erstarrten schwarzen Wachs geschichtet und gefüllt mit der gleichen neuronalen Basis ergänzt Kulturmedium wie oben beschrieben. Hinweis: Dieser Schritt minimiert die Übertragung von Kontaminanten (Maus Haare, Blut). Die schwarzen Wachs wird verwendet, um den Kopf während der Präparation zu stabilisieren. Nährmedien müssen nicht während dieser Verfahren Sauerstoff.</li>
</ol>4. intraventrikuläre Plasmid-Injektionen und Ex Vivo Elektroporation von der MGE
Hinweis: Die folgenden Schritte müssen unter sterilen Bedingungen in die vorher vorbereiteten Biosicherheit Schrank durchgeführt werden.
<ol><li>Ort der 60-mm-Petrischale mit schwarzen Wachs geschichtet und enthält die abgeschlagenen Köpfe in neuronale Grundlage Kulturmedium unter das Fernglas in die Biosicherheit Kabinett ergänzt.</li>
	<li>Stabilisieren Sie den Kopf, die rostral Teil nach rechts, mit einer feinen Pinzette mit der linken Hand und mit der Nano-Injektor in der rechten Hand um 1-2 µL Plasmid/Farbstofflösung in den rechten seitlichen Ventrikel zu injizieren. Bemerkung: Co Experimente kann von co-Electroporating ein Rettungs-Plasmid und eine ShRNA exprimierenden Plasmid durch die Vermischung beider Plasmide bei äquimolaren Konzentrationen durchgeführt.</li>
	<li>Electroporate das Gehirn injiziert.<ol>
<li>Legen Sie den Kopf zwischen den Elektroden mit der negativen Elektrode positioniert dorsal und parallel zum Kopf und die positive Elektrode in Richtung der ventralen Seite des Kopfes, um gezielt die MGE.</li>
		<li>Sobald die Elektroden gut positioniert sind, liefern Sie 4 quadratische Impulse von 40 V für 50 ms bei 500 ms Inter Puls Intervalle.</li>
		<li>Entfernen Sie jede verbleibende Gewebe von den Elektroden mit einer Pinzette, die bereits in der Biosicherheit Schrank platziert. Hinweis: Diese Parameter wurden speziell für die Electroporator in unseren Experimenten verwendet optimiert. Es wird empfohlen, dass die Nutzer vorher Optimierung Tests durchführen, wenn eine andere Art von Electroporator zu verwenden.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.1 bis 4.3 für alle übrigen Gehirne. Hinweis: Obwohl dieses Protokoll die Manipulationen für ein Gehirn benötigt beschreibt, ist es möglich, bis zu 4 Köpfe nacheinander vor Electroporating jedes Gehirn, wodurch sich des Ertrags injizieren. Diese Strategie ist besonders vorteilhaft, wenn 2 oder mehr verschiedene Plasmide sequenziell (z. B. Kontrolle oder experimentelle Plasmid) während das gleiche Experiment (so dass für den Vergleich zwischen wurfgeschwistern) injiziert werden. Darüber hinaus ist es möglich, Spritzen und Electroporate gleichzeitig beide Seiten des Gehirns, um den Ertrag zu steigern, durch die Positionierung der Elektroden vollständig parallel zu der Oberfläche des Gehirns.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Gehirn Sie sezieren und organotypischen Slice Kulturen
<ol><li>Während noch in der sterilen Umgebung der Biosicherheit Kabinett zu manipulieren, sezieren Sie das Gehirn aus dem Schädel.<ol>
<li>Stabilisieren Sie den Kopf auf die Schicht des schwarzen Wachs durch eine Nadel in jedes Auge während des Gehirns sorgfältig zu vermeiden.</li>
		<li>Verwenden Sie ein paar feine Pinzette auf um der linken Seite des Halses und ein zweites Paar feine Pinzette, um die Haut vor den Schädel, von hinten nach vorne reißen zu halten.</li>
		<li>Halten Sie den Kopf seitlich mit einer Pinzette in der Hand, verwenden Sie ein weiteres Paar Pinzette in der anderen Hand, schneiden Sie vorsichtig den Schädel auf der Ebene der Hirnstamm und ziehen vorsichtig den Schädel auf. Mit jeder Pinzette Schneiden des Schädels in der Sagittalebene (Mittellinie) nach vorne, und dann seitlich Einschneiden, um die Schädel-Fragmente zu befreien.</li>
		<li>Heben Sie den Hirnstamm und schneiden Sie vorsichtig die Hirnhäute und Hirnnerven, bis das Gehirn aus dem Schädel komplett ist. Hinweis: Alle in 5.1 beschriebenen Schritte sollte unter streng sterilen Bedingungen in ein Kabinett Biosafety durchgeführt werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Betten Sie das Gehirn in 4 % niedrig schmelzende Punkt Agarose für schneiden.<ol>
<li>Füllen Sie eine 35-mm-Petrischale mit über vorbereitete Agarose-Lösung (bei 42 ° C flüssig gehalten).</li>
		<li>Schnelle Übertragung eine elektroporiert Gehirn in die Agarose-gefüllte Schale mit der zuvor ausgeschnittene transferpipette. Die Schüssel bei Zimmertemperatur aufbewahren.</li>
		<li>Rühren Sie die Agarose mit einem Metallstab, das Gehirn in der Mitte der Brunnen (zum Untergang zu verhindern) zu halten und das Gehirn in einer Rostro-kaudalen Ebene parallel auf den Teller zu positionieren. Nicht mehr rühren, wenn die Agarose beginnt zu festigen, um eine Schädigung des Gehirns zu vermeiden.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Rasierklinge, um die Agarose umgibt das Gehirn um einen rechteckigen Block, eine Marge von 1 bis 2 Millimeter zu verlassen, um das Gehirn herum bilden geschnitten. Sicherstellen Sie, dass die rostral Teil des Gehirns senkrecht zu der vorderen Begrenzung des Blocks zur Erleichterung der Orientierung für die nachfolgenden speziellen Schritte ist.</li>
