Bu eser Savoy Vakfı ve tedavi epilepsi Vakfı'nın hibe işletim tarafından desteklendi ve ekipmanı tarafından yenilik için Kanada Vakfı E.R (confocal mikroskop) ve G.H (iplik disk confocal mikroskop) verir. Acil serviste bir kariyer ödülü alır Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S; Clinician-Scientist Ödülü) yanı sıra--dan Kanada Enstitüleri gibi Sağlık Araştırma (CIHR; Genç Araştırmacı Ödülü). G.H. FRQ-S. üst düzey bir bilim adamı olduğunu L.E Savoy temelden, CHU Sainte-Justine Vakfı doktora sonrası Eğitim Ödülü ve FRQ-S doktora sonrası Eğitim Ödülü, yıldız Vakfı ile ortaklaşa Steriade-Savoy doktora sonrası Eğitim Ödülü alıcı olduğunu. Beyin Kanada Kanada beyin araştırma fonu, sağlık Kanada, Le için verilen mali desteği ile yoluyla, mümkün yapılmış bu proje

Tüm Deney hayvanları içeren Comité Institutionnel des Bonnes Pratiques avec les CHU Sainte-Justine araştırma Merkezi'nde Animaux de Recherche (CIBPAR) tarafından kabul edildi ve Kanada Konseyi hayvan bakım'ın rehberinde uygun olarak yapılmıştır Care and Use deneysel hayvan (Ed. 2).
Burada açıklanan protokol için embriyo elektroporasyon embriyonik gün (e) bir anda 13,5, ne zaman INs MGE kaynaklı aktif olarak oluşturulur, tepe CGE kaynaklı INs üretim45,46önce optimize edildi. Ayrıca, doğru GABAergic INs elektroporasyon önyargı için biz seçerek bileşenler (örneğin, en az artırıcı ile Dlx5/6 organizatörü)47yılında ifade bir organizatörü kullanın.
1. adım ve Organotypic dilim kültürler için çözümler hazırlanması
<ol><li>125 mL steril kültür ortamı hazırlamak.<ol>
<li>125 mL normal nöron özel kültür ortamının ölçmek ( Tablo malzemeleri formülasyon için görmek) bir daha önce UV sterilize Biyogüvenlik kabini steril bir şişede % 70 etanol ile püskürtülür. 50 serum Ücretsiz Nöron özel ek, 1,75 mL 200 mM glutamin (son konsantrasyonu 0.5 mm) ve ısı inaktive at serum steril koşullar altında daha önce bölünmemeli 6.25 mL x 2,25 mL ekleyin. İyice, aliquot 15 ml steril konik tüpler karıştırın ve 4 ° C'de depolayın Not: Hazırlanan kültür orta 4 ° C'de 3 hafta kadar depolanabilir</li>
		<li>150 µL aliquots steril koşullarda bir 100 hisse senedi çözüm Botteinstein'ın N-2 formülasyonu48 X böler ve kadar kullanmak-20 ° C'de dondurmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Steril yapay serebrospinal sıvı (ACSF) 1 L hazırlayın.<ol>
<li>800 mL distile su bir 1 L ölçek ölçmek. 25.67 g Sükroz, 5,08 g sodyum klorür (NaCl), sodyum bikarbonat (NaHCO3), 2.18 g glikoz, 0,19 g Potasyum klorür (KCl), 1.80 g yem mono susuz sodyum fosfat (NaH2PO4), 0.15 g 1 M stokunun CaCl2 1 mL ekleyin. .2H2O ve 1 m 2 mL stok MgSO4.7H2oda sıcaklığında çözülmeye O. heyecan. Toplam hacmi 1 L. ulaşmak için distile su ilave</li>
		<li>0,22 µm filtresini kullanarak, steril şişede steril Biyogüvenlik kabini içine çözüm filtre ve 4 ° C'de 1 ay için saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ACSF içinde % 4 özel her deneme önce taze bir çözüm hazırlamak.<ol>
<li>Önceden hazırlanmış ACSF 50 mL steril konik tüp içinde 25 mL ölçmek ve düşük erime noktası özel 1 g ekleyin.</li>
		<li>45 için ısı fırın mikrodalga bir de s. Dökülmesini önlemek için ne zaman kaynama başlar her 3-4 s Isıtma kesme, tüp basıncı dışarı, tekrar kapatın ve el ile özel karıştırmak için kışkırtmak izin açın. Özel çözüm homojen gelene kadar bunu tekrarlayın. Özel çözüm 42 ° C'de katılaşma önlemek için deney sırasında geri kalanı tutmak. Not: Daha yüksek sıcaklıklarda beyin dokuları zarar verir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. enjeksiyon için plazmid hazırlanması
<ol><li>Bir cam mikroenjeksiyon pipet çekin<ol>
<li>Micropipette çektirme uygun parametrelerle ayarla, cam kılcal sağlanan uzayda güvenli ve filaman ile merkezli olduğundan emin olun.</li>
		<li>Çekme düğmesine basın.</li>
		<li>Dikkatli bir şekilde yeni yapılan mikroenjeksiyon Pipetler ısı puller ve yerin kutusundaki veya temiz petri kabına ucu zarar görmesini önlemek için daha fazla kullanılmasını kadar kaldırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kurulum tüm aletleri ile kabine Biyogüvenlik bunun için (bkz. şekil 1A) deneme, cömertçe tüm araçları Biyogüvenlik kabini % 70 etanol ile sprey ve sterilize cihazları ve çevre için 15-20 dk UV ışığıyla.</li>
	<li>Sterilizasyon adımı sırasında plazmid buz (4 ° C) çözülme.</li>
	<li>Plazmid hisse senedi çözüm (4 µg/µL) üzerinden 10 µL temiz 1.5 mL santrifüj tüpüne ölçmek. Hızlı yeşil FCF % 0,01 ekleyin. Karışımı yavaşça, kısaca spin ve buz üzerinde kullanımda kadar devam. Not: Maxi-prep DNA bir endotoksin-Alerjik maxi-hazırlık seti üreticinin iletişim kuralı'nı göre hazırlanmalıdır. DNA TE arabellek veya nükleaz ücretsiz çözündürüldükten H2O ve boya çözüm olabilir, ama ile plazmid hazırlanması steril koşullarda gerçekleştirilmesi gerekir değil. Plazmid Maxi-hazırlık üzerinden birden çok donma-çözülme döngüsü önlemek için bölünmemeli olmalıdır. Bölünmemeli Plasmid'ler ile boya yok daha fazla o 2 h kullanmadan önce karışık olabilir ve daha fazla kullanım için refrozen değil.</li>
	<li>Sterilizasyon sonra aşağıdaki gibi nano-enjektör hazırlayın.<ol>
<li>Bir temiz kutusu veya petri kabına pipet ucu bir dış çapı yaklaşık 15 µm ulaşmak için eğimli bir şekilde kesmek için küçük cımbız kullanın saklanan önceden hazırlanmış cam mikroenjeksiyon pipet birini seçin. Not: Burada verilen dış çap kullanıcı bizim deneylerde kullandığımız bir fikir vermek için yaklaşık bir ölçüsüdür ve plazmid enjeksiyon için kafatasının piercing için sıvı izin verirken beynin zarar vermeden kolaylaştırmak için en iyi duruma getirilmiş Yükleme ve DNA'ın yayın. Dış çapı ölçmek kesme parlak alan mikroskop altında micrometric ölçek çubuğu için apposed cam mikroenjeksiyon pipet ucu bakarak.</li>
		<li>Bir şırınga ile madeni yağ (tüm havayı çıkarmak için) unpulled sonundan micropipette doldurmak için kullanın.</li>
		<li>Doldurulmuş cam micropipette nano-enjektör içinde üreticinin yönergeleri izleyerek ekleyin.</li>
		<li>Boş 2/3'ünü (Hava girişini engellemek için yeterli yağ tutma) cam micropipette.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dikkatle hazırlanmış micropipette plazmid/boya solüsyon içeren tüpe takın ve cam micropipette plazmid/boya çözüm ile doldurun.</li>
</ol>3. fare embriyo gelen hamile kadın koleksiyonu
<ol><li>Vajinal, tercihen aynı zamanda her gün (erken öğleden sonra) tanıttığım için değerlendirmek için üreme kadın her gün izlemek. Gün e0.5 ne zaman vajinal bir fiş gözlenen ilk gün karşılık gelir. Not: Burada açıklanan deneyler vahşi tipi fareler yapılabilir. Ancak, MGE tanımlaması kolaylaştırmak ve bütün GABAergic INs (veya belirli alt kümelerini MGE kaynaklı bileşenleri gibi) etiket Transjenik hayvanlar kullanılabilir (örneğin: GAD67EGFP; Dlx5/6Cre Cre-muhabir gen, vb47,49ile). Bu durumda, enjekte deneysel plazmid görselleştirme transfected ins (sarı) (yeşil) transfected INs ile karşılaştırılabilir izin vermek için başka bir fluorophore (örneğin mCherry veya TdTomato) hızlı.</li>
	<li>Erkek, embriyonik gün e13.5, boyun çıkığı tarafından kurban. Not: anestezik ajanların kurban anda verilen geçiş ve hayatta kalma50,51 de etkileyebilir ve kaçınılmalıdır.</li>
	<li>Embriyo sezaryen tarafından aşağıdaki gibi toplamak.<ol>
<li>Cömertçe kadın karın % 70 etanol ile sprey. Karın deri çift sterilize Forseps ile yukarı çekin ve diğer elini de steril Cerrahi makas karın derisini kesmek için kullanın.</li>
		<li>İkinci bir çift sterilize forseps ve makas ile karın fasya yukarı çekin ve dikkatli bir şekilde rahim kaçınırken kesti.</li>
		<li>Üçüncü çifti sterilize forseps ve makas kullanarak, rahim boynuzları çekin ve pelvik kavite dışında kesin. Disseke rahim boynuzları sinirsel tabanlı kültür amino asitler, vitaminler ve inorganik tuzları ( Tablo malzemeleri ticari ürün için görmek) ile takıma orta dolu steril 60 mm petri kabına yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kabine bir steril Biyogüvenlik içinde iyi cımbız (her biri elinde) iki çift embriyoların plasenta dışında incelemek ve başkanları tarafından işten çıkarma yalıtmak için kullanın.</li>
