Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zur Proteinlokalisierung und der Dynamik in photosynthetischen Organismen zu beantworten. Durch die Kombination der Photobleichmethode mit dem hochauflösenden Mikroskop sind wir in der Lage, die Proteindynamik von photosynthetischen Organismen in einem bemerkenswerten Detail zu erkennen. Diese Methode gibt nicht nur Einblick in die Proteindynamik von Prochlorococcus.
Es kann auch auf viele andere Organismen angewendet werden, die Radio-Re-Dop-Sing und Bacteriochlorophyll enthalten. Demonstriert wird dieses Verfahren von Yanxin Liu, einem Doktoranden aus meinem Labor. Zunächst fügen Sie fünf Milliliter Pro99-Medium auf Seewasserbasis zu einem Kulturkolben hinzu und impfen Sie ihn mit einem Milliliter Prochlorococcus MED4.
Wachsen Sie die Prochlorococcus bei 23 Grad Celsius unter einem Licht mit einer Intensität von 35 Mikromol-Photonen pro Quadratmeter. Nach fünf Tagen einen Milliliter der Kultur in eine 1,5-Milliliter-Röhre sammeln. Fügen Sie 100 Mikroliter frisch zubereitetes Formaldehyd in die Röhre, um die Kultur zu fixieren.
Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Drehen Sie dann die Probe bei 13, 500 mal G für eine Minute. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 100 Mikroliter Pro99 Medium wieder aus.
Bewahren Sie die Probe bei vier Grad Celsius im Dunkeln auf, bis sie bereit ist, eine Immunfärbung durchzuführen. Zuerst wirbeln die Durchstechflasche mit Polystyrolperlen. Mit 50% Ethanol eine Ein-zu-20.000 Verdünnung als Arbeitsschlämme zubereiten.
Schalten Sie die Kochplatte ein und stellen Sie die Temperatur auf 120 Grad Celsius ein. Als nächstes legen Sie die Deckel auf die Kochplatte. 100 Mikroliter der Arbeitsschlämme auf jeden Deckelschlupf laden und 10 Minuten lang die Deckel auf die Kochplatte inkubieren.
Dann die Abdeckungen vorsichtig auf Petri-Schalen Perlenseite nach oben für die Lagerung bei Raumtemperatur übertragen. Wenn Sie bereit sind, die Abdeckungen zu beschichten, rufen Sie eine ab, um sicherzustellen, dass sie perlenseitig nach oben ist. Fügen Sie 100 Mikroliter einer Poly-L-Lysin-Lösung mit einem Milligramm pro Milliliter in die Mitte des Deckels und lassen Sie ihn 30 Minuten bei Raumtemperatur sitzen.
Danach verwenden Sie eine Pipette, um unbefestigtes Poly-L-Lysin sorgfältig zu saugen und in ein 1,5-Milliliter-Rohr zu übertragen. Bewahren Sie dieses Poly-L-Lysin bei vier Grad Celsius für die spätere Verwendung auf. Spülen Sie den Deckelrutsch mit 10 Milliliterultralitern ultragefiltertem Wasser in einer 60-Millimeter-Petrischale und trocknen Sie ihn dann kurz mit einem Papiertuch.
Übertragen Sie den beschichteten Deckel auf eine neue Petrischale mit Parafilm an der Unterseite, die als Färbeschale verwendet wird. 100 Mikroliter der festen Probe auf den Deckelschlupf laden und 30 Minuten sitzen lassen, um eine Zellbefestigung zu ermöglichen. Als nächstes verwenden Sie ein Papiertuch, um die restliche Lösung zu absorbieren und dann den Deckelinin in eine 12-Well-Platte zum Waschen auf einen Brunnen zu übertragen.
Fügen Sie einen Milliliter PBS-Puffer in den Brunnen, um den Deckelzuschlag zu waschen. Entfernen Sie dann die PBS und fügen Sie einen Milliliter frische PBS, um den Deckel ein zweites Mal zu waschen. Verwenden Sie eine Pipette, um die PBS zu entfernen und ersetzen Sie sie durch einen Milliliter frisch zubereiteten Permeabilisationspuffer.
Die Waschschale bei 37 Grad Celsius 20 Minuten bebrüten. Entfernen Sie dann den Permeabilisierungspuffer. Beginnen Sie den Waschvorgang, indem Sie einen Milliliter frischen PBS-Puffer hinzufügen.
Legen Sie die Waschschale auf einen Shaker, um die Schale für fünf Minuten sanft zu rühren. Entfernen Sie danach die PBS und wiederholen Sie den Waschvorgang dreimal. Den gewaschenen Deckelaufschub in die Färbeschale geben.
Fügen Sie 50 Mikroliter Sperrpuffer oben auf dem Coverslip hinzu. Legen Sie die gesamte Färbeschale auf Eis und bewegen Sie sie dann mindestens 60 Minuten unter die Xenon-Lichtquelle zum Photobleichen. Nach dem Photobleichen und Blockieren verwenden Sie den Rand eines Papiertuchs, um den Sperrpuffer zu entfernen.