		<li>Wiederholen Sie für jedes Gehirn. Hinweis: Es ist möglich, mehr als ein Gehirn zu einem Zeitpunkt (maximal 3) zu schneiden, durch Gestaltung von separaten Agarose Blöcke während der Einstellung jedes Gehirn in unterschiedlichen Höhen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vibratome koronalen Abschnitte und Slice-Kultur.<ol>
<li>Tauwetter ein Aliquot von 100 X n-2 (150 µL) auf Eis zu ergänzen und 15 mL regelmäñig Kulturmedium unter sterilen Bedingungen hinzufügen.</li>
		<li>750 µL Kulturmedium (mit 1 X N2 Zuschlag) in jede Vertiefung einer Kultur 6-Well-Platte zu übertragen.</li>
		<li>Legen Sie mit gebogenen Pinzette eine Zelle Kultur Einsatz (Durchmesser 30 mm, 0,4 µm Porengröße, PTFE) in jedem Medium-gut gefüllt.</li>
		<li>Füllen Sie das Vibratome Bad mit ständig sauerstoffreiches ACFS. Mit Eis rund um das Bad auf 4 ° C kühlen Sie ab, oder verwenden Sie einen gekühlten Vibratome.</li>
		<li>Vibratome Geschwindigkeit 0,150 mm/s und Frequenz bis zu 80 Hertz einstellen.</li>
		<li>Kleben Sie die Agarose-Block auf der Vibratome Plattform, rostral Kante nach unten und ventralen Rand mit Blick auf den Benutzer.</li>
		<li>Schneiden Sie das Gehirn im koronalen Abschnitte 250 µm Dicke Abschnitte (bei 4 ° C) zu erhalten.</li>
		<li>Mit sterilisierten Spachteln sammeln Sie 2-3 Abschnitte mit MGE und Stelle alle Gehirn-Abschnitte von einem Tier auf einer einzelnen 30-mm-Membran einfügen sorgfältig vermeiden Überschneidungen zwischen Abschnitten. Legen Sie den Einsatz in einem gut einer Kultur 6-Well-Platte (mit 750 µL ergänzt Kulturmedium, wie oben beschrieben). Alternativ kann jeder Abschnitt auf einer separaten 13-mm-Durchmesser-Membran in einem 12-Well Kultur Teller gefüllt mit 500 µl ergänzt Kulturmedium platziert werden. Die Höhe der Nährmedium empfohlen für jedes gut ermöglicht die Gehirn-Abschnitte von den Medien genährt werden, ohne als untergetaucht. Hinweis: In 5.3.6 und 5.3.7 beschriebenen Schritte sind nicht unter komplette sterilen Bedingungen durchgeführt, es sei denn der Vibratome sterilisiert und in einen Schrank Biosafety verwendet werden kann. Daher ist es wichtig, diese Schritte sorgfältig, um eine Kontamination zu vermeiden führen. Geeigneter Schutzausrüstung (saubere Maske, OP-Handschuhe und Kittel) sollte zu allen Zeiten und Körperteile, getragen werden sogar bedeckt, wie Haare, Gesicht und Hände, sollten nie über Kultur-Platten (mit oder ohne Kulturmedium) übergeben. Es wird auch empfohlen, Sprühen Sie 70 % Ethanol häufig auf die Handschuhe und Spachtel verwendet, um das Gehirn Abschnitte zu sammeln.</li>
		<li>Platzieren Sie die Kultur-Platte in einem belüfteten sterile Inkubator bei 37 ° C mit 60 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 für 48 oder 72 h. Hinweis: Diese Inkubationszeiten waren für Zeitraffer-Bildgebung von MGE abgeleitet INs und konfokale Abbildung von festen Scheiben bzw. optimiert. Optimale Inkubationszeiten sollte im Voraus für jede Versuchsanordnung getestet werden. Darüber hinaus, wenn die gewählte Inkubation 72 h und unter, gibt es keine Notwendigkeit, das Kulturmedium ändern. Für längere Inkubationszeiten sollte das Kulturmedium alle 2-3 Tage geändert werden.</li>
		<li>Übertragen Sie nach der gewünschten Inkubationszeit die Abschnitte von Interesse, eine 8-gekammert deckgläschen geben Sie und 3-5 µL Kulturmedium. Ort das Deckglas in einer Klimakammer (37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 60 %, 5 % CO2) mit einer invertierten verbunden spinning Disk konfokale ausgestattet mit eine EDV-gestützte Datenerfassungs-Software zum Aufbau der Zeitraffer bildgebenden Sitzung. Hinweis: Alternativ können Abschnitte mit 4 % Paraformaldehyd (über Nacht bei 4 ° C oder 2 h bei Raumtemperatur) und anschließend Immunostained mit verschiedenen Antikörpern zur Visualisierung der morphologischen Merkmale der elektroporiert INs unter einem konfokalen fixiert werden Mikroskop. Obwohl eGFP und mCherry durch konfokale Mikroskopie ohne Counter befleckenden Verfahren sichtbar gemacht werden können, empfehlen wir Immunohistochemistry gegen GFP und mCherry, um das Signal zu verbessern, da die Fixierung Prozess Fluoreszenz, reduzieren kann reduzieren die Erkennung der feineren Bestandteile des embryonalen Nervenzellen, wie kleinere Äste in die führende oder nachfolgende Prozesse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben. Die hierin geäußerten Ansichten repräsentieren nicht unbedingt die Meinung der Gesundheitsminister oder der Regierung von Kanada.