	<li>Eğik kesimli bir steril 3 mL plastik transfer pipet ucu Aspire edin kafaları ve onları yeni steril 60 mm petri kabına katılaşmış siyah balmumu ile katmanlı ve sinirsel tabanlı aynı ile dolu transfer kültür ortamı olarak yukarıdaki desteklenmiştir. Not: Bu adımı kirleticileri (fare saç, kan) transferi en aza indirir. Siyah mum baş diseksiyon sırasında stabilize etmek için kullanılır. Kültür medya bu işlemler sırasında oksijenli gerek yok.</li>
</ol>4. İntraventriküler plazmid enjeksiyonları ve Ex Vivo elektroporasyon MGE
Not: Aşağıdaki adımları önceden hazırlanan Biyogüvenlik kabini steril koşullarda gerçekleştirilmesi gerekir.
<ol><li>Yer 60 mm petri kabına siyah balmumu ile katmanlı ve kesik başları içeren sinirsel tabanlı kültür orta Biyogüvenlik kabini dürbün altında desteklenmiş.</li>
	<li>Baş, sağ, sol el ile sorun cımbız ile karşı karşıya rostral bölümü stabilize ve nano-enjektör sağ elinde 1-2 µL plazmid/boya çözüm sağ yanal ventrikül enjekte için kullanın. Not:-Ebilmek var olmak eş ifade deneyler her iki plazmid ekimolar konsantrasyonlarda karıştırılarak bir kurtarma Plazmid ve shRNA ifade plazmid co-electroporating tarafından yürütülen.</li>
	<li>Electroporate enjekte beyin.<ol>
<li>Başını elektrotlar ile negatif elektrot dorsally konumlandırılmış ve kafasına paralel ve ventral MGE hedeflemek için baş tarafına doğru pozitif elektrot arasına yerleştirin.</li>
		<li>Sonra elektrotlar iyi yerleştirilmiş, 4 kare bakliyat 40 V 500 ms 50 ms için arası darbe aralıkları teslim.</li>
		<li>Zaten içinde Biyogüvenlik kabini yerleştirilir cımbız kullanarak elektrotlar herhangi bir kalıntı dokuyu. Not: Bu parametreler özellikle bizim deneylerde kullanılan electroporator için optimize edilmiştir. Biz kullanıcıların en iyi duruma getirme testleri önceden electroporator farklı bir türünü kullanıyorsanız gerçekleştirmenizi öneririz.</li>
		<li>4.1-4.3 tüm kalan beyin için yineleyin. Not: her ne kadar bu iletişim kuralı bir beyin için gerekli işlemler açıklanır, bu sırayla electroporating önce 4 beyin böylece verim artan her beyin enjekte etmek mümkündür. 2 veya daha fazla farklı plazmid sırayla (Denetim veya deneysel plazmid) (littermates arasında karşılaştırma için izin verir) aynı deneyi sırasında enjekte edilir bu strateji özellikle avantajlıdır. Buna ek olarak, bu enjekte etmek mümkün ve electroporate aynı anda 's elektrotlar tamamen beyin yüzeyine paralel getirerek verimi artırmak için beynin her iki taraf.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. beyin diseksiyon ve Organotypic dilim kültürleri
<ol><li>Hala Biyogüvenlik kabini steril ortamda manipüle ederken, kafatası dışında beynini incelememize.<ol>
<li>Siyah mum tabakası kafasına dikkatle beyin kaçınırken her gözün içine bir iğne ekleme tarafından stabilize.</li>
		<li>Bir çift güzel cımbız boynun sol tarafında ve kafatasından arka ön için deriden gözyaşı iyi cımbız ikinci bir çifti için kullanın.</li>
		<li>Baş yanal cımbız bir elinde tutarken, diğer elinde cımbız başka bir çifti dikkatle kafatası beyin düzeyinde kesin ve kafatası yavaşça çekin için kullanın. Her cımbız ile kafatası önüne doğru sagittal düzlemde (ortada) kesme ve kafatası parçasını kurtarmak için yanal deşmek.</li>
		<li>Beyin kaldırın ve kranial sinirler ve meninkslerde beyin tamamen dışarı kafatası kadar dikkatle kesin. Not: 5. 1'açıklanan tüm adımları bir biyogüvenlik kabini sıkı steril koşullarda gerçekleştirilmesi gerekiyor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beyin düşük erime noktası özel kesit için % 4 katıştırın.<ol>
<li>35-mm petri kabına (42 ° C'de sıvı tutulması) yukarıda hazırlanan özel çözüm ile doldurun.</li>
		<li>Hızlı bir electroporated beyin daha önce kesilmiş transfer pipet kullanarak özel dolu çanak aktarın. Yemek oda sıcaklığında tutmak.</li>
		<li>Özel (batan önlemek için) iyi ortasında beyin tutmak için metal bir sopa ile karıştırın ve beyin rostro Kaudal bir düzlemde paralel olarak çanak yerleştirin. Özel başladığında kuvvetlendirmek için herhangi bir beyin hasarı önlemek için karıştırma durdurmak.</li>
		<li>Beyin çevresinde 1-2 milimetre bir marj bırakarak dikdörtgen bir blok oluşturmak üzere beyin çevreleyen özel kesmek için jilet kullanın. Beyin rostral parçası sonraki parça adımları için yönlendirme kolaylaştırmak için bloğunun ön sınırlamak için dik olduğundan emin olun.</li>
		<li>Her beyin için yineleyin. Not: Birden fazla beyin ayrı özel bloklar her beynin farklı heights adlı ayarlanırken şekillendirme tarafından bir anda (en fazla 3) kesmek mümkündür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vibratome koronal bölümleri ve dilim kültür.<ol>
<li>100 X N-2 tezcan bir aliquot (150 µL) buz üzerinde ek ve steril koşullarda 15 mL bölünmemeli kültür Orta'ya ekleyin.</li>
		<li>Kültür orta (1 X N2 eki ile) 750 µL 6-şey kültür plaka her şey için transfer.</li>
		<li>Eğri cımbız ile bir hücre kültür Ekle (30 mm çap, 0.4 µm gözenek boyutu, PTFE) her orta-iyi doldurdu koyun.</li>
		<li>Vibratome banyo ile sürekli oksijenli ACSF doldurun. 4 ° C-banyo çevreleyen buz ile serin ya da soğuk hava vibratome kullanın.</li>
		<li>0,150 mm/s ve 80 Hertz frekans vibratome hızını ayarlar.</li>
		<li>Vibratome platformu, aşağı bakacak şekilde rostral edge ve ventral özel blokta tutkal kenar kullanıcı karşı karşıya.</li>
		<li>250 µm kalınlığında kesitler (4 ° C'de) elde etmek için koronal bölümleri beyinde kesti.</li>
		<li>Steril spatula ile tüm beyin bölümleri tek 30 mm membran üzerinde bir hayvan eklediğiniz, dikkatli bir şekilde bölümler arasında örtüşme kaçınırken yeri ve MGE içeren 2-3 bölümler toplamak. INSERT bir kuyu (yukarıda açıklandığı gibi ilave kültür ortamının 750 µL içeren) bir 6-şey kültür tabak yerleştirin. Alternatif olarak, her bölümün ayrı 13 mm çap membran ile 500 µl takıma kültür orta dolu bir 12-şey kültür plaka yerleştirilebilir. Kültür her şey için önerilen orta miktarda medya tarafından batık olmadan beslenmesi için beyin bölümleri sağlar. Not: vibratome sterilize ve bir biyogüvenlik kabini kullanılan sürece 5.3.6 ve 5.3.7 açıklanan adımları tam steril koşullarda gerçekleştirilir değil. Bu nedenle, dikkatli bir şekilde herhangi bir kirlenmesini önlemek için aşağıdaki adımları yapmak çok önemlidir. Saç, yüz ve eller, hiç geçmek gibi kültür plaka (varken veya yokken kültür orta) üzerinde uygun koruma araçlar (temiz maske, cerrahi eldiven ve önlük) tüm kez ve vücut parçaları hatta kaplı, giyilmelidir. Ayrıca % 70 etanol eldiven ve beyin bölümleri toplamak için kullanılan spatula üzerinde sık sık sprey için önerilir.</li>
		<li>48 veya 72 s % 60 nem oranı ve % 5 CO2 37 ° C'de havalandırılmış bir steril kuluçka kültür tabak koyun. Not: Bu kuluçka kez MGE kaynaklı ins zaman hata görüntüleme ve sabit dilimleri, confocal görüntüleme için sırasıyla optimize. En uygun kuluçka kez önceden her deneysel tasarım için test edilmelidir. Buna ek olarak, seçilen kuluçka 72 h ve altında kültür ortamı değiştirmeye gerek yoktur. Uzun kuluçka süreleri için kültür orta 2-3 günde değiştirilmelidir.</li>
		<li>İstenen kuluçka süre sonra faiz bölümlerini bir 8 odalı coverslip transfer ve 3-5 µL kültür ortamının ekleyin. Coverslip (37 ° C, % 60 nem oranı, % 5 CO2) çevresel bir odasında bir ters bağlı yer disk confocal donatılmış bir edinme bilgisayar destekli yazılım kurulumu için hızlandırılmış görüntüleme oturum iplik. Not: Alternatif olarak, Bölüm %4 paraformaldehyde (gecede 4 ° C'de veya oda sıcaklığında 2 h) ve daha sonra immunostained electroporated INs altında bir confocal Morfolojik özellikleri görüntüleme için farklı antikorlar ile sabit olabilir mikroskop. Her ne kadar karşı boyama yordami olmadan confocal mikroskobu tarafından görüntülenmeyecektir eGFP ve mCherry, immünhistokimya GFP ve mCherry fiksasyon işlemi Floresan, azaltabilir beri sinyal artırmak için karşı yapmak tavsiye azaltılması öncü veya izleyen süreçlerde küçük dalları gibi embriyonik nöronların ince bileşenleri algılama.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok. Kez burada ifade Sağlık Bakanı veya Kanada hükümeti görüşlerini temsil etmemektedir.

