Im Video stellen wir ein Protokoll für die Gefrierfrakturierung von extrazellulären Vesikeln vor, die aus Blasenkrebszellen in vitro stammen. Extrazelluläre Vesikel sind membranbegrenzte Vesikel, die von Zellen abgeleitet werden, in den extrazellulären Raum freigesetzt werden und eine Rolle in der interzellulären Kommunikation spielen. Innerhalb extrazellulärer Vesikel unterscheiden wir drei Populationen, Exosomen, Mikrovesikel und apoptotische Körper, die sich durch ihren Ursprung, ihre Größe und ihre molekulare Zusammensetzung unterscheiden.
Die molekulare Zusammensetzung extrazellulärer Vesikel spiegelt das molekulare Profil der Spenderzelle wider und stört biologische Prozesse in der Empfängerzelle. Die Zusammensetzung der begrenzenden Membran zellulärer Vesikel ist jedoch entscheidend für die Interaktion mit der Empfängerzellmembran. Um die Organisation der begrenzenden Membran zu analysieren, müssen extrazelluläre Vesikel zuerst isoliert und dann an die Gefrier-Fraktur-Technik herangeführt werden.
Freeze-Fracture ist eine elektronenmikroskopische Technik, die sich der Untersuchung der zweidimensionalen Organisation biologischer Membranen, einschließlich Vesikeln, widmet. Die Schritte des Gefrierbrechens sind das schnelle Einfrieren der Probe, das Brechen der Probe, das Erstellen der Nachbildung der gefrorenen gebrochenen Oberfläche und das Reinigen der Replik, um biologische Materialien zu entfernen. Nachbildungen werden schließlich mit dem Transmissionselektronenmikroskop visualisiert.
Unser Ziel war es, die Gefrierbruchtechnik zu verwenden, um Mikrovesikel in Bezug auf Form, Größe und Zusammensetzung der Membran zu charakterisieren. Beginnen Sie mit dem Wachstum von Zellen im Zellinkubator. Untersuchen Sie Zellen unter dem Mikroskop, um ihre Variabilität und Konfluenz zu bestätigen.
Sammeln Sie Kulturmedien mit Mikrovesikeln in Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 300 g-Kräften für 10 Minuten. Sammeln Sie Überstände. Anschließend Zentrifugenüberstand bei 2000 g-Kräften und 10.000 g-Kräften.
Danach beobachten Sie die Spitze der Röhre für ein weißliches Pellet, das Mikrovesikel anzeigt. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Fügen Sie 1,5 Milliliter PBS hinzu und suspendieren Sie das Pellet mit Mikrovesikeln erneut.
Dann zentrifugieren Sie bei 10.000 g-Kräften. Achten Sie auf das weißliche Pellet. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie vorsichtig Fixiermittel hinzu.
20 Minuten bei 4 Grad Celsius stehen lassen. Als nächstes entfernen Sie das Fixiermittel und fügen Sie Waschpuffer hinzu, um das Pellet zu spülen, ohne es erneut auszusetzen. 10 Minuten bei 4 Grad Celsius stehen lassen.
Entfernen Sie den Waschpuffer und fügen Sie 30% Glycerin zum Pellet hinzu. Pellet wieder in homogene Suspension suspendieren und 30 Minuten bei 4 Grad Celsius inkubieren. Bereiten Sie saubere Kupferträger mit einer mittleren Grube vor und entwickeln Sie einen Kolben mit Stirnrunzeln und flüssigem Stickstoff.
Übertragen Sie die Probe unter dem Mikroskop in die mittlere Grube des Kupferträgers. Mischen Sie erstarrtes Freon, um verflüssigt zu werden. Greifen Sie den äußeren Ring des Trägers mit einer Pinzette und tauchen Sie ihn in gekühltes Freon.
Nach acht Sekunden wird der Träger schnell in den Entwicklungskolben mit flüssigem Stickstoff überführt. Mark Kryo abscheulich und kühle es. Unter flüssigem Stickstoff sammeln Sie die Träger in das Abwesen, schließen Sie es und lagern Sie es im flüssigen Stickstoffbehälter, bis das Frakturieren einfriert.