In diesem Artikel bieten wir eine zuverlässige Methode für die Durchführung von ex Utero Elektroporation der Maus MGE in e13.5 und zur Erzeugung von organotypischen Kulturen der embryonalen Gehirnscheiben. Obwohl in-vitro- Methoden, z. B. Boyden Kammer Assay, relativ einfach sind durchzuführen und verwendet werden, können um die spezifischen Rollen von verschiedenen Genen und Proteinen ohne die Einmischung von anderen Faktoren zu beurteilen, schließen sie die Untersuchung IN Migration-Dynamik im H...

Kortikale Gabaergen Interneuronen (INs) sind vielfältig in Bezug auf ihre biochemische Eigenschaften, physiologische Eigenschaften und Konnektivität, und sie vermitteln verschiedene Funktionen im Reifen Netzwerke1,2,3 ,4,5. Die Spezifikation der verschiedenen Subtypen der kortikalen INs ist streng reguliert durch genetische Kaskaden, die ausgiebig studiert1,2. Die Mehrheit (70 %) der kortikalen GABAergic INs stammen von Vorfahren in der medialen ganglionic Eminenz (MGE), eine ventral befindet sich embryonale Struktur und muss migrieren über relativ große Entfernungen auf die kortikale Platte1, zu erreichen 2 , 6. während kortikale Pyramidenzellen Radial auf die kortikale Platte entlang der radialen Glia-Gerüst aus der ventrikulären Zone (VZ) migrieren, die tangentiale Migration ins, die nicht zu solch einem Gerüst befestigt sind, erfordert eine Vielzahl von inneren und extrinsische Signale zu Migration von Neuronen in Richtung der kortikalen Platte zu gewinnen, und führen sie weg von nicht-kortikale Strukturen2,7,8. Nach Verlassen des Zellzyklus, INs sind abgestoßen von der MGE von Chemo-abstoßende Signale innerhalb der VZ MGE, tangentialer Übergang zu den kortikalen Platte9,10auslöst. Migration INs vermeiden das Striatum mit Hilfe von verschiedenen abstoßende Signale11 und, nach Erreichen der kortikalen Platte, sie wechseln Sie von einen tangential zu radial Migrationsmodus und erreichen ihre laminar Endlage, teils in Erwiderung auf Signale von Pyramiden Zellen12 und anderen zellularen Bevölkerungen13. Die Migration von INs, wie bei anderen neuronalen Populationen beinhaltet verschiedene dynamische morphologische Veränderungen um die tatsächliche Bewegung des Neurons zu ermöglichen. Diese so genannte neuronale Fortbewegung zeichnet sich durch sich wiederholende Zyklen von drei aufeinander folgenden Schritten: die Dehnung von einem führenden Prozess, eine aktive Anterograde Bewegung des Kerns (Nucleokinesis) und das Einfahren der nachfolgende Prozess14. BEI der Migration wird durch zahlreiche intrinsische und extrinsische Signale reguliert, die Verzweigungen und aktive Umgestaltung des führenden Prozesses INs führen in die richtige Richtung, Bestimmung, Ausrichtung und Geschwindigkeit der Migration14,15 fahren ,16.
Die Determinanten, die Regulierung der kortikalen Migration haben in den letzten Jahren1,2,7,17,18,19,20ausführlich untersucht, und Störungen in einigen dieser molekularen Akteure hat postuliert, führen zu Entwicklungsstörungen des, wie pädiatrische refraktäre Epilepsie oder Autismus Spektrum Störungen1,2,21, 22 , 23 , 24. daher die Entwicklung von in Vitro und in Vivo Ansätzen verfolgt wurden, um unsere Fähigkeit, dieser dynamischen Prozess, wie zuvor bewertete25erheblich voranbringen. In-vitro- Methoden, einschließlich der Boyden Kammer Assay und der Streifen-Wahl-Test bieten die schnellste und die meisten reproduzierbare Mittel zur Bewertung der Anforderung und Zelle-autonome Auswirkungen von bestimmten Genen oder Proteinen während der neuronalen Migration, ohne der Einfluss anderer Faktoren25. Diese Tests sind besonders nützlich in Kombination mit live-Imaging8,26,27. Mit diesen Techniken INs leicht aus e13.5 MGE abgerufen und durch enzymatische und mechanische Dissoziation, wonach verschiedene Signalwege und Anleitung Hinweise untersucht werden können, isoliert, wie zuvor dargestellt,8,28 . Doch statt diese Assays in eine künstliche extrazelluläre Matrix in Ermangelung von dreidimensionalen Gewebearchitektur, die neuronale Verhalten und Zelle Eigenschaften potenziell beeinflussen Zelle Migration und/oder überleben25verändern kann. Um diese Einschränkungen zu umgehen, wurden als alternative Instrument zur Quantifizierung der dynamischen morphologische Veränderungen während der Migration zusammen mit Parametern wie Geschwindigkeit und Orientierung14 Ex Vivo MGE Explantaten entwickelt, 29. Generierung von MGE Explantaten ist relativ einfach und wurde ausgiebig30an anderer Stelle beschrieben. Es umfasst die Beschichtung ein kleiner Auszug der MGE auf einem monomolekularen Film gemischte kortikale Zellen oder in einem Gemisch von Matrigel und Kollagen in Anwesenheit von anziehend oder abstoßend Cues25, obwohl letztere optional31 sind. MGE Explantaten ermöglichen hochauflösende Bildgebung des spärlich markierten Zellen, Vereinfachung der Studie von intrazellulären Prozessen, wie Zellskelett Umbau bei führenden Verzweigungen, wie zuvor gezeigt,32,33 ,34 und in der vorliegenden Studie. MGE Explantate sind erfolgreich benutzt worden, um dynamische Zellskelett Veränderungen während der Migration in einer 2D Umgebung, zum Beispiel nach bestimmten pharmakologischen oder chemotaktische Manipulationen zu beurteilen (siehe z. B. Tielens Et Al. 201633) . Aber mit diesem Ansatz INs Wandern innerhalb einer künstlichen Matrix, und dies könnte IN Verhalten und die Reproduzierbarkeit und die Bedeutung der experimentellen Ergebnisse verändern.