Bu makalede, biz rahim elektroporasyon e13.5, fare MGE gerçekleştirmek için ve embriyonik beyin dilimleri kültürleri organotypic nesil için güvenilir bir yöntem sağlar. Boyden odası tahlil gibi vitro yöntemleri gerçekleştirmek nispeten kolay ve farklı genler ve proteinler diğer faktörlere müdahale olmadan belirli rolleri değerlendirmek için kullanılabilir olsa da, onlar inç soruşturma engel geçiş dinamiği açısından doğrultu ve geçiş yolu25. MGE explants sırasında göç, biz burada göstermek, ama onlar yoksun en endojen cues meydana gelen dinamik hücre iskeleti değişiklikleri çalışma ve genellikle (ancak bu nöronal göç teşvik etmek için rehberlik cues eklenmesi gerektirir için kullanışlı bir yol sağlar MGE explants kortikal besleyici katmanlarda kültürlü zaman belirgin bir biçimde iyileştirilmiş)25,54. Yine de, deneyleri MGE explants üzerinde dayalı moleküler yardımlar bu belirli doğrultu veya geçiş yolu INs29rehberlik gibi daha ince mekanizmaları dahil dolaylı algılamak başarısız olabilir. Bu sorunu sonunda belirli MGE kaynaklı INs etiketleme için kendi yerel ortamında13,29,41yılında geçiş sağlayan rahim içinde elektroporasyon25tarafından hile. Ancak, bu teknik beceri-dahil cerrahi işlemler nedeniyle, zordur ve onun verim düşük sağkalım oranı embriyo ve MGE kez birden çok çöp için kullanımı gerektiren rahim içindehedef zor olması ile sınırlıdır önemi55ulaşmak. Bu nedenle, farelerde beyin embriyo organotypic kültür tarafından takip MGE rahim elektroporasyon geçiş dinamikleri ve morfolojisi MGE kaynaklı ins doğal ortamlarında soruşturma için düşük maliyetli, zaman etkili ve güvenilir bir yöntem sağlar çevre, rahim içinde elektroporasyon ve rehberlik için ihtiyaç cerrahi işlemler engellemeyi MGE explants ipuçları. Buna ek olarak, bu teknik doğrudan altında boyun ve baş, bir yapılandırma içinde uterobenimsemeye daha zor üzerine olumsuz bir pozitif elektrot apposing tarafından hedeflenebilir MGE daha kolay bir erişim sağlar. Alternatif olarak, MGE focally enjekte edilebilir ve organotypic dilimleri13,25,29, ama bu tekniği üreten hemen sonra electroporated daha zor ve daha az bizim ellerde etkili kanıtlamıştır Burada açıklanan protokol. Bu makalede açıklanan adımları izleyerek, bir 50-100 electroporated MGE kaynaklı INs organotypic dilim, 5-20 olan 72 h. Transfected INs canlı ile hızlandırılmış görüntülemede görüntülenmeyecektir sonra yüzeysel MGE dışarı geçiş görülecektir başına elde edeceksiniz veya görüntülü ve sonra yeniden oluşturulan fiksasyonu ve immunohistokimyasal etiketleme.
Burada açıklanan Protokolü geçiş ex vivo içinde çalışmak için optimize edildi ve rahim içinde elektroporasyon MGE kaynaklı INs, ex vivo MGE enjeksiyon ve çoğalmasıyla, açıklayan çeşitli yayımlanmış iletişim kuralları tarafından esinlenilmiştir veya Kronik organotypic beyin dilim kültürler36,38,39,42,43,56,57,58nesil. Yaklaşımımız içi MGE enjeksiyonları yerine daha düşük darbe yoğunluk (40 V) ve İntraventriküler plazmid enjeksiyonları (100 V), yüksek gerilim darbeleri ile başka bir yerde39,56 açıklandığı gibi kullanarak MGE ataları için potansiyel zararı sınırlar ,57,58. Diğerleri bakteriyel kontaminasyon39,56,57,58önlemek için penisilin, streptomisin ve viomisin bir arada kullanırken, Ayrıca, biz antibiyotik önlemek için seçtiniz bizim kültür teorik olarak geçişinde etkileyebilir beri orta. Özellikle, penisilin GABAA reseptör59,60bir antagonist ve GABAA reseptörü harekete geçirmek etkinleştirir ve daha sonra hücre içi klorid gradyanlar ve KCC2 bağlı olarak geçiş durur çeşitli aşamalarında geçiş61ifade. Ancak, geçerli kuralında belirtilen çeşitli önlemler kullanarak, kirlenme etkili antibiyotik olmadığında da önlenebilir.
Bu yaklaşım bizim ellerde verimlilik rağmen rahim elektroporasyon onun dezavantajları da vardır. Geçirmek için doğal bir üç boyutlu ortamı sağlayarak hücreleri iken, organotypic dilimler halinde göç bağlamında farmakolojik deneyleri yapmak zor olabilir. Nitekim, INs MGE kaynaklı göç çoğunlukla hücre dışı ipuçları2,13,19 ve farmakolojik inhibitörleri uygulanmasına bağlıdır ya da harekete geçirmek organotypic dilimleri üzerinde kesin izin vermez ayrılma genel dilim sağlık veya faaliyet küresel etkilerden hücre özerk etkileri. Beri INs explant dışarı geçiş olabilir daha kolay izole ve seçime bağlı olarak belirli bileşikler62için maruz tür deneyler için karışık Disosiye kortikal hücreleri üzerinde yetiştirilen MGE explants organotypic dilim kültürler için tercih olabilir. Rahim elektroporasyon rahim içinde elektroporasyon gerçekleştirmek daha kolay olsa da, Ayrıca, o hala burada küçük boyutu ve kırılgan embriyonik beyin durumunu göz önüne alındığında resimli embriyonik Çağlar, teknik olarak zor olabilir E13.5. müfettişler verimli bir şekilde e13.5, electroporated beyin beyin yüzeyine zarar vermeden ayıklamak için bir kaç çalışma gerekir. Buna ek olarak, postnatal dilimler olarak karşı embriyonik organotypic dilimleri kültüründe uzun süreler muhafaza edemez. Embriyonik organotypic dilim kültürler-ebilmek saklanmak için en az 7 gün vitro63da, bu elektroporasyon ile Birleşik değil ve burada açıklanan deneyler var 3 gün vitro güvenilir sonuçlar ile kadar için test edilmiştir bizim ellerimizde. Bu nedenle, müfettişler optimizasyonu testleri önceden uzun kuluçka süreleri gerekirse gerçekleştirmelisiniz. Ayrıca, geç embriyonik veya erken postnatal aşamaları at geliştirme incelenmesi bu tekniği ile e13.5 embriyo25, kullanırken tavsiye edilmez ama rahim içinde elektroporasyon ile nerede başarıyla elde edilebilir electroporated embriyo rahim boşluğuna geri koymak ve tarihi ve daha sonraki aşamaları21,64analiz için yaptı. Son olarak, organotypic dilim kültürler tarafından takip rahim çoğalmasıyla hem Morfoloji analizi ve gelişmekte olan INs geçiş dinamikleri sağlar. Ancak, bu daha önce için rahim içinde elektroporasyon tekniği36işaret edilmiştir gibi rahim electroporations beyin dilim başına 50-100 electoporated hücre verim ve böylece nüfus analizi için uygun değildir. Bu tür araştırmalar daha iyi bir tam veya koşullu silme (veya çakma) faiz gen taşıyan hayvan modellerinde yapılmaktadır. Ne zaman elde edilebilir, modelleri gibi daha sonra verimli bir şekilde organotypic dilim kültürler üretmek için kullanılabilir veya MGE explants geçiş içinde gerçek dinamikleri görselleştirmek için aşağıda gösterildiği gibi (bkz şekil 5 ve şekil 6).
Bu iletişim kuralı adım en iyi sonuçları elde etmek için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Örneğin, kirlenme rahatlıkla oluşabilir gibi tüm adımları sıkı steril koşullarda gerçekleştirilir ilkel olduğunu. Eldiven ve Biyogüvenlik kabini dışında kullanılan aletler sık sık tüm işlem sırasında % 70 etanol ile püskürtülür. Ayrıca, kültür medya ve yapay serebrospinal sıvı gibi çözümleri steril tutulmalıdır ve soğuk (4 ° C) ve yapılmış taze her 2-3 hafta. MGE kaynaklı bileşenleri daha ayrıntılı olarak etiketlemek için bir inç özel organizatörü kontrolü altında böyle deneylerde kullanılacak plazmid klonlanmış (ex: Dlx5/649, Lhx665), sade bir şekilde anatomik güvenmek yerine MGE hedefleme. Organotypic dilimleri nesil hayatta kalmak için beyin gerektirir. Böylece, hücre sağlık ve hayatta kalma korumak için bu deney andan itibaren 3 saat içinde organotypic dilimleri kültüründe koyana kadar Embriyolardan alınan yapılmalıdır. Zaman-verimlilik için kültür plakaları ile ev yapımı kültür orta sadece deneme başlamadan önce önceden doldurulmuş ve kadar kullanmak 37 ° C hücre kültür kuluçka makinesine koy. Ayrıca, beyin dikkatle kafatası kortikal yüzeye zarar vermeden dışarı uygun özel çözüm ve sonraki vibratome kesit katılmasını sağlamak için disseke. Örneğin, kortikal yüzeye bile en az 250 çevreleyen özel jel µm kalınlığında bölümlerden dekolmanı veya bölümleri bozulma vibratome kesit sırasında zarar verebilir. Olarak düşük sıcaklıklar uygun beyin katıştırma engel, ancak daha yüksek sıcaklıklarda doku hasarı ve hücre ölümüne yol nöronal hayatta kalmak için bu da özel çözüm sıcaklığı 42 ° C yakın kalır önemlidir (veya sırasında zarar «««Katıştırma) işlemi. Görüntüleme için mikroskop için transfer edilene kadar bir kez kültür, diğer kirlenme kaynakları önlemek için dilimleri manipüle edilebilir değil. Aşağıdaki adımları steril bir ortamda gerçekleştirilmesi gerektiğini ve özellikle geri sonraki yeniden görüntüleme için kültür koymak ihtiyacınız varsa dikkat bu manipülasyonlar sonra plakaları kirletmek değil ödenmelidir. Son olarak, bir DNA aliquot recuperating verimi önemli bir azalma electroporated nöronların tür malzeme ile gözlemlediği gibi boya ileride kullanmak üzere önceki deneyler üzerinden yükleme ile karışık önermiyoruz.
Sonuç olarak, yukarıda açıklanan rahim elektroporasyon ve organotypic dilim kültür Protokolü MGE kaynaklı ins tek hücre düzeyinde özel etiketleme için izin verir ve genetik olarak belirli moleküler yolları işlemek için kullanılan morfolojik değişiklikler ve geçiş dinamikleri düzenleyen rollerini çalışma yüzeysel geçirme INs. Bu yöntem hızlı ve düşük maliyetli erken fonksiyonel soruşturma roman aday gen sonraki nesil sıralama hastalarda veya tek hücre RNA sıralama göçmen INs66,67 aracılığıyla tespit sağlar 68,69,70nörogelişimsel bozuklukları. Bu teknik yaygın olarak korteks ve Hipokampus70,71,72,73piramit hücreleri de dahil olmak üzere diğer hücre popülasyonlarının geçişinde eğitim için kullanılmıştır. Hakim sonra potansiyel olarak görüntü geri dönüşüm ve membran proteinleri reseptörleri ve proteinler GFP öğesini kullanarak kanalları gibi ticareti için kullanılabilir; belirli hücresel sinyal cascades biyosensörler74kullanarak etkinleştirme; Hatta izleme ve düzenleme hücresel aktivite optogenetics kortikal INs aynı zamanda hipokampüs, amigdala veya bile striatum gibi diğer beyin bölgeleri için birleştiğinde kalsiyum Imaging'i kullanma.

