この仕事は、サボイ財団と治療てんかん財団からの助成金により運営された、E.R (共焦点顕微鏡) と G.H (回転ディスク共焦点顕微鏡) 革新のためのカナダの財団から助成金装置によって。小胞体からのキャリア賞を受賞、フォン デ recherche du ケベック州健康(周波数-S;Clinician-scientist 賞) でなく、健康研究 (機構; カナダの機関から若手研究者賞を受賞)。周波数 S の上級学者はガーナL.E はチュー サント-ジュスティーヌ基礎ポスドク研修賞、周波数 S ポスドク研修賞、星の財団との提携で、サボイ財団から Steriade サボイ博士課程終了後の訓練賞の受信者です。このプロジェクトはカナダ脳研究基金、ル. に与えられる健康カナダの金融支援を通じて脳カナダによって実現されました

すべての実験動物を含む Comité Institutionnel デもの Pratiques avec les チュー サント-ジュスティーヌ研究所 Animaux」(CIBPAR) で承認された、動物ケアの入門のカナダの評議会に従って実施されました。ケアと実験動物 (第 2 版) の使用。
ここで説明されているプロトコルは、日 (e) 13.5、同時にピークの CGE 派生 INs 生産45,46前に、とき MGE 派生アドインが積極的に生成される胚のエレクトロポレーション用に最適化されました。さらに、gaba 作動性インに向かってエレクトロポレーションをバイアス、アドイン (たとえば、最小限のエンハンサーとDlx5/6プロモーター)47で選択的に発現プロモーターを使用します。
1. 電気穿孔法と脊髄スライス培養用溶液の調製
<ol><li>無菌培養の培地の 125 mL を準備します。<ol>
<li>正規ニューロン固有文化媒体の 125 mL を測定 (定式化の材料表を参照してください) 以前 UV 殺菌バイオ キャビネットの滅菌瓶 70% エタノールを散布します。無血清細胞固有のサプリメントは、1.75 mL 200 mM グルタミン (最終濃度 0.5 mM) の熱不活化馬血清無菌条件下で以前検体の 6.25 mL × 50 の 2.25 mL を追加します。ミックス徹底的に、生殖不能の円錐管に 15 mL の因数と 4 ° C で保存 注意: 培地準備が 4 ° C で最大 3 週間保存することができます。</li>
		<li>無菌条件下で 150 μ 因数に X の Botteinstein の N-2 定式化48の原液 100 を分割し、使用するまで-20 ° C で凍結します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>無菌人工髄液 (アプライド) の 1 リットルを準備します。<ol>
<li>800 mL の 1 L ビーカーに蒸留水を測定します。ショ糖の 25.67 g、塩化ナトリウム (NaCl) の 5.08 g、炭酸水素ナトリウム (NaHCO3) の 2.18 g ブドウ糖、塩化カリウム (KCl) 0.19 g の 1.80 g 0.15 のグラムを追加一塩基無水リン酸ナトリウム (NaH2PO4)、1 M 在庫 CaCl 21 mL.2H2O と 1 M の 2 mL 在庫 MgSO4.7H2O. 攪拌室温で溶解します。蒸留水 1 L の総ボリュームに到達するを追加します。</li>
		<li>0.22 μ m のフィルターを使用して、滅菌バイオ セーフティ キャビネットにおける滅菌ボトルにソリューションをフィルターし、4 ° C で 1 ヶ月保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>各実験の前にアプライドで 4% の agarose の新鮮なソリューションを準備します。<ol>
<li>50 mL の生殖不能の円錐管の事前に準備されたアプライドの 25 mL を測定し、ポイントの低融点アガロースの 1 グラムを追加します。</li>
		<li>45 熱電子レンジで s。こぼれる、沸騰を開始するときにすべての 3-4 秒を加熱を中断、圧力をそれを再び閉じて、agarose をミックスする手動で攪拌させるチューブを開きます。アガロース溶液が均一になるまでを繰り返します。42 ° C で凝固を避けるために実験の残りの中にアガロース溶液を維持します。 注: より高い温度が脳組織を損傷します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 注入のプラスミッドの準備
<ol><li>ガラス製のインジェクション ピペットをプルします。<ol>
<li>マイクロ ピペット引き手適切なパラメーターを設定、設けられたスペースにはガラス毛細血管を保護し、フィラメントと中央に表示かどうかを確認します。</li>
		<li>プルダウン ボタンを押します。</li>
