Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, uns eine elektromikroskopische Auflösung der Wasserverteilung in verschiedenen Arten von Xylemzellen in situ zu liefern. Diese Methode wurde verwendet, um das Wasser in Xylem zu beobachten, um die Wasserverteilung und die sich ändernden Wasserregime, die saisonale Variation der Wasserverteilung, die Wirkung von Gefrier-/Tauzyklen, die Verteilung von Wasser in nassem Holz und Kavitation, die durch bestimmte biotische Spannungen induziert wird, zu klären. Die Frostfixierung eines lebenden Stammes unter hohen hydraulischen Spannungen verursacht manchmal künstliche Kavitationen, die von cryo-SEM als gebrochene Eiskristalle im Kanal der Leitung beobachtet werden.
Dieses aktualisierte Verfahren konzentriert sich auf die Beschaffung hochwertiger Aerotome-Mikrographien von Xylem ohne das Artefakt im Probenahmeverfahren. Die lebendige Demonstration ist von entscheidender Bedeutung, da es eine Reihe wichtiger Details gibt, die nicht einfach erklärt werden können. Gleichzeitig ist es nicht einfach, eine Ausbildung zu erhalten, da nur wenige Laboratorien auf der ganzen Welt diese Methode praktizieren.
Um dieses Verfahren zu beginnen, umschließen Sie einen Ast und Blätter für die Probenahme mit einem schwarzen Plastikbeutel, um das Wasserpotenzial zwischen Xylem und Blättern mehr als zwei Stunden vor der Probenahme zu gleichziehen. Mit Hilfe einer Druckkammer das Wasserpotenzial von mindestens zwei Blättern aus der Probe bestimmen. Wenn das Wasserpotenzial größer als etwa minus 0,5 Megapascal ist, kann eine Probe nach dem Einfrieren geerntet werden.
Wenn das Wasserpotenzial unter minus 0,5 Megapascal liegt, fahren Sie mit der Behandlung zur Entspannung fort. Befestigen Sie einen wasserdichten Kragen um den Stiel, der mit Wasser gefüllt wird. Schneiden Sie mit Schnittscheren oder einer Säge den Stiel unter die Wasseroberfläche und halten Sie das geschnittene Ende der Probe unter Wasser.
Übertragen Sie die Probe so schnell wie möglich in einen anderen Behälter mit Wasser, um die Auslage des Schnittendes der Luft zu minimieren. Stellen Sie bei langblättigen Arten sicher, dass die Länge von der Stelle, an der die Kryoprobe für SEM bis zur Schnittkante des geernteten Stammes erhalten wird, länger ist als die maximale Gefäßlänge der Probe, um spannungsinduzierte Artefakte innerhalb des Krysoample zu verhindern. Als nächstes bedecken Sie die Probe mit einer schwarzen Plastiktüte, um die Transpiration zu reduzieren.
Halten Sie das geschnittene Ende der Probe im Wasser und halten Sie diesen Zustand für ca. 30 Minuten, um die Xylemspannung zu entspannen. Danach messen Sie das Wasserpotential erneut, um die Entspannung der Xylemspannung zu bestätigen. Verwenden Sie zunächst eine Schere oder ein Gebrauchsmesser, um eine Seite eines wasserdichten Kragens zu schneiden und zu öffnen.
Befestigen Sie den Kragen fest um den Stiel mit Klebeband, während Sie die Blende horizontal halten. Setzen Sie Isolierhandschuhe an und halten Sie das Gefäß mit flüssigem Stickstoff sicher. Leiten Sie flüssigen Stickstoff in den Kragen, bis er voll ist, und halten Sie ihn durch stetiges Hinzufügen von zusätzlichem flüssigem Stickstoff gefüllt, um das Wasser im Xylem vollständig einzufrieren.