Kortikal GABAergic interneurons (Ins) biyokimyasal özellikleri açısından, fizyolojik özellikleri ve bağlantı, çeşitli ve farklı işlevler olgun ağlar1,2,3 aracılık ,4,5. Kortikal ins farklı alt türlerinden tayini sıkıca kapsamlı eğitimi1,2olmuştur genetik cascades ile düzenlenir. Kortikal GABAergic INs çoğunluğu (% 70) ataları medial ganglionic hazretleri (MGE), ventrally bulunduğu bir embriyonik yapısı içinde kaynaklanan ve kortikal plaka1, ulaşmak için oldukça uzun mesafeler arasında geçirmeniz gerekir 2 , 6. kortikal piramit hücreleri Radyal Radyal glia iskele boyunca kortikal plaka (VZ) ventrikül bölgesinden göç ederken, böyle bir iskele bağlı değil, ins, teğet geçiş içsel çeşitli gerektirir ve uzak olmayan-kortikal yapılar2,7,8rehberlik ederken geçirme nöronlar kortikal plaka doğru çekmek için dış yardımlar. Hücre döngüsü çıktıktan sonra INs püskürtüldü MGE kemoterapi itici cues kortikal plaka9,10doğru teğet geçiş tetikleyen MGE VZ içinde ifade tarafından. INs geçirme striatum farklı itici ipuçları11 yardımı ile önlemek ve, kortikal plaka ulaşan sonra onlar bir teğet bir Radyal geçiş moduna geçin ve onların son Laminer pozisyonda, kısmen yanıt ipuçlarını piramit ulaşmak hücreler12 ve diğer hücresel nüfus13. Bileşenler, geçiş diğer nöron popülasyonları gelince nöron fiili hareketi izin vermek için çeşitli dinamik morfolojik değişiklikleri içerir. Bu sözde nöronal hareket üç ardışık adımlar tekrarlayan döngüleri tarafından karakterize: uzama önde gelen bir süreç, bir etkin anterograd hareket çekirdeği (nucleokinesis) ve retraksiyon izleyen süreç14. Geçiş sırasında sürücü dallanma ve etkin INs Yönlendirme ve geçiş14,15 hızını belirleme uygun yönde rehberlik için önde gelen süreç remodeling çok sayıda iç ve dış yardımlar tarafından düzenlenmiştir ,16.
Geçişinde kortikal düzenleyen belirleyici son yıllarda1,2,7,17,18,19,20içinde kapsamlı bir şekilde inceledik, ve bazı bu moleküler aktörler bozulma Pediatrik dirençli epilepsi veya otizm spektrum bozuklukları1,2,21, gibi nörogelişimsel bozukluklar için öne 22 , 23 , 24. bu nedenle, çeşitli vitro ve in vivo yaklaşımlar geliştirilmesi önemli ölçüde bu dinamik bir süreç, daha önce geçirilmiş25olarak çalışmaya yeteneğimizi ilerlemek için takip. Vitro yöntemleri Boyden odası tahlil ve şerit seçim tahlil de dahil olmak üzere, gereksinim ve belirli genler veya proteinler hücre özerk etkisini nöronal geçiş sırasında değerlendirilmesi en hızlı ve en tekrarlanabilir anlamına gelir sağlamak, diğer faktörler25etkisi. Canlı görüntüleme8,26,27ile birleştirildiğinde bu deneyleri özellikle yararlıdır. Bu teknikleri ile bileşenler kolayca e13.5 MGE alındı ve sonra farklı sinyal yolları ve rehberlik cues soruşturma olması, enzimatik ve mekanik ayrışma tarafından daha önce8,28 gösterildiği gibi izole . Ancak, bu deneyleri yokluğunda potansiyel olarak etkileyen hücre göç ve/veya hayatta kalma25nöronal davranış ve hücre özelliklerini değiştirebilir üç boyutlu doku mimarisi, yapay bir hücre dışı matriks yer almaktadır. Bu sınırlamaları aşmak için ex vivo MGE explants hızı ve yönü14gibi parametreleri ile birlikte taşıma sırasında meydana gelen dinamik morfolojik değişiklikleri ölçmek için alternatif bir araç olarak geliştirilmiştir, 29. MGE explants üreten nispeten basit ve kapsamlı olmuştur başka bir bölümünde30. İkinci isteğe bağlı31olmasına rağmen MGE monolayer karışık kortikal hücrelerinin veya matrigel ve kollajen çekici veya itici cues25, huzurunda karışımı üzerinde küçük bir özü kaplama üzerine kuruludur. MGE explants seyrek etiketli hücreleri görüntüleme, çalışma hücre iskeleti dallanma, önde gelen işlemi sırasında yeniden daha önce32,33 gösterildiği gibi hücre içi süreçlerin basitleştirilmesi yüksek çözünürlük için izin ver ,34 ve çalışmanın içinde. MGE explants başarıyla dinamik hücre iskeleti değişimler sırasında geçiş 2D bir ortamda, örneğin belirli farmakolojik veya kemotaktik manipülasyonlar sonra (bkz, örneğin, Tielens vd. 201633) değerlendirmek için kullanılan . Ancak, bu yaklaşım ile INs göç içinde yapay bir matris ve bu davranış ve tekrarlanabilirlik ve deneysel sonuçlar önemini değiştirebilir.
Buna karşılık, rahim içinde elektroporasyon INs genetik manipülasyon kendi doğal ortamlarında sağlar ve hızla ve verimli bir şekilde değerlendirmek kazanç etkisini ve gen fonksiyon kaybı sınırlamaları engellemeyi süre için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir pahalı ve zaman alıcı nakavt ve çakma stratejileri25,35. Rahim içinde elektroporasyon doğru ataları içinde hücre türü belirli Organizatör kullanarak ve elektrotlar MGE36dahil olmak üzere ventromedial yapılar doğru konumlandırma önyargılı. Ayrıca, rahim içinde adım 1-2 gün içinde deneysel yapıları, zamanında ifade sağlar yapı ifade viral kullanmak için gereken 7-10 gün ile karşılaştırıldığında25Vektörler. Ancak, rahim içinde çoğalmasıyla, ataları olarak düşük verimli olma eğilimindedir. Piramit hücre ataları dorsal ventrikül bölgede bulunan verimli bir şekilde transfected rağmen Nitekim, rahim içinde kullanarak elektroporasyon MGE gibi daha ventrally bulunduğu yapıların hedefleme, daha teknik meydan okuyor, özellikle küçük e13.5 embriyo ve embriyonik ölümcül daha da yüksek oranda deneysel verim25azaltır.
Bazı vitro ile ilişkili teknik sınırlamaları aşmak için MGE explant deneyleri ve vivo rahimde çoğalmasıyla, ex vivo organotypic dilim kültürler gelişmiş8,37edilmiştir, 38,39. Beyin organotypic dilim kültürler teklif vivo içinde taklit avantajı koşulları, daha az pahalı ve zaman alıcı üreten hayvan25modelleri daha olurken. Gerçekten de, bu ürünleri ile birlikte ins, belirli görselleştirme MGE kolay bir erişime ve bileşenler altında bir daha fizyolojik çevre8 ' geçiş belirli moleküler yolları araştırmak için odak elektroporasyon ile birlikte , 39 , 40 , 41. biz bu nedenle bir yaklaşım eski utero elektroporasyon ve hızlandırılmış confocal görüntüleme ile kombine organotypic kültürler için38, optimize, morfolojik ve dinamik bir süreç meydana gelen değerlendirmek için daha fazla MGE-ins teğet geçiş sırasında. Mevcut Protokolü uyarlanmış ve piramidal hücreleri42,43 geçiş çalışmaya eski rahim veya rahim içinde beyin elektroporasyon ve organotypic dilim kültürler kullanan diğerlerinden en iyi duruma getirilmiş ve kortikal INs36,39,44. Özellikle, fare embriyo kesti ve MGE electroporated ex vivo deneysel plazmid, İntraventriküler enjeksiyon sonra ne ile elde edilebilir daha MGE ataları daha verimli ve hassas hedefleme izin vermek olur rahim içinde adım. Beyin sonra ayıklanır ve bir kaç günlüğüne kültürlü bütün beyin koronal dilimler halinde kesitli, böylece sürekli izleme ve sağlar transfected INs görüntüleme. Bu yaklaşım, genellikle 5-20 yüzeysel geçirme INs kolay ayrılması emin olmak için yeterince seyrek nöronal Vaha'da etiketleme istatistiksel anlamlılık, ulaşmak için gerekli deneysel yineleme sayısını en aza indirme başına beyin dilim, etiketleri bireysel nöronlar imar ve iyi morfolojik değerlendirme. Ayrıca, organotypic kültürlerin bu geçirme sağlamak MGE explants için karşılaştırıldığında INs maruz kalmış yerel olarak salgılanan kemokinler ve talamik afferents girdileri de dahil olmak üzere daha doğal bir ortam. Bu yaklaşım böylece yön ve göç yolu önde gelen işlem dallanma gibi daha hassas dinamik süreçler karakterizasyonu izin vermek için yeterli anatomik bilgi sunarken transfected bileşenleri tarafından kabul ölçmek için de uygundur, nucleokinesis ve sondaki işlem geri çekilmesi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Commercially available neuron-specific culture medium. Complete formulation available on this website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 serum-free supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td>50X Serum-free neuron specific supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td>Commercially available neural-based culture medium supplemented with amino acids, vitamins and inorganic salts. Complete formulation available on the distributor&#39;s website&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum, heat inactivated</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>H1138-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurocell supplement N-2 100X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>305-016</td>
			<td>Botteinstein&#39;s N-2 Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Square PETG Media Bottles 125 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89132-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Type A Biosafety Cabinet</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SUC700.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D+ glucose</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>G7528-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SPM400.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>BiosShop</td>
			<td>MAG522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>AGA002.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-97 Flaming/Brown Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 mm I.D. x 75 mm Capillary Tube</td>
			<td>Drummond scientific</td>
			<td>1-000-800/12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Co</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil (heavy)</td>
			<td>Rougier Pharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WPI Swiss Tweezers #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504511</td>
			<td>11 cm, straight, 0.06x0.07mm tips, antimagnetic. You will need 2 of these.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WPI Swiss Tweezers #7</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504504</td>
			<td>11.5 cm, 0.18x0.2mm, curved tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTC Tweezers</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504617</td>
			<td>11 cm, Straight, flat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501225</td>
			<td>16 cm, Sharp/sharp, straight. You will need 3 of these.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501217</td>
			<td>12.5 cm, straight, serrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504478</td>
			<td>10.2 cm, full curve, serrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeBakey Tissue Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501996</td>
			<td>15 cm, 45&#176; angle, Delicate Jaw, 1.5mm wide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbran Microspatula with rounded ends</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>21-401-5</td>
			<td>You will need 2 of these.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond scientific</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 60, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3901</td>
			<td>60-mm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1800</td>
			<td>35-mm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Wax</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>S17432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes&#160;</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>170-CTB700-212</td>
			<td>3 mL, small bulb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica M80</td>
			<td>In replacement to our stereomicroscope which has been discontinued by the manufacturer (StereoMaster from FisherScientific)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro Square Porator</td>
			<td>BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>ECM 830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mm</td>
			<td>BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 1 1/2</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Co</td>
			<td>305127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica VT1000S Vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEM, Single edge razor blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71952-10</td>
			<td>Remove the blunt end before inserting in the blade designated space of the vibratome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 well</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td>Pack of 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell cell culture insert</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td>30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 &#181;m pore, pack of 50.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi6000 microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk confocal head Ultraview Vox</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.0 acquisition software</td>
			<td>Improvision/Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiveCell Stage top incubation system</td>
			<td>Pathology devices</td>
			<td>LC30030</td>
			<td>Provides Temperature, CO2 and humidity control.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry-Lifeact-7</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>54491</td>
			<td>Gift from Michael Davidson</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>25G bottle, certified by the Biological Stain Commission</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and organotypic slice cultures of embryonic mouse brains for live-imaging of migrating gabaergic interneurons