		<li>先端の損傷を避けるためにさらに使用するまで熱の引き手およびボックスまたはきれいなペトリ皿の場所から新しく作ったマイクロインジェクション ピペットを慎重に取り外します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>すべての計測器とキャビネットのバイオ セーフティのセットアップ必要この実験 (図 1A参照)、寛大 70% エタノールでバイオ セーフティ キャビネットにすべての楽器を散布し、楽器と 15 〜 20 分のための紫外光を用いた環境消毒します。</li>
	<li>殺菌のステップ中に氷 (4 ° C) の上のプラスミドを解凍します。</li>
	<li>きれいな 1.5 mL 遠心チューブに原液 (4 μ g/μ L) からのプラスミッドの 10 μ L を測定します。ファストグリーン FCF の 0.01% を追加します。穏やかに混合、簡単にスピンし、氷に使用されるまで続けます。 注: マキシ prep DNA は、エンドトキシン フリー マキシ準備キットを使用して製造元のプロトコルに従って準備されるべき。TE バッファーまたはヌクレアーゼ フリー DNA を可溶化することができます H2O および生殖不能の条件の下で実行する必要はありませんが、色素のソリューションが付いているプラスミッドの準備。マキシ prep からプラスミドを複数凍結融解サイクルを避けるために検体にする必要があります。検体プラスミド染付ないよりその 2 h 使用の前に混合されるべきそれ以上の使用のない凍結する必要があります.</li>
	<li>滅菌後、ナノ インジェクターをとおり準備します。<ol>
<li>クリーン ボックスまたはペトリ皿と約 15 μ m の外径を達成する斜めの方法でピペットの先端をカットする小さなピンセットに格納されている事前に準備されたガラス製のインジェクション ピペットのいずれかを選択します。 注: ここに与えられた外径ユーザーの我々 は、我々 の実験のアイデアを与えるに概数で、流体を許可しながら、脳を損傷することがなくプラスミド注射用スカルのピアスを容易にするために最適化されていますローディングおよび DNA のリリース。外径は、明視野顕微鏡下のミクロ スケール バーにあてるガラス マイクロインジェクション ピペットのカットを見ることによって測定できます。</li>
		<li>注射器を使用して、その unpulled の終点 (すべての空気を吐き出す) から鉱物油で、ピペットを塗りつぶします。</li>
		<li>製造元の指示に従い、ナノ インジェクターに充填ガラス マイクロ ピペットを挿入します。</li>
		<li>空 2/3 rds ガラス マイクロ ピペット (空気のエントリを防ぐために十分な油を維持する)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>慎重に管内プラスミド/染料の解決の準備のマイクロ ピペットを挿入、プラスミド/色素溶液をガラス マイクロ ピペットを埋めます。</li>
</ol>3 妊娠中の女性からマウス胚のコレクション
<ol><li>膣をプラグインするため、できれば毎日同じ時間 (午後の早い時間) に評価するために毎日の繁殖の女性を監視します。日 e0.5 は膣にプラグが観察される最初の日に対応します。 注: ここで説明した実験は、野生型マウスで実施できます。ただし、MGE の識別を容易とすべての gaba 作動性を (または特定のサブ セット MGE 派生アドインなど) のラベルには、トランスジェニック動物使用できます (例: GAD67EGFP;Dlx5/6Cre Cre レポーター遺伝子など47,49と)。このような状況で注入実験プラスミドは transfected INs の可視化を (黄色) 非 transfected INs (緑) とを比較できるように、別の蛍光体 (例えばmCherryまたはTdTomato) を表現しなければなりません。</li>
	<li>首脱臼によって胚日 e13.5 に女性を犠牲に。 注: 犠牲の時に指定された麻酔薬の移行と生存の50,51で影響を与える可能性があり、避けるべきであります。</li>
	<li>とおり、帝王切開によって胚を収集します。<ol>
<li>70% エタノール スプレー女性の腹部の寛大。滅菌ピンセットのペアで腹部の皮膚を引き上げて、もう一方の手で、腹部から皮膚をカットする滅菌手術用ハサミを使用してください。</li>
		<li>滅菌ピンセットとはさみの 2 番目のペアで腹部の筋膜を引き上げ、子宮を慎重に回避しながらカットします。</li>
		<li>滅菌ピンセットとはさみの 3 番目のペアを使用して、子宮の角を引き、骨盤腔内のそれらをカットします。60 mm の滅菌シャーレで、アミノ酸、ビタミン、無機塩類 (市販製品の材料の表を参照) を添加した神経系培養培地でいっぱいに切り裂かれた子宮角を配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>滅菌バイオ セーフティ キャビネット、胎盤から胎児を解剖し、斬首でヘッドを分離する高級ピンセット (それぞれの手に 1 つ) の 2 つのペアを使用します。</li>