Im Gegensatz dazu in Utero Elektroporation ermöglicht die genetische Manipulation von INs in ihrer natürlichen Umgebung und ist eine weit verbreitete Methode, um schnell und effizient die Auswirkungen von Gewinn und Verlust der Genfunktion beurteilen unter Umgehung der Beschränkungen des Kosten- und zeitintensive Knockout und Knock-in Strategien25,35. In Utero Elektroporation kann auf IN Stammväter indem Zelle Art spezifische Promotoren und Positionierung der Elektroden in Richtung ventromedialen Strukturen, einschließlich die MGE36voreingenommen sein. Darüber hinaus Elektroporation ermöglicht die rechtzeitige Ausdruck der experimentellen Konstrukte innerhalb von 1-2 Tagen, Vektoren in der Gebärmutter im Vergleich zu den 7-10 Tage benötigt, Konstrukt Ausdruck virale25. Jedoch tendenziell in Utero Elektroporation von IN Stammväter geringer Sprengkraft. In der Tat, obwohl pyramidale Zelle Vorfahren liegt in der dorsalen ventrikuläre Zone effizient transfiziert werden können ist in der Gebärmutter mit Elektroporation, targeting mehr ventral befindet sich Strukturen, z. B. die MGE mehr technisch anspruchsvoll, vor allem in kleinen e13.5 reduziert Embryonen und die hohe Rate der embryonalen Tödlichkeit weiter die experimentelle Ertrag25.
Zur Umgehung der technischen Einschränkungen verbunden mit in-vitro- MGE explant Experimente und in Vivo im Mutterleib Elektroporation, ex Vivo organotypischen Slice Kulturen wurden entwickelten8,37, 38,39. Gehirn organotypischen Slice Kulturen bieten der Vorteil der Nachahmung in Vivo Bedingungen während weniger teuer und zeitaufwendig als Erzeugung von25 Tiermodelle. In der Tat, diese Präparate ermöglichen einen einfachen Zugang zu den MGE, zusammen mit der spezifischen Visualisierung von INs, und ist kombinierbar mit fokalen Elektroporation, spezifische Molekulare Signalwege im INs Migration in einem mehr physiologische Umgebung8 zu untersuchen , 39 , 40 , 41. Wir haben deshalb einen Ansatz für organotypischen Kulturen38, die wir mit Ex Utero Electroporation und Time-Lapse confocal Imaging kombiniert optimiert, zur weiteren Beurteilung die morphologischen und dynamischer Prozess auftretenden bei der tangentialen Migration von MGE-INs. Dieses Protokoll wurde angepasst und optimiert von anderen, die Ex Utero oder in Utero Gehirn Electroporation und organotypischen Slice Kulturen verwendet, um die Migration von Pyramidenzellen42,43 zu studieren und kortikale INs36,39,44. Insbesondere mausembryonen enthauptet und die MGE ist elektroporiert Ex Vivo nach der intraventrikulären Injektion von den experimentellen Plasmiden ermöglicht effizientes und präzises targeting von MGE Stammväter als erreichten mit in Utero Elektroporation. Die Köpfe werden dann extrahiert und geschnitten in Gesamt-Hirn koronalen Scheiben, die für ein paar Tage kultiviert werden können, wodurch die kontinuierliche tracking und imaging-transfizierten ins. Dieser Ansatz kennzeichnet in der Regel 5-20 tangential Migration INs pro Gehirn-Scheibe, die Minimierung von experimentellen Iterationen erforderlich, um die statistischen Signifikanz zu erreichen, während die Kennzeichnung einer ausreichend spärlichen neuronalen Bevölkerung dafür einfache Trennung von einzelner Neuronen für Wiederaufbau und feine morphologische Beurteilung. Darüber hinaus im Vergleich zu MGE Explantaten organotypischen Kulturen zu gewährleisten, dass Migration INs ausgesetzt sind ein natürlicher Umgebung, einschließlich lokal sezernierten Chemokine und Inputs thalamische afferenzen. Dieser Ansatz eignet sich daher gut zur Direktionalität und wandernden Weg angenommenen transfizierten INs, bietet ausreichend anatomische Details ermöglicht die Charakterisierung der feineren dynamische Prozesse wie führende Prozess Verzweigung zu quantifizieren, Nucleokinesis und nachgestellten Prozess zurückziehen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Commercially available neuron-specific culture medium. Complete formulation available on this website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 serum-free supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td>50X Serum-free neuron specific supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td>Commercially available neural-based culture medium supplemented with amino acids, vitamins and inorganic salts. Complete formulation available on the distributor&#39;s website&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum, heat inactivated</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>H1138-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurocell supplement N-2 100X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>305-016</td>