GABAergic interneurons (Ins) sürücü biliş ve davranış nöronal ağların önemli bileşenleridir. Korteks doldurmak için mukadder INs yüzeysel (medial ve Kaudal ganglionic efendiler (MGE, CGE) dorsal kortikal plaka yanıt olarak bir değişiklik de dahil olmak üzere) ventral telencephalon içsel ve dışsal kökenli yerden göç İpuçları. Genetik olarak belirli yolları değiştirmek ve nasıl onlar için uygun gerekli dinamik hücre iskeleti değişiklikleri düzenleyen araştırmak için yıl içinde farklı yöntemleri geliştirilmiştir geçiş içinde. Rahim içinde elektroporasyon yoğun gen baskı etkisini incelemek için kullanılan veya overexpression belirli inç içinde morfoloji ve son konumu üzerinde etki değerlendirme sırasında alt türlerinden. Bu yaklaşım kolayca Radyal geçirme piramit hücreleri değiştirmek için kullanılırken, İzo rahim içinde elektroporasyon hedefleme bir düşük verim azalmıştır sağkalım oranları ve yavrularını verilen oluşturduğunda ancak, bu teknik açıdan daha zorlu bir zaman elektroporasyon MGE kaynaklı INs okurken geleneksel olarak e14.5 önce yapılır. Alternatif bir yaklaşım, MGE explants MGE için kolay erişim sağlar ve görüntüleme genetiği değiştirilmiş ins kolaylaştırmak. Ancak, bu explants içinde endojen rehberlik ipuçları ve talamik girişleri yoksun yapay bir matris içine INs geçirin. Bu bize bir yöntem teknik zorluklar içinde utero yaklaşımların engellemeyi INs daha doğal bir ortamda nerede geçirebilirsiniz optimize etmek için istenir. Bu yazıda, biz eski utero elektroporasyon kolayca izlemek, görüntü ve genetiği değiştirilmiş INs yanıt olarak kendi doğal yolları boyunca göç yeniden oluşturmak için organotypic dilim kültürler tarafından takip embriyonik fare beyin kombinasyonu tanımlamak endojen ipuçları. Her iki miktar geçiş hızlandırılmış confocal görüntüleme ile dinamik açıdan, yanı sıra çeşitli morfolojik parametreleri nöronal rekonstrüksiyonlar sabit immunolabeled doku üzerinde kullanma ayrıntılı bir analiz için bu yaklaşım sağlar.