	<li>面取りカット 3 mL の滅菌プラスチック転送ピペットの先端を吸引ヘッドと転送凝固黒ワックス層し、同じ神経ベースでいっぱい新しい滅菌 60 mm のペトリ皿に補足として上記培。 注: この手順は、(マウス毛、血液) は汚染物質の移動を最小限に抑えます。黒のワックスは、解剖時に頭を安定させるために使用されます。培地は、これらの手順の中に酸素を受け取る必要はありません。</li>
</ol>4. 心室プラスミド注射と、MGE のEx Vivoエレクトロポレーション
注: 次の手順は、事前に準備されたバイオ セーフティ キャビネットの無菌条件下で実行する必要があります。
<ol><li>場所 60 mm のペトリ皿層黒ワックスであり、バイオ セーフティ キャビネットの双眼鏡の下で培を補足ニューラル ベースで首のない頭を含みます。</li>
	<li>頭、右、左の手で高級ピンセットで直面している吻側部を安定させるし、右手で右側脳室にプラスミド/色素溶液の 1-2 μ L を注入するナノ インジェクターを使用します。 注: 共発現実験をすることができます co electroporating がモル濃度で両方のプラスミドの混合により救助プラスミッドおよび shRNA 発現プラスミドを行います。</li>
	<li>Electroporate 注入された脳。<ol>
<li>背側に配置され、頭に並列負電極と電極と対象とする、MGE 頭の腹側に向かって正の電極の間に頭を配置します。</li>
		<li>電極に位置付けている、一度 500 ms、50 ms の 40 V の 4 正方形パルス パルス間間隔を提供します。</li>
		<li>既にキャビネット、バイオ セーフティにおける配置ピンセットを使用して電極から任意の残留組織を削除します。 注: これらのパラメーターは、実験に用いた遺伝子導入装置のために特別に最適化されています。遺伝子導入装置の異なる種類を使用している場合ユーザー最適化テストを前もって実行することをお勧めします。</li>
		<li>すべての残りの脳の 4.1 から 4.3 の手順を繰り返します。 注: このプロトコルでは、1 つの脳のために必要な操作について説明しますが、収量が増えてそれぞれの脳 electroporating の前に順番に最大 4 脳を差し込むことが可能です。この戦略は、2 つまたは複数の異なるプラスミド注入される順番に (コントロールまたは実験プラスミドなど) (同腹子と比較できるように) 同じ実験中に特に有利であります。さらに、それは注入することが可能と electroporate 同時に電極を脳の表面に完全に平行に配置することで、収量を増やすには、脳の両側。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 脳の解剖と脊髄スライス培養
<ol><li>まだ、バイオ セーフティ キャビネットの無菌環境で操作しながら頭蓋骨から脳を解剖します。<ol>
<li>脳を慎重に回避しながらそれぞれの目に針を挿入することによって黒いワックスの層に頭を安定させます。</li>
		<li>首の左側にある 2 番目の最後部から、頭蓋骨から皮膚を引き裂く高級ピンセットのペアを保持するのに高級ピンセットのペアを使用します。</li>
		<li>片方の手でピンセットで頭を横方向に押しながら、脳幹のレベルで頭蓋骨を慎重にカットし、頭蓋骨を軽く引いて別のペアのもう一方の手でピンセットを使用します。各ピンセット, フロントに向かって、矢状面 (正中線) の頭蓋骨をカットし、頭骨の断片を解放するために横方向に切開します。</li>
		<li>脳幹を持ち上げ、髄膜と脳神経を脳が頭蓋骨から完全になるまで慎重にカットします。 注: 5.1 で説明したすべてのステップは、バイオ セーフティ キャビネットにおける厳格な無菌条件の下で行わなければなりません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>4% ポイント agarose の区分のための低融点で脳を埋め込みます。<ol>
<li>(42 ° C で液体を保持) 上記準備アガロース溶液で 35 mm のペトリ皿を埋めます。</li>
		<li>以前カット転送ピペットを使用して agarose いっぱい料理に electroporated 脳をすばやく転送します。室温で料理をしてください。</li>
		<li>(沈没を防ぐため) によく途中で脳を保つために金属棒でアガロースをかき混ぜると吻尾側平面に脳を料理に並列に位置します。固める、脳損傷を避けるために agarose の起動時を攪拌を停止します。</li>