			<td>Botteinstein&#39;s N-2 Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Square PETG Media Bottles 125 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89132-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Type A Biosafety Cabinet</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SUC700.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D+ glucose</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>G7528-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SPM400.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>BiosShop</td>
			<td>MAG522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>AGA002.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-97 Flaming/Brown Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 mm I.D. x 75 mm Capillary Tube</td>
			<td>Drummond scientific</td>
			<td>1-000-800/12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Co</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil (heavy)</td>
			<td>Rougier Pharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WPI Swiss Tweezers #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504511</td>
			<td>11 cm, straight, 0.06x0.07mm tips, antimagnetic. You will need 2 of these.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WPI Swiss Tweezers #7</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504504</td>
			<td>11.5 cm, 0.18x0.2mm, curved tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTC Tweezers</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504617</td>
			<td>11 cm, Straight, flat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501225</td>
			<td>16 cm, Sharp/sharp, straight. You will need 3 of these.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501217</td>
			<td>12.5 cm, straight, serrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504478</td>
			<td>10.2 cm, full curve, serrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeBakey Tissue Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501996</td>
			<td>15 cm, 45&#176; angle, Delicate Jaw, 1.5mm wide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbran Microspatula with rounded ends</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>21-401-5</td>
			<td>You will need 2 of these.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond scientific</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 60, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3901</td>
			<td>60-mm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1800</td>
			<td>35-mm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Wax</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>S17432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes&#160;</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>170-CTB700-212</td>
			<td>3 mL, small bulb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica M80</td>
			<td>In replacement to our stereomicroscope which has been discontinued by the manufacturer (StereoMaster from FisherScientific)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro Square Porator</td>
			<td>BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>ECM 830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mm</td>
			<td>BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 1 1/2</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Co</td>
			<td>305127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica VT1000S Vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEM, Single edge razor blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71952-10</td>
			<td>Remove the blunt end before inserting in the blade designated space of the vibratome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 well</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td>Pack of 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell cell culture insert</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td>30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 &#181;m pore, pack of 50.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi6000 microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk confocal head Ultraview Vox</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.0 acquisition software</td>
			<td>Improvision/Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiveCell Stage top incubation system</td>
			<td>Pathology devices</td>
			<td>LC30030</td>
			<td>Provides Temperature, CO2 and humidity control.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry-Lifeact-7</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>54491</td>
			<td>Gift from Michael Davidson</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>25G bottle, certified by the Biological Stain Commission</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and organotypic slice cultures of embryonic mouse brains for live-imaging of migrating gabaergic interneurons