Bu bölümde, biz temsilcisi sonuçları elde edilen denetim plazmid veya bir gen ilgi e13.5 fare embriyo organotypic dilim kültürler tarafından takip MGE hedefleme bir deneysel plazmid eski utero elektroporasyon takip sağlamak 37 ° C'de 48 h (için hızlandırılmış görüntüleme) veya (fiksasyon ve immunohistokimyasal etiketleme için) 72 saat inkübe (için şematik Protokolü Bkz: şekil 1B ). Temsilcisi bir MGE explant geçiş INs de resimli (bkz. şekil 1 c şematik Protokolü) bir karşılaştırma için burada açıklanan yöntemi örnekleridir. MGE ataları bir plazmid elektroporasyon INs çıkışından MGE gecikme gibi görünüyor ve kültür zaman buna göre ayarlanması gerekir.
Başarılı bir deneme organotypic dilim confocal mikroskop altında sağlıklı görünür, yani kortikal katmanları parlak alan modunu kullanarak kolayca ayırt ve (yoğun tarafından tanınabilir dilim yüzeyinde görünür hiçbir kirlenme autofluorescence ve floresan filamentler epifluorescence altında görünür varlığı). Sağlıklı kronik organotypic dilimler halinde hücre yaklaşık % 20'si kültür (Resim 2), kronik organotypic kültürler (örneğin doğum sonrası kültür)52daha önce açıklandığı gibi 72 h sonra apoptosis tabi. Yine de, brüt cytoarchitectural beyin yapısı iyi tanımlanmış, resimli olarak burada (şekil 2A) Boyama DAPI kullanarak kalır. Bizim protokol MGE ex vivo elektroporasyon için ortalama bir dilim(şekil 3AB), başına 50-100 transfected hücrelerin hangi 5-20 hücre kültüründe 72 h sonra dorsally geçiş görülecektir verir. Onlar bir uzamış/oval hücre gövdesi, ara sıra izleyen süreci ve önde gelen bir süreç takdim ederken fiksasyon ve immunohistokimyasal boyama sonra yüzeysel kortikal plaka doğru göç INs kolayca confocal mikroskobu ile tespit edilebilir Yüzeysel odaklı. Önde gelen işlem genellikle bir ya da iki dalları açmaktadır ve ara sıra bir şişlik (centrosome nucleokinesis önce Konut) çekirdeği ve büyüme koniler her dalın ucunda önünde varlığı ile tanınabilir. (Şekil 3 c-G).
Bu iletişim kuralı gözlem hızlandırılmış Imaging'i kullanma tek hücre düzeyinde geçirme MGE kaynaklı ins için tasarlanmıştır. Bu özel deneme için (şekil 4), Dlx5/6Crekoronal organotypic beyin dilimleri oluşturulan; RCEEGFP embriyo electroporated adlı deneysel bir shRNA (bir gen ilgi hedefleme) ve TdTomato kaset ifade bir plazmid ile e13.5. Dilimleri için 48 saat inkübe, bir 8-şey odacıklı coverslip yemek (odası desteklenmiştir kültür orta ince bir tabaka üzerinde yüzen başına 1 dilim) aktarılır ve 3 dakikada 6-8 h 20 x hava (0.70 NA) amaç donatılmış bir ters mikroskobunun kullanarak yansıma bir iplik disk confocal kafa, bir edinme bilgisayar destekli yazılım ve bir sahne-üst çevre odası. Görüntüleme sırasında dilimleri 37 ° C'de tutulan sürekli oksijenli ve çevre odasında (%5 CO2 ve % 60'ı H2O) nemlendirilmelidir. Electroporated MGE kaynaklı INs tespit edildi gibi eGFP, onların ifade tarafından GABAergic inç kimliklerini ve deneysel plazmid (şekil 4AB) hızlı teyit TdTomato, onların ifade teyit. Electroporated bileşenler kolayca tanımlanabilir ve iyi izole, hız ve mesafe seyahat gibi geçiş dinamik parametreleri, ince analiz için izin şekil 4' te görüldüğü gibi. Buna ek olarak, etiketli INs görülür yüzeysel kortikal plaka, doğal ortamda iken, doğru geçiş önde gelen süreci ve nucleokinesis (şekil 4 c dallanma gibi dinamik morfolojik değişiklikleri tanımlamak olanaklı kılar -F).
Ex vivo elektroporasyon MGE kaynaklı ins da MGE ile kombine edilebilir yüksek kararlılık düşsel dinamik hücre iskeleti süreçlerin, yön ve göçmen dynamics tamamlayacak bir olduğu gibi taşıma sırasında meydana gelen etkinleştirmek için explants organotypic kültürlerde. Örnek olarak, nöronal gezisidir anımsatan Bu organotypic dilim kültürlerde ins teğet taşıma sırasında meydana gelen, farklı aşamalarını gözlenen electroporated içinde bir MGE geçiş INs çoğalmasıyla, lider gibi sonra 48 s explant neurite uzantısı ve nucleokinesis (şekil 5B-E). Çeşitli hücre iskeleti süreçleri daha sonra bir MGE explant örneğin F-aktin yapıları ile en iyi şekilde organotypic dilimler halinde elde edilemez phalloidin (şekil 6A), boyama tarafından geçiş izole hücrelerdeki yüksek çözünürlükte çalıştı yüksek hücresel yoğunluğu göz önüne alındığında (ve böylece hücre iskeleti elemanları) yerel ortamında. Bu hücre iskeleti süreçler ve özellikle F-aktin remodeling, daha da çalışılabilir dinamik olarak Lifeact ifade hızlandırılmış görüntüleme ile birleştirerek. Örneğin, bir inç yüksek çözünürlüklü hızlandırılmış görüntüleme bir örnek göstermek bir MGE explant bir Nkx2.1Cre; elde elde RCEEGFP bir gen INs ilgi hedeflenen silinmesiyle taşıyan fare beyin. Bu inç CMV organizatörü (Michael Davidson hediyesi), kontrol altında mCherry-Lifeact-7 plazmid ile transfected şekil 1 cF-aktin gerçek zamanlı (içinde şekil meydana gelen remodeling izlenmesine izin verme içinde kapsamlıdır yöntemini kullanarak 6B). organotypic kültürler düzgün genetiği değiştirilmiş INs yön veya geçiş yolu değerlendirmek için gerekli olmakla birlikte, bu nedenle MGE explants böyle çalışmalar yüksek çözünürlükte görüntüleme için izole hücrelere daha iyi erişim sağlayarak tamamlayıcı olabilir dinamik hücre iskeleti süreçleri.
Teknik tuzaklar yukarıda açıklanan deney başarısızlıkla sonuçlanabilir. Örneğin, 42 ° C sıcak bir özel çözümde beyin katıştırma doku yıkım ve nöronal ölüm, beyin veya opak haline dilim kalınlığı bir kayıp tarafından ortaya neden olabilir. Tanrıları bir özel çözüm kırılgan embriyonik beyin gömme işlemi sırasında yok edebilir gibi Ancak, sıcaklığı çok düşük tutulmalıdır değil. İkinci olarak, kirlenme önemli ölçüde burada açıklanan deneysel yaklaşımlar verimini azaltabilir. Böylece, tüm adımları mümkün olduğunca sıkı steril koşullarda özenle yapılmalıdır. Tüm çözümler ve ekipman kullanmadan önce sterilize ve ekipman sık bakteri veya kalıp kirlenmesini önlemek için % 70 etanol ile püskürtülür. Kültür orta sarı veya opak olur gibi kirlenme kültür wells doğrudan görünür olabilir. Kültür orta açık ve sıvı kaldığında kirlenme edilmeyecek. Ancak, kalıp dilim yüzeyinde bir tabaka genellikle görülebilir veya dilimleri fiksasyon ve boyama adımları sırasında aşırı kırılgan hale gelir. Böyle dilimleri mikroskop altında görüntülenir, kirlenme autofluorescence bir tabaka olarak etiketli nöronlar üzerinde tezahür veya uzun floresan filamentler varlığı ile açıklanacak. Kirlenmiş wells tuttu Organotypic dilimleri atılmalı, ama aynı plaka diğer wells kültürlü dilimleri-ebilmek saklanmak için daha fazla adımlar. Bakteriyel kontaminasyon oldukça nadirdir ama cidden, tüm ekipman, paylaşılan İnkübatörler ve kültür oda dahil olmak üzere el ile temizlenmiş sterilize ve anlamına gelir alınmalıdır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57526/57526fig1.jpg"> Resim 1: Veya rahim elektroporasyon protokollerde şematik gösterimleri organotypic dilim kültür tarafından takip MGE explants. A. burada anlatılan protokolü için gerekli steril aletlerin hepsini bir biyogüvenlik kabine kurulum örneği. B. şematik gösterim eski utero elektroporasyon ve organotypic dilim kültürler için kullanılan iletişim kuralı. Kısaca, embriyo kestiğini, deneysel plazmid lateral ventrikül (1) ve (2) MGE electroporated enjekte edilir. Beyin microdissected dışarı kafatası (3) ve özel (4) gömülü. Organotypic bölümleri bir vibratome (5) oluşturulan ve kültür için hızlandırılmış mikroskobu (7.1) için 48 h 37 °C(6) veya 72 hücre rekonstrüksiyonu (7.2) s yerleştirilir. C. şematik gösterim Myers et al. 201353 uyarlanmış ve MGE oluşturulmasında kullanılan iletişim kuralı explants. Kısaca, dorsolateral cortices ilk dışarı e12.5 e14.5 vahşi tipi fare embriyolar