		<li>かみそりの刃を使用すると、脳の周り 1-2 ミリの余白を残して、長方形のブロックを形成するために、脳を取り巻くアガロースをカットします。脳の吻側部が手順については、後続の断面の向きを容易にブロックの前方限界に垂直になるようにします。</li>
		<li>それぞれの脳に繰り返します。 注: それぞれの脳をさまざまな高さで設定中独立したアガロース ブロックを形成して時 (最大 3) 2 つ以上の脳を切断が可能です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vibratome コロナ セクションとスライス培養。<ol>
<li>100 X N-2 の雪解け 1 つの因数は、氷の上 (150 μ L) を補完し、検体無菌条件下で培地 15 mL を加えます。</li>
		<li>6 ウェル培養プレートの各ウェルに培地 (の 1 つ X N2 の補足) 750 μ L を転送します。</li>
		<li>ツル首ピンセットで培地充填も各細胞文化挿入 (直径 30 mm、0.4 μ m の細孔径、PTFE) を配置します。</li>
		<li>連続的に酸素のアプライドで vibratome お風呂を埋めます。お風呂の周囲の氷と 4 ° C に冷却または冷蔵 vibratome を使用します。</li>
		<li>&Gt;0.150 mm/s と 80 ヘルツに周波数 vibratome 速度を設定します。</li>
		<li>アガロース ブロック vibratome プラットフォーム、吻側端を下向きに、腹側を接着端のユーザーが直面しています。</li>
		<li>(4 ° C) で 250 μ m 厚のセクションを取得するコロナ セクションで脳をカットします。</li>
		<li>滅菌へら MGE と慎重にセクション間の重複を回避しながら、単一の 30 mm 膜 1 つの動物からすべての脳のセクションを挿入する場所を含む 2-3 セクションを収集します。(前述の通り補った培地、750 μ L を含む) 6 ウェル培養プレートのウェル 1 個に挿入を配置します。また、各セクションは、500 μ l 添加した培養液でいっぱい 12 ウェル培養プレートの別々 の 13 mm 径膜に配置できます。培養液を各ウェルに推奨量では、水没することがなくメディアを栄養する脳セクションことができます。 注: 5.3.6 5.3.7 で説明されている手順が実行されない完全な無菌条件の下で、vibratome の滅菌処理・ バイオ セーフティ キャビネットで使用しない限り。したがって、任意の汚染を避けるために注意深く手順を実施することが重要です。適切な保護具 (クリーン マスク、手術用手袋、白衣) に着用するべきすべての時間や身体の部分も覆われているような髪、顔、手、培養皿 (培養液の有無にかかわらず) に渡してください。また、手袋とへらの脳のセクションを収集するために使用頻繁に 70% エタノールをスプレーすることをお勧めします。</li>
		<li>48 または 72 h の 60% 湿度と 5% CO2と 37 ° C で換気滅菌インキュベーターで培養プレートを配置します。 注: これらのインキュベーション時間が MGE 派生アドインのタイムラプス イメージングと固定のスライスの共焦点イメージングそれぞれ最適化されました。最適なインキュベーション時間は、各実験的なデザインの事前テスト必要があります。さらに、選択した培養が 72 時間の場合と下、培養培地を変更する必要はありません。インキュベーション時間が長く、培養培地は 2-3 日毎変更必要があります。</li>
		<li>目的の培養時間後 8 腔症 coverslip に関心のセクションを転送し、培地の 3-5 μ L を追加します。(37 ° C、湿度 60%、5% CO2) 環境室 coverslip が逆に接続されている場所は回転ディスク共焦点タイムラプス イメージング セッション セットアップするコンピューター援用取得ソフトウェアを装備しました。 注: また、セクション 4% パラホルムアルデヒド (一晩で 4 ° C または室温で 2 時間)、その後 electroporated を共焦点の下の形態学的特徴の可視化のための異なった抗体と immunostained で修正されることができます。顕微鏡。EGFP と mCherry 任意のプロシージャを反汚すことがなく共焦点顕微鏡で目視できる、固定プロセスは、蛍光を減らすことができるので、信号を向上させる GFP および mCherry に対する免疫組織化学を行うお勧めの削減先頭または末尾のプロセスの小さい枝などの萌芽期ニューロンの細かい成分の検出。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。ここの見解厚生労働大臣またはカナダ政府の見解を必ずしも表さない。