Gabaergen Interneuronen (INs) sind wichtige Komponenten der neuronalen Netzwerke, die Kognition und Verhalten zu steuern. Dazu bestimmt, den Kortex bevölkern INs migrieren tangential aus ihren Herkunftsort in der ventralen Telencephalon (u. a. aus der medialen und kaudalen ganglionic Eminenzen (MGE, CGE)), um die dorsale kortikale Platte in Reaktion auf eine Vielzahl von inneren und äußeren Hinweise. Verschiedene Methoden wurden im Laufe der Jahre zu genetisch bestimmte Wege zu manipulieren und zu untersuchen, wie sie die dynamische Zellskelett Änderungen erforderlich, für eine ordnungsgemäße regulieren IN der Migration. In Utero Elektroporation wurde ausgiebig genutzt, um die Wirkung des Gens Repression zu untersuchen oder Überexpression in spezifischen IN Subtypen bei der Bewertung der Auswirkungen auf Morphologie und Endposition. Jedoch während dieser Ansatz leicht Radial wandernde Pyramidenzellen ändern verwendet wird, ist es technisch schwierig wenn targeting VG In Utero Elektroporation eine geringe Ausbeute angesichts der verringerten Überlebensraten von Welpen erzeugt bei Elektroporation ist vor e14.5, wie üblich bei MGE-abgeleitete INs Studium durchgeführt. In einem alternativen Ansatz MGE Explantaten bieten einen einfachen Zugang zu den MGE und erleichtern die Darstellung der gentechnisch veränderten INs. Jedoch in diesen Explantaten INs Wandern in eine künstliche Matrix, frei von endogenen Anleitung Cues und thalamische Eingänge. Dies veranlasste uns, eine Methode zu optimieren, wo INs in einer Umgebung mit naturalistischer migrieren können, unter Umgehung der technischen Herausforderungen in Utero Ansätze. In diesem Artikel beschreiben wir die Kombination von Ex Utero Elektroporation von embryonalen mäusegehirnen gefolgt von organotypischen Slice Kulturen leicht nachverfolgen, Bild und gentechnisch veränderten INs entlang ihrer natürlichen Wege als Reaktion auf die Migration zu rekonstruieren körpereigene Signale. Dieser Ansatz ermöglicht die Quantifizierung die dynamischen Aspekte der Migration mit Time-Lapse confocal Imaging sowie die detaillierte Analyse der verschiedenen morphologischen Parameter mithilfe neuronale Rekonstruktionen auf festen Immunolabeled Gewebe.