Nach ausreichender Gefrierzeit den Kragen vom gefrorenen Teil des Probenstiels lösen, um den flüssigen Stickstoff zu entfernen. Verwenden Sie sofort eine feine Handsäge, um die Probe zu ernten. Dann die gefrorene Probe mit einem Stück Aluminiumfolie bedecken oder wieder in ein Probenrohr geben.
Die geerntete Probe schnell in einen mit flüssigem Stickstoff gefüllten Behälter geben. Bewahren Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius auf, bis sie bereit sind, die Beobachtung durchzuführen. Um zu beginnen, stellen Sie die Temperatur der Probenkammer des Kryostats auf minus 30 Grad Celsius, die in der Regel kalt genug ist, um den Xylemsaft der meisten Pflanzen in einem gefrorenen Zustand zu halten.
Verwenden Sie ein scharfes Messer oder eine feinzahnige Säge, um die Probe in ein kleines Stück zu schneiden, das für den Probenhalter eines Kryo-SEM eingestellt werden kann. Montieren Sie das getrimmte Stück an einem Futter, einem Halter für einen Kryostat, mit Gewebe-Gefriermittel für Kryo-Sektion. Befestigen Sie das Futter an einem Probenhalter eines Mikrotom des Kryostats.
Trimmen Sie die Oberfläche, indem Sie wiederholt fünf bis sieben Mikrometer dicke Abschnitte abrasieren. Das Abschneiden von mehr als 1 000 bis 2 000 Mikrometern in der Gesamttiefe an die Ausgangsoberfläche ist nützlich, um den beschädigten Teil der Probe, der durch Vorschneiden verursacht wird, zu verkleinern. Nachdem Sie eine Oberfläche der Probe grob gestutzt haben, stellen Sie einen ungenutzten Teil der Mikrotomklinge über der Probenoberfläche ein.
Den Abstand zwischen der Oberfläche der Probe und der Klinge etwas vergrößern. Und schneiden Sie die Oberfläche nur ein- oder zweimal. Schieben Sie dann die Klinge erneut und positionieren Sie einen ungenutzten Teil der Klinge auf die Probenoberfläche.
Wiederholen Sie diese Schnittbearbeitung drei- bis viermal, um eine klare Oberfläche ohne Messerspuren zu erhalten. Stellen Sie nach dem letzten Schnitt die Position der Klinge weit von der Probe ab, um zu verhindern, dass Staub auf die Probe klebt. Und lösen Sie das Futter aus dem Mikrotom.
Als nächstes befestigen Sie die Probe an einem Kryo-SEM-Probenhalter mit Gewebe-Gefriermittel in der Kryostatkammer. Verwenden Sie zunächst flüssigen Stickstoff, um eine Temperatur unter minus 120 Grad Celsius in der Kryo-SEM-Probenkammer gemäß der Bedienungsanleitung des Geräts zu halten. Als nächstes legen Sie den Probenhalter mit der vorbereiteten Probe in einen mit flüssigem Stickstoff gefüllten Isolierbehälter in der Kryostatkammer.
Verwenden Sie einen Probenaustauschstab, um den Probenhalter unter dem flüssigen Stickstoff zu halten. Den Probenhalter schnell in die Vorevakuierungskammer der Kryo-SEM-Probenkammer überführen, sobald mit der Evakuierung der Vorevakuierungskammer begonnen wird. Um zu beginnen, schalten Sie die Beschleunigungsspannung der elektrischen Pistole ein.
Als nächstes erhöhen Sie die Temperatur der Probenstufe auf minus 100 Grad Celsius. Warten Sie einige Minuten, bis der Froststaub entfernt wird und der Oberflächenpegel des Eises in den Xylemzellen im Vergleich zu den Zellwänden leicht abnimmt. Dann senken Sie die Temperatur der Speiumen-Stufe auf minus 120 Grad Celsius.