この記事で私たちは子宮 ex e13.5 にマウス MGE のエレクトロポレーションを実行するため、胎生期脳スライスの切片文化の生成のための信頼性の高い方法を提供します。体外メソッドでは、ボイデン室アッセイなどは比較的簡単に実行および異なる遺伝子やその他の要因を干渉することがなくタンパク質の特定の役割を評価するために使用することができます、彼らを排除するで?...

皮質 gaba 作動性介在ニューロン (INs) はその生化学的性質、生理学的性質と接続性に関して多様であり、彼らは成熟したネットワーク1,2,3 でさまざまな機能を仲介します。、4,5。皮質の INs のさまざまなサブタイプの仕様が広く調査1,2されている遺伝子のカスケードを堅く調整されます。大脳皮質 gaba 作動性 INs の大部分 (70%) 内側神経節隆起 (MGE)、腹側に位置する萌芽期の構造の前駆細胞に属し、皮質板1、に到達する比較的長い距離の間で移行する必要があります。2,6皮質錐体細胞に移行放射状グリア細胞足場に沿って皮質板 (VZ) の心室の地帯から放射状、さまざまな組み込みが必要ですこのような足場に接続されていない、あるプラグインの接線方向の移動と。非皮質構造2,7,8から彼らを指導しながら皮質板へ移行するニューロンを誘致する外因性の手がかり。細胞周期を終了すると、アドインは、MGE から皮質板9,10に向かって接線方向の移動をトリガーする MGE の VZ 内で表現される化学療法反発手掛かりによって撃退されます。アドインの移行異なる反発手掛かり11の援助と線条体を避けるため、皮質板に達すると後、彼らは、接線方向から放射状移動モードに切り替えるし、錐体からキューに応答の一部の彼らの最終的な層流位置に到達セル12と他の細胞集団13。他の神経細胞の集団として、アドインの移行は、ニューロンの実際の動きを許可する様々 な動的形態変化を伴います。このいわゆる神経運動は 3 つの連続する手順の反復的なサイクルによって特徴付けられる: 主要なプロセス、核 (nucleokinesis) のアクティブな前向性モーション、後続プロセス14の撤回の伸長。移行ではドライブの分岐と向きと移行14,15 の速度を決定する、適切な方向に INs を導く主要なプロセスのアクティブな改造多数の組み込みと外因性手掛かりによって規制されて ,16。
移行した皮質を規制する要因は、近年1,2,7,17,18,19、20、広く研究されています。つながる神経発達障害、小児難治性てんかんや自閉症スペクトル障害1,2,21,などいくつかのこれらの分子の俳優の中断が仮定されています。22,23,24します。 したがって、生体外でそして生体内の様々 なアプローチの開発は以前に再検討された25として、動的な過程を研究する当社の能力が大幅に躍進する追求されてきた。体外メソッド、ボイデン室アッセイとストライプの選択法などを含む神経移行中に要件と特定の遺伝子または蛋白質の細胞の自律的影響を評価するための最速かつ最も再現性のある手段を提供します。他の影響を受けずに25 をを要因します。これらのアッセイは、ライブ イメージング8,26,27と組み合わせると特に役立ちます。これらの技術を簡単に e13.5 MGE から取得および8,28 を以前示すようにその後様々 なシグナル伝達経路と指導の手がかりを調べることができます、酵素と機械的解離によって分離.ただし、これらの試金は細胞遊走や生存25に影響を与える可能性がある神経細胞の挙動と細胞プロパティを変更するかもしれない三次元組織アーキテクチャの不在で人工細胞外マトリックスの場所を取る。これらの制限を回避するためにex vivo MGE 植は、速度と方向で14などのパラメーターと共に移行中に発生する動的形態学的変化を定量化するための代替ツールとして開発されています。 29。MGE 植を生成するは比較的簡単です、広くされている30を他の場所で説明されています。それは後者がオプション31マトリゲルと魅力的または冷淡なキュー25の存在下でコラーゲンの混合物、混合の大脳皮質細胞の膜上に MGE の小さな抽出物のめっきを伴います。MGE 植まばら標識細胞のイメージング、32,33 を示したように分岐、主要なプロセス中に骨格改造など、細胞内のプロセスの研究を簡素化する高解像度を可能にします。、34本研究で。MGE 植は、(例えば、Tielensら201633を見なさい) 特定の薬理学的または遊走操作後例えば 2D 環境での移行時に骨格変化を評価するために正常に使用されています。.ただし、この方法で、人工マトリックス内にアドインを移行、これは動作と再現性実験結果の有意性を変更可能性があります。
対照的に、子宮内でエレクトロポレーションのネイティブ環境でプラグインの遺伝子操作を有効にし、迅速かつ効率的の制限を回避しながらゲインの影響と遺伝子機能の損失を評価するために広く使用されている方法です。高価な時間のかかるノックアウトとノックで戦略25,35。セル型特定プロモーターを使用し、MGE36を含む腹内側核の構造への電極を配置することで、子宮内でエレクトロポレーションを前駆細胞で偏ってすることができます。さらに、子宮内エレクトロポレーションにより実験的構造を 1-2 日内のタイムリーな表現のため構造式を用いたウイルスに必要な 7-10 日に比べてベクトル25。しかし、子宮内でエレクトロポレーションの前駆細胞の低降伏点傾向があります。確かに、背側心室ゾーンにある錐体細胞の前駆細胞を効率的に導入することができますが子宮内を使用して、MGE より腹側に位置する構造をターゲット エレクトロポレーションより技術的に難しいは特に小さな e13.5 に胚と胚性致死性さらに率が高い実験的利回り25が減少します。
体外に関連する技術的な制限のいくつかを回避するために MGE は実験と体内の子宮内でエレクトロポレーションを外植体、脊髄スライス培養前のヴィヴォが開発した8,37をされています。 38,39。脳切片スライス文化提供は安価で生成する動物モデル25よりも時間がかかるしながら体内を模倣の利点が条件します。確かに、これらの準備はプラグインの具体的な可視化と共に、MGE へ簡単にアクセスを許可するより生理的環境8に移行するアドインの特定の分子経路を調査する焦点エレクトロポレーションと組み合わせることができます。,39,40,41我々 はしたがって切片文化38、 ex 子宮穿孔と時間経過の共焦点レーザー顕微鏡と組み合わせて我々 のアプローチを最適化して、さらに形態学的および動的処理の発生評価。中に MGE アドインの接線方向の移動。この議定書は適応し、錐体細胞42,43の移行を検討するex 子宮または子宮内脳エレクトロポレーションと脊髄スライス培養を使用している人から最適化されたと皮質 INs36,,3944。具体的には、首をはねられマウス胚と、MGE は electroporated ex vivo実験プラスミドの脳室内注入後より効率的かつ正確に達成できるものよりも MGE 前駆細胞のターゲット子宮内エレクトロポレーション。脳が抽出されると全脳辺縁系を数日間培養することができますに分割、ので、連続追跡 transfected INs のイメージングします。このアプローチは、通常脳スライスあたりの 5-20 接線方向に移行する INs を容易に分離できるように十分にまばらなニューロン集団をラベリングしながら統計的有意性に到達するために必要な実験の繰り返しの数を最小限に抑えることをラベルします。復興と微細形態学的評価のため個々 のニューロン。さらに、切片文化確実に移行する MGE 植に比べて INs はローカル分泌ケモカインと求心系の視床からの入力などを含むより自然な環境に公開されます。この方法は方向性と主要なプロセスの分岐など細かい動的プロセスの評価を許可する十分な解剖学的な詳細を提供している間 transfected INs によって採択された渡り鳥のパスを定量化するに適してnucleokinesis と後続のプロセス撤回。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Commercially available neuron-specific culture medium. Complete formulation available on this website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 serum-free supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td>50X Serum-free neuron specific supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td>Commercially available neural-based culture medium supplemented with amino acids, vitamins and inorganic salts. Complete formulation available on the distributor&#39;s website&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum, heat inactivated</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>H1138-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurocell supplement N-2 100X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>305-016</td>
			<td>Botteinstein&#39;s N-2 Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Square PETG Media Bottles 125 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89132-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Type A Biosafety Cabinet</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SUC700.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D+ glucose</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>G7528-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SPM400.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>BiosShop</td>