In diesem Abschnitt bieten wir repräsentative Ergebnisse nach der Ex Utero Elektroporation ein Steuerelement Plasmid oder eine experimentelle Plasmid Ausrichtung auf ein Gen des Interesses an der MGE e13.5 mausembryonen gefolgt von organotypischen Slice Kulturen bei 37 ° C für 48 h (für Zeitraffer-Tomographie) oder 72 h (für Fixierung und immunhistochemische Kennzeichnung) inkubiert (siehe Abbildung 1 b schematische Protokoll). Repräsentative B...

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Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Ex Utero Elektroporation und organotypischen Slice Kulturen der embryonalen Mäusegehirnen für Live-Aufnahmen von Migration Gabaergen Interneuronen

Hier bieten wir eine kostengünstige und zuverlässige Methode um elektroporiert Gehirn organotypischen Slice Kulturen von mäuseembryonen geeignet für konfokale Mikroskopie und Leben-bildgebende Verfahren zu generieren.

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

9.9K Aufrufe.  Centre de recherche du CHU Sainte-Justine. Hier bieten wir eine kostengünstige und zuverlässige Methode um elektroporiert Gehirn organotypischen Slice Kulturen von mäuseembryonen geeignet für konfokale Mikroskopie und Leben-bildgebende Verfahren zu generieren.

Serie: Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotypischen hippokampalen Slice-Kulturen

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Forschung

Neurowissenschaften

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Maus in Utero Elektroporation: Kontrollierte Spatiotemporal Gene Transefection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

Organotypischen Kulturen von embryonalen ventralen Mittelhirn: Ein System zur Dopaminerge Neuronale Development Study In-vitro-</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

Die Analyse von Purkinje Zelle Dendritische Morphologie in organotypischen Kulturen

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

Erweiterung der embryonalen und adulten neuralen Stammzellen<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation oder Viral stereotaktische Injektion

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Live-Imaging der Mitose in der Entwicklung von embryonalen Maus-Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression of genes of interest to specific neuronal subtypes has proven remarkably challenging due to the relative scarcity of specific promoter elements. GABAergic interneurons constitute a neuronal population with extensive genetic and morphological diversity. Indeed, more than 11 different subtypes of GABAergic interneurons have been characterized in the mouse cortex1. Here we present an adapted protocol for selective targeting of GABAergic populations. We achieved subtype selective targeting of GABAergic interneurons by using the enhancer element of the homeobox transcription factors Dlx5 and Dlx6, homologues of the Drosophila distal-less (Dll) gene2,3, to drive the expression of specific genes through in utero electroporation.

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

Subtyp-selektive Elektroporation kortikaler Inter

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Organotypischen Kulturen zu Oligodendrozyten Dynamik und Myelinisierung Studieren

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

Die Analyse der neurovaskuläre Remodeling in Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

Zeitraffer-konfokale Bildgebung der Migration von Neuronen in der organotypischen Scheibe Kultur der embryonalen Maus Gehirn mit<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...