için disseke (1) ve mekanik ayrışmış desteklenmiştir kültür orta (2). Kortikal hücreleri 105 kortikal hücreler/cm2 x 5,25 yoğunluğu, kaplama ve kültürlü bir kollajen/Poli-L-lizin-kaplı 8 odalı coverslip (3) 37 ° C'de 2 h için. Sonra e13.5 Dlx5/6Cre; RCEEGFP embriyo MGE (4, 5) rahim elektroporasyon için işlenir ve MGE el ile beyinden izole ve 100 µm2 parçaları (6) kesti. Bu explants sonra üzerinde önceden hazırlanmış kortikal besleyici katmanı yerleştirilen, kültür orta ile kaplı ve hızlandırılmış görüntüleme (7) önce 48 saat için ortak kültürlü. <a href="/files/ftp_upload/57526/57526fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57526/57526fig2.jpg"> Resim 2: cytoarchitecture sağlıklı organotypic dilimleri içinde korunmuş. Organotypic nesil kültürler Nkx2.1Cre ex vivo elektroporasyon sonra dilim; RCEEGFP fare embriyo(a)değil neden önemli doku hasarı olarak korunmuş cytoarchitecture (DAPI (mavi) ve Cre-muhabir (GFP)) saptandı, bir 18 µm kalınlığında cryosection bir Nkx2.1Cre; karşılaştırıldığında RCEEGFP ile % 4 periosteum embriyo transcardially e15.5, PFA. D ve M dorso-ventral ve latero-medial eksenleri, sırasıyla gösterir. (B). yüksek büyütme görüntüleri ters bir confocal mikroskopla çekilen 63 x ile donatılmış / 1.4 petrol objektif bir anti-i ciddi-Caspase 3 antikor (Cl-cas3) ile boyama sonra reveal kortikal plaka hücrelerde yaklaşık % 20'si geçmesi Apoptozis (beyaz ok uçları) 72 h sonra kültür, GFP pozitif INs kalmak sağlıklı iken (beyaz ok), photomicrographs örneği olarak C-C'' '. Buna karşılık, neredeyse tamamen hücresel apoptosis olduğunu yok perfused bir hayvandan ince cryosection üzerinden (D-D'' '). Ölçek çubukları: 250 µm (A-B) ve 15 µm (C-D'' '). <a href="/files/ftp_upload/57526/57526fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57526/57526fig3.jpg"> Şekil 3: Organotypic dilimleri farelerin beyin embriyo ve electroporated interneurons (Ins) yüksek büyütme photomicrographs. A. bir organotypic dilim kültüründen bir Dlx5/6Cre; RCEEGFP (tüm bileşenler olan yeşil) fare beyin electroporated ile bir Dlx5/6::shRNAşifreli-IRES-TdTomato plazmid. Dilimi %4 ile giderilmiştir PFA kültür ve immunostained GFP ve mCherry için 72 saat sonra. Electroporated INs görüntüsü 3D (50-60 µm kalınlığında her 0,5 µm alınan optik bölümleri ile z-yığınlar) 63 x ile donatılmış confocal mikroskop kullanarak / 1.3 NA petrol amaç. Yüzeysel dorsal pallium alt ventrikül bölgede geçiş kolayca tanımlanabilir (kırmızı, açık ok) bileşenleridir. D ve M dorso-ventral ve latero-medial eksenleri, sırasıyla gösterir. B. bir temsilcisi organotypic dilim kültüründen bir kumanda ile wildtype (WT) embriyo electoporated Dlx5/6::shRNAşifreli-IRES-TdTomato plazmid, 72 h ve immunostained için mCherry yalnızca sabit. Electroporated INs (kırmızı) dorsally kortikal plaka doğru göç görülmektedir. Electroporated INs onların ortak ifadede TdTomato ve EGFP Dlx5/6Cretarafından tanımlanır; RCEEGFP fareler (C-D), veya TdTomato onların ifade sadece farelerde WT (E-H) ve onların tipik Morfoloji, yani bir oval gövde, dallı önde gelen işlem (beyaz ok uçları, D-H), hücre bir ara sıra işlem (beyaz ok, C-D) izleyen ve nucleokinesis önce centrosome konut önde gelen işlem bir zaman zaman şişlik (beyaz yıldız C-C' ve G). Ölçek çubukları: 250 µm (A-B) ve 25 µm (C-H). <a href="/files/ftp_upload/57526/57526fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57526/57526fig4.jpg"> Şekil 4: hızlandırılmış canlı görüntüleme electroporated INs organotypic dilimleri için 48 h. kültürlü, INs electroporated e13.5 TdTomato kaset ve bir shRNA bir gen ilgi hedefleme ifade bir deneysel plazmid ile bir Dlx5/6Creelde edilen bir organotypic beyin dilim teğet göç görülmektedir; RCEEGFP fare embriyo kültürü (A, beyaz kare) 48 saat sonra. B, (beyaz kare) aynı electroporated nucleokinesis sürecinde, korteks, yani pial yüzeyine paralel olarak yüzeysel geçirilirken görülür ve hızlandırılmış 3 dakikada 8 h 20 x / 0,85 kullanarak için Imaging'de gelir NA hava Amaç (büyütülmüş kutuları, C-F). Nöron başlangıçta sondaki işlemi (beyaz ok) ve dallı önde gelen işlemi (beyaz ok uçları) yanı sıra nucleokinesis (C) sürecinde uzun bir hücre vücut (açık ok) görüntüler. 3 h canlı görüntüleme sonra nucleokinesis tamamlandı, sondaki işlem çekildi ve önde gelen işlem iki uzun dallar (D, beyaz ok uçları) genişletiyor. 5 saat 30 dk sonra bir önde gelen işlem şubesi (beyaz ok uçları) çekildi ve nöron hücre gövdesi (açık ok) ileriye doğru yaklaşık 10 µm (E) taşındı. Son olarak, 8 h görüntüleme sonra geçiş duraklatıldı, nöron, önde gelen işlem tekrar genişletmiştir ve sondaki işlem (beyaz ok) ortaya çıkmıştır, ama çekirdek (açık ok) değil henüz taşındı ileri (F). Ölçek çubukları: 250 µm (A), 70 µm (B) ve 30 µm (C-F). <a href="/files/ftp_upload/57526/57526fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57526/57526fig5.jpg"> Şekil 5: ins zaman hata görüntüleme için 48 h. kültürlü bir MGE explant türetilen INs bir MGE explant dışına göç bir elde Nkx2.1Cregörülür; RCEEGFP (hangi bileşenler tüm MGE elde edilen hızlı eGFP) electroporated e13.5, istimal belgili tanımlık yöntem, CMV::mCherry-LifeAct-7 plazmid ile Myers et al. 201353 uyarlanmıştır ve şekil 1 ciçinde kapsamlıdır fare ve kültürlü 48 h(a)için. INs görselleştirildiği hızlandırılmış canlı görüntüleme 5 h (B-E) kullanarak. Bu örnekte, eGFP ve LifeAct ortak ifade birinde başlangıçta nucleokinesis (açık ok) sürecinde görülür ve iki önde gelen işlem şubesi (beyaz ok uçları; uzanır B). bu inç tamamlar nucleokinesis sonra 1 h (açık ok bakın), hücre vücut ileriye taşındı ve sondaki işlem hücre vücut (beyaz ok) arkatarafında ortaya çıkmıştır ve hala bir önde gelen süreci ile iki dalı (beyaz ok uçları; görüntüler C). ikinci nucleokinesis 2 saat 30 dk sonra (açık oklar) ise şu an yapım ve inç şimdi iki önde gelen işlem hücre vücut ve artık sondaki işlem (beyaz ok;'ile donatılmış D). son olarak, 5 h sonra inç bir neurite içinde kalan önde gelen işlem dal (beyaz ok ucu) centrosome translocating süre sonunda süreci (beyaz ok) arkatarafında hala mevcut ile üçüncü bir nucleokinesis için hazırlık geri çeker hücre vücut (E). Ölçek çubukları: 70 µm(a)ve 20 µm (B-E). <a href="/files/ftp_upload/57526/57526fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57526/57526fig6.jpg"> Şekil 6: 48 h. A. yüksek çözünürlüklü hızlandırılmış aktin bileşenlerinde bir MGE explant remodeling Imaging kültürlü Bir Nkx2.1Crebir organotypic dilimden; RCEEGFP fare beyin sabit e15.5, Alexa-594 Phalloidin ile lekeli, ipliksi aktin görselleştirme için izin. INs görüntüsü 63 x kullanarak / 1.3 NA petrol amaçta confocal mikroskop. Sağlıklı bileşenler altında arka sondaki işlem geri çekilmesi nucleokinesis tamamlanmasından sonra aşağıdaki hücre vücudun çukurluğu ipliksi aktin görülür (beyaz ok, A'-A'' '). B. bir MGE explant yukarıdaki gibi bir Nkx2.1Creelde edilir; RCEEGFP mCherry-Lifeact-7 CMV düzenleyicinin kontrolü altında ifade bir plazmid ile faiz ve electroporated bir gen hedeflenen silinmesiyle taşıyan fare beyin. Hızlandırılmış canlı görüntüleme kültür 48 saat sonra yapılır ve electroporated INs 3 dakikada 3 h bir 40 x / 0,85 kullanarak için takip edilmektedir hava amaç. Etkin aktin sitoiskeleti remodeling oluşur olarak flüoresan noktalar önde gelen süreci ve büyüme koniler (beyaz ok uçları) içinde ve arka kırmızı (beyaz siyah beyaz görüntülerde) hareketi ile LifeAct, transfected inç içinde hücre vücut nucleokinesis sırasında (B-B'' ', beyaz ok). Ölçek çubukları: 7 µm (bir ''') ve 10 µm (B-B'' '). <a href="/files/ftp_upload/57526/57526fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons at JoVE.com