			<td>MAG522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>AGA002.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-97 Flaming/Brown Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 mm I.D. x 75 mm Capillary Tube</td>
			<td>Drummond scientific</td>
			<td>1-000-800/12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Co</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil (heavy)</td>
			<td>Rougier Pharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WPI Swiss Tweezers #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504511</td>
			<td>11 cm, straight, 0.06x0.07mm tips, antimagnetic. You will need 2 of these.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WPI Swiss Tweezers #7</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504504</td>
			<td>11.5 cm, 0.18x0.2mm, curved tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTC Tweezers</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504617</td>
			<td>11 cm, Straight, flat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501225</td>
			<td>16 cm, Sharp/sharp, straight. You will need 3 of these.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501217</td>
			<td>12.5 cm, straight, serrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504478</td>
			<td>10.2 cm, full curve, serrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeBakey Tissue Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501996</td>
			<td>15 cm, 45&#176; angle, Delicate Jaw, 1.5mm wide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbran Microspatula with rounded ends</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>21-401-5</td>
			<td>You will need 2 of these.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond scientific</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 60, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3901</td>
			<td>60-mm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1800</td>
			<td>35-mm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Wax</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>S17432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes&#160;</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>170-CTB700-212</td>
			<td>3 mL, small bulb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica M80</td>
			<td>In replacement to our stereomicroscope which has been discontinued by the manufacturer (StereoMaster from FisherScientific)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro Square Porator</td>
			<td>BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>ECM 830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mm</td>
			<td>BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 1 1/2</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Co</td>
			<td>305127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica VT1000S Vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEM, Single edge razor blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71952-10</td>
			<td>Remove the blunt end before inserting in the blade designated space of the vibratome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 well</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td>Pack of 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell cell culture insert</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td>30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 &#181;m pore, pack of 50.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi6000 microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk confocal head Ultraview Vox</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.0 acquisition software</td>
			<td>Improvision/Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiveCell Stage top incubation system</td>
			<td>Pathology devices</td>
			<td>LC30030</td>
			<td>Provides Temperature, CO2 and humidity control.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry-Lifeact-7</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>54491</td>
			<td>Gift from Michael Davidson</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>25G bottle, certified by the Biological Stain Commission</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and organotypic slice cultures of embryonic mouse brains for live-imaging of migrating gabaergic interneurons