In dieser Studie werden Kryo-SEM-Beobachtungsmethoden verwendet, um die Wasserverteilung auf zellulärer Skala klar zu visualisieren. Bei geringer Vergrößerung zeigt der schwarze Bereich in den Bildern die Hohlräume an, aus denen Wasser ganz oder teilweise verschwindet, während der graue Bereich Xylemzellenwände, Zytoplasma und Wasser anzeigt. Bei hoher Vergrößerung zeigt sich, dass das Wasser nicht vollständig von der Leuchtdichte von drei Tracheiden verloren geht, was auf das Auftreten von Makroblasen im Xylemsaft in situ hinweist.
In Bezug auf breitbeinige Arten, Kavitationsvorkommen ist leicht in Gefäßen zu erkennen, während Wasserexistenz ist schwer innerhalb von Fasern zu unterscheiden, vor allem bei geringer Vergrößerung. Zytoplasma- und Parenchymzellen können durch Eisebenentexturen von Wasser innerhalb von Tracheiden oder Gefäßen unterschieden werden. Die Analyse der Auswirkungen der Temperatur auf den Gefrierätzungsprozess zeigt, dass Froststaub allmählich sublimiert wird und endotracehid Grubenmembranen durch das Fortschreiten der Sublimation mit steigender Temperatur klarer werden.
Verbleibende große Froststaubpartikel können durch weitere Gefrierätzung eliminiert werden. Dies kann jedoch problematisch sein, da es den Oberflächenpegel des Eises in Xylem-Leitungen unnötig verringert. Die hohe Qualität der Beobachtung wird weitgehend durch eine genaue Probenvorbereitung erreicht.
Besonders wichtig ist die Glättung der Oberfläche mit der scharfen Klinge des Mikrotomes. Unzureichende Glättung durch eine gebrauchte Klinge kann manchmal eine raue Oberfläche erzeugen, die Messermarken ähnelt, oder zahlreiche Staubvorkommen aus den Schnitten erzeugen. Das Einfrieren von Proben ohne Entspannung des negativen Wassersäulendrucks führt zu einer artefaktuellen Kavitation in Xylem-Leitungen.
Clustere Eiskristalle werden in Gefäßen von Proben beobachtet, in denen die Probe nicht gelockert wurde. Im Gegensatz dazu werden in den entspannten Probenproben mit ähnlichem Wasserpotenzial keine geclusterten Eiskristalle beobachtet. Die Anwendung der Gefrierfixierung auf sich aufzeichnende lebende Pflanzen, die unter Dürre leiden, kann ergebnisbasierte Artefakte wie geballte Eiskristalle auslösen.
Diese Artefakte führen zu Fehlinterpretationen des Wasserzustands in Xylem-Leitung. Daher ist es wichtig, zuerst das Wasserpotenzial von Proben vor der Gefrierfixierung zu bestätigen. Obwohl dieses Verfahren ein Bild davon vorsieht, welchen Status in Xylem-Leitung, muss ein lebender Baum für die Beobachtung zerstört werden.
Die Kombination anderer nicht-invasiver Beobachtungsmethoden wie MRT oder Micro-CT mit einer nebenstehenden Bildbeobachtung wird unser Verständnis der Natur zwischen Wassertransport und Nutzung vertiefen. Die durch dieses Papier eingeführte Beobachtung des Wasserstatus wird auch eine Methode zur Klärung der Beziehung von Wasser, das in Zellen gemischt wird, und anderen anatomischen Reaktionen auf abiotischen oder biotischen Stress bieten. Cryo-SEM, ausgestattet mit energiedispersiver Röntgenspektroskopie oder Top-Sim, wurde verwendet, um die Elementverteilung über die Oberfläche einer wasserhaltigen Probe zu untersuchen.
Die Kombination von Elementaranalyse und diesem Verfahren in diesem ähnlichen Rahmen kann uns ein profundes Wissen über das Xylemzellverhalten im Zusammenhang mit dem Wasserstatus vermitteln. Wenn Sie flüssigen Stickstoff für die Gefrierfixierung von Proben in einem Raum verwenden, vergessen Sie nicht, den Raum zu belüften, um Sauerstoffmangel zu vermeiden.
