Wir schlagen eine Methode zur Regulierung der Polymeraseaktivität unter Verwendung künstlicher Nukleinsäure-Transkriptionsfaktoren vor. Diese genregulatorische Architektur kann als Baustein für zukünftige in vitro genetische Geräte dienen. Durch die Bindung einer DNA-Bindungsdomäne an eine T7-RNA-Polymerase kombiniert diese Technik die Skalierbarkeit von DNA-basierten Schaltkreisen mit der Funktionalität transkriptioneller Schaltkreise.
Beginnen Sie mit der Herstellung von neun Verdünnungen von einzelsträngigem BG-Oligonukleotid auf ein Endvolumen von 50 Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser, von fünf zu eins zu eins zu fünf Verhältnissen, wie in der Tabelle angegeben. Bereiten Sie für jede Verdünnung eine Reaktionsmischung vor, indem Sie zwei Mikroliter SNAP-Puffer mit vier Mikrolitern BG-Oligonukleotid und vier Mikrolitern SNAP T7 RNAP mischen. Bereiten Sie die RNAP-Kontrolle vor, indem Sie das Oligonukleotid durch doppelt destilliertes Wasser ersetzen, und die DNA-Kontrolle, indem Sie das SNAP T7 RNAP durch doppelt destilliertes Wasser ersetzen.
Richten Sie 11 Reaktionen ein, indem Sie zwei Mikroliter jeder Probe zu vier Mikrolitern SNAP-Puffer und zwei Mikroliter Proteinbeladungsfarbstoff pro Probe hinzufügen. Erhitzen Sie die Reaktionen für 10 Minuten bei 70 Grad Celsius, bevor Sie zwei Mikroliter jeder Probe auf ein vier bis 12% glasiges Proteingel für 35 Minuten Gelelektrophorese auf Eis bei 200 Volt laden. Am Ende des Laufs waschen Sie das Gel mit drei Wasserwechseln auf einem Shaker für mindestens 10 Minuten pro Wäsche, gefolgt von einer Nukleinsäurefärbung mit Cyaninfarbstoff für 15 Minuten.
Stellen Sie sich das Gel auf einem geeigneten Gelbildgebungssystem vor und färben Sie das Gel erneut mit 20 Millilitern Coomassie-Blau ein. Nach einer Stunde mindestens eine Stunde lang mit doppelt destilliertem Wasser entfärben, bevor Sie das Gel erneut abbilden. Für die Oligonukleotid-gebundene SNAP T7-Reinigung bereiten Sie zunächst den Elutionspuffer vor, indem Sie 50 Mikroliter einer molaren Spur mit 100 Mikrolitern fünf molarem Natriumchlorid und 850 Mikroliter doppelt destilliertem Wasser mischen.
Als nächstes legen Sie eine Ionenaustauschkolonne pro Probe in einzelne Zwei-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und waschen Sie die Säulen mit Reinigungspuffer durch Zentrifugation, bis der gesamte Puffer aus jeder Säule eluiert wurde. Verdünnen Sie jede Probe mit Reinigungspuffer in einem Verhältnis von drei zu eins Reinigungspuffer zu Probe und laden Sie 400 Mikroliter Probe in jede Säule. Wenn der gesamte Puffer wie gezeigt eluiert wurde, sammeln und beschriften Sie den Durchfluss für jede Probe.
Waschen Sie die Säulen dreimal mit 400 Mikrolitern Reinigungspuffer pro Waschgang, bis der gesamte Puffer pro Waschgang eluiert ist, und sammeln und beschriften Sie die Durchflussmengen entsprechend. Sammeln Sie nach der letzten Wäsche das eluierte Protein, indem Sie 50 Mikroliter Elutionspuffer in die Mitte der Säule geben und die Säule dreimal zentrifugieren, bis alle 50 Mikroliter Puffer eluiert sind. Sammeln und beschriften Sie das Elu nach jeder Zentrifugation, bündeln Sie das Elu nach der letzten Zentrifugation in einem einzigen Röhrchen, während Sie ein kleines Volumen jedes Eluierten für die Gelanalyse belassen.
Messen Sie die Absorption der verbleibenden eluierten Aliquots bei 260 und 280 Nanometern und fügen Sie glycerin zu den Proben im Verhältnis eins zu eins für minus 20 Grad Lagerung bis zu ihrer Verwendung hinzu. Verwenden Sie eine 500 Mikroliter 30 Kilodalton Zentrifikanenfiltereinheit, um das gesamte elute Produkt durch 2x Speicherpuffer zu puffern. Und messen Sie die Absorption wie demonstriert.
Dann fügen Sie Glycerin zu dem Produkt in einem Verhältnis von eins zu eins für minus 20 Grad Celsius Lagerung. Um die Eluierungen mittels SDS-PAGE zu beurteilen, führen Sie die Proben in einer geeigneten Proteinleiter auf einem vier bis 12% glasigen Gel für 35 Minuten bei 200 Volt oder bis die Farbstofffront zum Ende des Gels wandert. Um die On-Demand-Kontrollaktivität des angebundenen RNAP zu demonstrieren, mischen Sie 2,4 Mikroliter jeder Vorlage mit fünf Mikrolitern 5x Glühpuffer und 14,2 Mikroliter doppelt destilliertem Wasser.