Gaba 作動性介在ニューロン (INs) は、ドライブの認知・行動神経ネットワークの重要なコンポーネントです。大脳皮質を設定する運命を移行で腹側に組み込みと外因性の終脳 ((MGE、CGE) 内側と尾節大物を含む) さまざまなレスポンスで背側骨皮質骨板に起源の場所から接線方向手がかり。異なる方法論は遺伝子特定の経路を操作し、適切に必要な細胞骨格の動的な変化を調整する方法を調査に長年にわたって開発されている移行。子宮内エレクトロポレーションは遺伝子発現抑制の効果を研究に広く使用されています。 または形態および最終的な位置への影響を評価しながら過剰発現の特定のサブタイプします。ただし、このアプローチは容易に放射状に移行する錐体細胞を変更するのには使用されますが、それはより技術的に困難な子犬の減少生存率を与えられる低降伏点が生成される子宮内保険エレクトロポレーションをターゲットとエレクトロポレーションは、e14.5、MGE 派生アドインの勉強は、慣習として前に行われています。別のアプローチで MGE 植、MGE へ簡単なアクセスを提供、遺伝子組み換えの INs のイメージングを容易にします。ただし、これらの植で INs は内因性指導手掛かりおよび視床入力を欠いている、人工マトリックスに移行します。これは、アドインが子宮内アプローチの技術的な課題を回避しながらより自然主義的な環境で移行できますメソッドを最適化するために私たちを促した。本稿で述べるマウス萌芽期の脳脊髄スライス培養を容易に追跡、イメージおよびに応えて自然のパスに沿って移行する遺伝子組み換えのプラグインを再構築後のex 子宮穿孔の組み合わせ内因性の手がかり。このアプローチは定量化カルビンディン抗体に固定組織の神経再建を使用して様々 な形態学的パラメーターの詳細な分析と同様、コマ撮りの共焦点レーザー顕微鏡を使用して移行での動的な側面のことができます。