Verdünnen Sie zunächst einen Mikroliter Anti-FtsZ-Antikörper in 99 Mikroliter Blockierpuffer. 50 Mikroliter des verdünnten Primärantikörpers auf den Deckelschlupf legen und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Übertragen Sie den Deckelaufschlag auf einen Brunnen der Waschschüssel.
Um mit dem Waschen zu beginnen, fügen Sie einen Milliliter PBS hinzu. Dann die Waschschale auf einen Shaker geben und fünf Minuten lang vorsichtig schütteln. Entfernen Sie die PBS und wiederholen Sie den gesamten Waschvorgang dreimal.
Als nächstes übertragen Sie den Deckelaufschub auf die Färbeschale. 50 Mikroliter des verdünnten Sekundärantikörpers auf den Deckelschlupf legen und 30 Minuten lang im Dunkeln und bei Raumtemperatur bebrüten. Den Deckelrutsch zurück auf die Waschschüssel geben.
Um mit dem Waschen zu beginnen, fügen Sie einen Milliliter PBS hinzu. Wickeln Sie die Waschschale in Aluminiumfolie, um sie vor Licht zu schützen. Übertragen Sie die Platte auf den Shaker und schütteln Sie sie vorsichtig für fünf Minuten.
Entfernen Sie die PBS und wiederholen Sie den gesamten Waschvorgang dreimal. Bereiten Sie unmittelbar vor der STORM-Bildgebung einen Milliliter Bildgebungspuffer vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Legen Sie den Deckelinlegin in die Ladekammer ein.
Fügen Sie den frisch vorbereiteten bildgebenden Puffer hinzu, der sanft ist, um das Abwaschen der cyanobakteriellen Zellen zu vermeiden. Legen Sie anschließend einen rechteckigen Deckelschlupf auf den Bildgebungspuffer, um zu verhindern, dass er mit dem Sauerstoff in der Luft reagiert. Schalten Sie die Kamera, das LED-Licht und den Laser ein, und öffnen Sie die STORM-Software.
Fügen Sie einen halben Tropfen Tauchöl auf die Linse. Laden Sie die Kammer, um sicherzustellen, dass die Objektivlinse mit dem Deckelinin in Kontakt kommt. Und untersuchen Sie das Signal mit einem 750-Nanometer-Laser.
Identifizieren Sie einen Stichprobenbereich, der sowohl Zellen als auch Treuhandmarker enthält. Starten Sie dann die Software für die Probendriftkorrektur. Erfassen Sie ein breit gelegtes Bild als Referenz, wobei die Kameraelektronenmultiplikation bei 300 und einer Belichtungszeit von 30 Millisekunden liegt.
Erhöhen Sie die Anregungslaserintensität von 750 Nanometern auf ca. 4,5 Kilowatt pro Quadratzentimeter. Sobald die Fluorophore in ein spärliches Blinkenmuster übergegangen sind, erhalten Sie ein Superauflösungsbild, indem Sie 10.000 Bilder bei 33 Hertz sammeln. Rekonstruieren Sie dann die Bilder mit Superauflösung aus den Rohdaten, wie im Textprotokoll beschrieben.
In dieser Studie wird STORM verwendet, um eine hochauflösende Bildgebung zu erreichen, indem einzelne fotoschaltbare Fluorophore stochastisch aktiviert werden. Die Position jedes Fluorophors wird aufgezeichnet, und auf der Grundlage dieser Standorte wird dann ein Bild mit super Auflösung erstellt. Während die Absorptionsspektren von Prochlorococcus bei 447 und 680 Nanometern liegen und eine minimale Absorption von mehr als 700 Nanometern aufweisen, emittieren Prochlorococcus MED4-Zellen immer noch eine hohe Autofluoreszenz, wenn sie einer extrem hohen Intensität des 750-Nanometer-Lasers ausgesetzt sind, die für die STORM-Bildgebung erforderlich ist.
Nach der Hier beschriebenen Photobleichmethode für 30 Minuten nimmt die Autofluoreszenz der Zellen ab, obwohl mehrere Zellen mit Autofluoreszenz noch nachgewiesen werden. Die Dehnung der Photobleiche auf 60 Minuten führt dazu, dass die Mehrheit der Zellen ihre Autofluoreszenz verliert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die entwickelte Photobleichmethode in der Lage ist, die Autofluoreszenz photosynthetischer Organismen stark zu reduzieren.
Nach dem Photobleichen wird STORM verwendet, um das Zellteilungsprotein FtsZ in den Zellen zu visualisieren. Mit STORM wird eine detaillierte Morphologie des FtsZ-Rings aufgedeckt. Durch Drehen der 3D STORM-Bilder wurden vier verschiedene Arten von Morphologien identifiziert, Cluster, ein unvollständiger Ring, ein kompletter Ring und Doppelringe.
Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Lichtintensität und Dauer der Photobleichmittel für verschiedene Organismen unterschiedlich sein kann. Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Methode den Weg für Forscher, die die Proteinorganisation und die potenzielle Funktion in photosynthetischen Zellen im Detail untersuchen wollen.