Inkubieren Sie den resultierenden ein mikromolaren doppelsträngigen DNA CAGE bei 75 Grad Celsius für zwei Minuten. Und glühen Sie die Sinn- und Anti-Sense-Stämme des Promotors und der malachitgrünen Aptamer-DNA-Schablone auf die gleiche Weise wie in der Tabelle angegeben. Am Ende der Inkubationen wird das angebundene SNAP T7 RNAP in einem molaren Verhältnis von ein bis fünf zu einer Endkonzentration von 500 nanomolaren RNAP in den doppelsträngigen DNA CAGE gegeben.
Nach 15 Minuten bei Raumtemperatur die Probe auf Eis legen und 2,5 Mikroliter 10x In-vitro-Transkriptionspuffer mit einem Mikroliter 25 Millimolaren Ribonukleosidtriphosphat, einem Mikroliter mit einem Millimollar malachitgrün, 2,5 Mikrolitern der RNAP CAGE-Mischung, je 2,5 Mikroliter mit einem mikromolaren Transkriptionsfaktor A- und B-Oligonukleotidstrang mischen. und drei Mikroliter einer Millimolar malachitgrünen Aptamerschablone in 10 Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser. In 15 Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser ist eine zweite Reaktion mit 2,5 Mikrolitern 10x In-vitro-Transkriptionspuffer, einem Mikroliter 25 Millimollar-Ribonukleosidtriphosphat-Mischung, einem Mikroliter mit einem Millimollar-Malachitgrün, 2,5 Mikrolitern der RNAP CAGE-Mischung und drei Mikrolitern einer millimolaren Malachit-grünen Aptamer-Schablone eingerichtet. Um eine Reaktion einzurichten, die nur Puffer enthält, mischen Sie 2,5 Mikroliter 10x In-vitro-Transkriptionspuffer, einen Mikroliter 25 Millimolar Ribonukleosidtriphosphatmischung, einen Mikroliter mit einem Millimollar malachitgrün und drei Mikroliter einer millimollaren Malachitgrün-Aptamer-Vorlage in 17,5 Mikrolitern doppelt destilliertem Wasser.
Wenn alle Reaktionen vorbereitet sind, übertragen Sie jede Reaktion auf eine 384-Well-Platte und überwachen Sie die Malachit-Green-Aptamer-Transkription auf einem Fluoreszenzplattenleser für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius bei einer 610-Nanometer-Anregung und einer 655-Nanometer-Emission. Legen Sie am Ende des Messwerts die Platte auf Eis und lassen Sie das RNA-Produkt aus jeder Vertiefung in einem denaturierenden 12% FSME-Harnstoff-Polyacrylgel in 70 Grad Celsius FSME-Puffer bei 280 Volt für 20 Minuten laufen, oder bis die Farbstofffront das Ende des Gels erreicht. Färben Sie dann das Gel mit Cyaninfarbstoff-Nukleinsäure-Färbung für 10 Minuten auf einem Orbital-Shaker, bevor Sie sich wie gezeigt abbilden.
Eine erfolgreiche Expression und Aufreinigung des rekombinanten SNAP T7 RNAP Proteins kann mit SDS-PAGE bestätigt werden. Nach SDS-PAGE kann die enzymatische Aktivität durch in vitro Transkriptionsreaktion validiert werden. Die erfolgreiche Kopplung von BG-funktionalisierten Oligonukleotiden kann durch 18%ige Denaturierung von FSME-Harnstoff PAGE nachgewiesen werden.
Im Vergleich zum unveränderten Oligonukleotid erhöht die Zugabe des BG-Anteils zum Oligonukleotid dessen Molekulargewicht. Wie in diesem repräsentativen Cyaninfarbstoff-Färbegel zur Bestätigung der DNA-gebundenen T7-RNAP-Reinigung von überschüssigen BG-Oligonukleotiden beobachtet, enthielt die anfängliche Flow-Through-Fraktion hauptsächlich überschüssiges BG-Oligonukleotid sowie einen kleinen Teil der DNA-gebundenen Polymerase, die nicht an das Kationenaustauscherharz bindet. Die Poolverdünnungsfraktionen enthielten nur die einzelne Bande von RNAP-Oligo, die durch die Bindung des Cyaninfarbstoffs an das Oligonukleotid-Tether verursacht wurde, wobei die hochkonzentrierte Produktspur die gleiche, aber dunklere Bande aufwies, was eine erfolgreiche Aufwärtskonzentration bedeutet.
Die gleichen Muster werden bei der Coomassie-Blaufärbung beobachtet, wobei eine kleine Verschiebung der Gelmobilität bei der nicht konjugierten RNAP-Kontrolle beobachtet wird. Hier wird das fluoreszierende Signal gezeigt, das am Ende der In-vitro-Transkription in Echtzeitkinetik erzeugt wird. In dieser Analyse wurde eine 336-fache Aktivierung des Fluoreszenzsignals beobachtet, was eine robuste Kontrolle der Polymeraseaktivität zeigt.
Denken Sie beim Versuch dieses Protokolls daran, SDS vor der Nukleinsäurefärbung gründlich vom Gel abzuwaschen. Dies liegt daran, dass STS den Farbstoff im Gel einfängt, was zu einem hohen Hintergrundsignal führt. Die Anwendung unserer Methode auf einen großen Genkreislauf mit mehreren Kaskaden zeigt die Skalierbarkeit und Zusammensetzbarkeit des gebundenen Transkriptionssystems.
Diese Technik wird derzeit verwendet, um Genschaltkreise zu entwickeln, die in der Lage sind, neuronale Netzwerkberechnungen durchzuführen.