このセクションで我々 は制御プラスミドや脊髄スライス培養続いて e13.5 マウス胚の MGE の興味の遺伝子をターゲット実験プラスミドのex 子宮穿孔の後得られた代表的な結果を提供します。37 ° C (タイムラプス イメージング) の 48 時間または 72 h (固定および免疫組織化学的分類) で培養 (スケマティック プロトコルの図 1 bを参照)。MGE 植?...

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Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Ex 子宮エレクトロポレーションと gaba 作動性介在ニューロンの移行のライブ イメージング用マウス萌芽期の脳の脊髄スライス培養

ここでは、共焦点顕微鏡とライブ イメージング技術に適したマウス胚から electroporated 脳脊髄スライス培養を生成する低コストかつ信頼性の高い方法を提供します。

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

ex-utero-electroporation-organotypic-slice-cultures-embryonic-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

9.9K ビュー.  Centre de recherche du CHU Sainte-Justine. ここでは、共焦点顕微鏡とライブ イメージング技術に適したマウス胚から electroporated 脳脊髄スライス培養を生成する低コストかつ信頼性の高い方法を提供します。

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Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

器官型海馬切片培養

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

神経科学

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

マウス子宮内でエレクトロポレーション：制御時空間遺伝子導入

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

胚腹側中脳の器官型スライス培養：ドーパミン作動性ニューロンの発達を研究するための体制 in vitroで</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

器官切片培養におけるプルキンエ細胞の樹状突起の形態分析

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

によって胚および成体神経幹細胞の拡大<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーションまたはウイルス定位注射

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

発生中のマウス胚性皮質における有糸分裂のライブイメージング

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression of genes of interest to specific neuronal subtypes has proven remarkably challenging due to the relative scarcity of specific promoter elements. GABAergic interneurons constitute a neuronal population with extensive genetic and morphological diversity. Indeed, more than 11 different subtypes of GABAergic interneurons have been characterized in the mouse cortex1. Here we present an adapted protocol for selective targeting of GABAergic populations. We achieved subtype selective targeting of GABAergic interneurons by using the enhancer element of the homeobox transcription factors Dlx5 and Dlx6, homologues of the Drosophila distal-less (Dll) gene2,3, to drive the expression of specific genes through in utero electroporation.

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

皮質介在ニューロンのサブタイプ選択的エレクトロポレーション

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

オリゴデンドロサイトダイナミクスと髄鞘形成を研究するための器官型スライス培養

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

Entorhino海馬器官型スライス培養における神経血管リモデリングの解析

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

胚性マウス脳の器官型スライス培養における移行ニューロンの経時的共焦点イメージング<em&gt;ウテロの</em&gt;エレクトロポレーション

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Ex 子宮エレクトロポレーションと gaba 作動性介在ニューロンの移行のライブ イメージング用マウス萌芽期の脳の脊髄スライス培養

Ex 子宮エレクトロポレーションと gaba 作動性介在ニューロンの移行のライブイメージング用マウス萌芽期の脳の脊髄スライス培養