Bereiten Sie die Gefrierfraktionseinheit gemäß der Bedienungsanleitung des Herstellers vor. Starten Sie das Vakuumsystem und kühlen Sie die Gerätekammer auf minus 150 Grad Celsius ab. Kupferträger mit gefrorener Probe in die Gefrierfraktionierungseinheit überführen.
Stellen Sie die Messertemperatur auf minus 100 Grad Celsius ein und warten Sie auf das Vakuum. Beginnen Sie mit dem Schneiden der Probe, indem Sie die motorisierte Bewegung des Messers einschalten, bis die Oberfläche der Probe glatt ist. Für das Fracturing schalten Sie die motorisierte Bewegung des Messers aus und fahren Sie mit der langsamen manuellen Steuerung des Messers fort.
Fahren Sie mit der Platinschattierung im 45-Grad-Winkel fort. Schalten Sie die Hochspannung ein und erhöhen Sie den Strom zur Platinpistole. Platinfunken sollten beginnen, die Probe zu überschatten.
Überwachen Sie die Position von Platin auf dem Quarzkristalldickenmonitor. Die empfohlene Dicke von Platin beträgt 2,5 Nanometer. Schalten Sie Strom und hohe Spannung aus.
Fahren Sie mit der Kohlenstoffbeschattung in einem Winkel von 90 Grad fort. Schalten Sie die Hochspannung ein und erhöhen Sie den Strom für die Carbonpistole. Funken von Kohlenstoff sollten beginnen, die Probe zu beschatten.
Wenn 2,5 Nanometer Kohlenstoff erhalten werden, schalten Sie den Strom und die hohe Spannung aus. Übertragen Sie diese Proben mit den Repliken von der Gefrierbrucheinheit auf eine 12-Ventil-Platte, die mit doppelt destilliertem Wasser gefüllt ist. Repliken schwimmen auf der Wasseroberfläche, während die Träger sinken.
Übertragen Sie Repliken mit Drahtschlaufe auf eine mit Natriumhypoclorit gefüllte 12-Ventilplatte und inkubieren Sie über Nacht. Repliken in doppelt destilliertem Wasser waschen. Sammeln Sie sie auf einem Mesh-Kupfer-TM-Rost und lassen Sie sie zwei Stunden an der Luft trocknen.
Verwenden Sie ein Transmissionselektronenmikroskop, um Repliken abzubilden und mikroskopische Aufnahmen zu erhalten. Für eine genaue Interpretation von Repliken und Mikrographien befolgen Sie die Richtlinien für die richtige Orientierung in der Nomenklatur. Analysen von Repliken zeigten, dass isoliertes konditioniertes Medium eine angereicherte Fraktion von Vesikeln enthielt.
Isolierte Vesikel wurden entweder in Dreier- oder Mehrergruppen gesammelt oder sehr einzeln verteilt. Die Vesikel waren kugelförmig. Der Durchmesser der Vesikel entsprach dem Durchmesser der Mikrovesikel.
Freeze-Fracturing zeigte auch eine zweidimensionale Organisation der Mikrovesikelmembran. Die exoplasmatische Phase der Mikrovesikel hatte ein glattes, gleichmäßiges Aussehen, während wir in der Protoplastenphase Intermembranpartikel beobachteten. Intermembranpartikel traten sporadisch auf, was bedeutet, dass Mikrovesikel, die aus Krebsmaterialzellen isoliert wurden, nur eine geringe Menge an Membranproteinen oder Proteinanordnungen enthalten.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich die im vorgestellten Protokoll verwendete Gefrier-Fraktur-Technik als optimale Technik zur Charakterisierung extrazellulärer Vesikel erweist und zur Bewertung anderer Populationen extrazellulärer Vesikel verwendet werden kann. Ein entscheidender Vorteil der Gefrierbruchtechnik ist ihre Fähigkeit, die innere Organisation der vesikelbegrenzenden Membran aufzulösen, die die biologische Funktion extrazellulärer Vesikel bestimmt.