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Eski Utero Elektroporasyon ve embriyonik fare beyni canlı görüntüleme, GABAergic Interneurons geçiş için Organotypic dilim kültürleri

Burada, electroporated beyin organotypic dilim kültürler fare embriyo confocal mikroskobu ve canlı görüntüleme teknikleri için uygun oluşturmak için düşük maliyetli ve güvenilir bir yöntem sağlamak.

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

ex-utero-electroporation-organotypic-slice-cultures-embryonic-mouse

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

9.9K Görüntüleme.  Centre de recherche du CHU Sainte-Justine. Burada, electroporated beyin organotypic dilim kültürler fare embriyo confocal mikroskobu ve canlı görüntüleme teknikleri için uygun oluşturmak için düşük maliyetli ve güvenilir bir yöntem sağlamak.

Video: Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotipik Hipokampal Dilim Kültürler

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Nörobilim

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

Embriyonik ventral orta beyin Organotipik Dilim Kültürler: dopaminerjik Nöronal Gelişim Eğitim Bir Sistem In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

Organotipik Dilim Kültürleri Purkinje Hücre Dendritik Morfoloji Analizi

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

Tarafından Embriyonik ve Erişkin Nöral Kök Hücre Genişletme<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporasyon veya Viral Stereotaksik Enjeksiyon

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression of genes of interest to specific neuronal subtypes has proven remarkably challenging due to the relative scarcity of specific promoter elements. GABAergic interneurons constitute a neuronal population with extensive genetic and morphological diversity. Indeed, more than 11 different subtypes of GABAergic interneurons have been characterized in the mouse cortex1. Here we present an adapted protocol for selective targeting of GABAergic populations. We achieved subtype selective targeting of GABAergic interneurons by using the enhancer element of the homeobox transcription factors Dlx5 and Dlx6, homologues of the Drosophila distal-less (Dll) gene2,3, to drive the expression of specific genes through in utero electroporation.

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

Kortikal internöronlar alt tip-selektif Elektroporasyon

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Organotipik Dilim Kültürler Oligodendrosit Dinamikler ve miyelinasyonun incelemek için

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

Içinde Neurovascular Yaptırma Analizi Entorhino-hipokampal Organotipik Dilim Kültürler

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

Embriyonik Fare Beyni Organotipik Dilim Kültüründe Nöronların Geçiş Sürekli Konfokal Görüntüleme Kullanımı<em&gt; Utero&#39;da</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...