Dieses VX2-Endometriumkrebsmodell mit retroperitonealer Lymphknotenmetastasierung kann zur Untersuchung von Technologie für bildgeführte Chirurgie verwendet werden. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie zuverlässig, einfach ist und eine konsistente metastasierende Ausbreitung erzeugt, die das Muster des menschlichen Endometriumkrebses imitiert. Insgesamt ist dies eine einfache Technik.
Das Üben des Nahts vor dem Versuch, das Modell zu erstellen, wird jedoch dazu beitragen, den Prozess zu vereinfachen. Die visuelle Demonstration dieser Technik ist wichtig, da sie hilft, die chirurgischen Schritte bei der Modelleinrichtung zu demonstrieren. Demonstrieren das Verfahren mit Harley Chan und ich wird Lili Ding, eine Technikerin aus unserem Labor.
Um in vitro vermehrte VX2-Zellen für die Injektion vorzubereiten, beginnen Sie mit der Erwärmung gefrorener Durchstechflaschen von VX2-Zellen in einer 37 Grad Celsius Perlen oder einem Wasserbad für eine Minute. Wenn die Zellen aufgetaut sind, ziehen Sie die Zellsuspensionen in einem 15-Milliliter-Rohr mit 10 Milliliter Kulturmedium. Sedimentieren Sie die Zellen durch Zentrifugation.
Das Pellet in neun Millilitern Medium wieder aufhängen. Übertragen Sie die Zellen in einen großen Kulturkolben für die Inkubation bei 37 Grad Celsius ohne Schütteln, und überprüfen Sie die Zellen täglich auf Zusammenfluss durch Lichtmikroskopie. Wenn die Zellen 80 % Konfluenz erreicht haben, fügen Sie dem Kolben drei Milliliter 0,2% Trypsin hinzu und geben Sie die Zellen für fünf Minuten an den Zellkultur-Inkubator zurück.
Wenn sich die Zellen gelöst haben, übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches Rohr, um die Zellen durch Zentrifugation zu sammeln. Waschen Sie das Zellpellet dreimal mit neun Millilitern frischer PBS pro Wäsche. Nach der letzten Wäsche die Zellen in frischem PBS zur Zählung wieder aussetzen, bevor Sie in einer neuen konischen Röhre auf Eis auf viermal 10 auf die sieben VX2-Zellen pro Milliliter PBS-Konzentration verdünnen.
Um in vivo-vermehrte VX2-Zellen für die Injektion vorzubereiten, tauen Sie eins um einen Zentimeter VX2-Tumorblöcke auf und verwenden Sie ein Skalpell, um die Gewebeproben in einer Kulturplatte zu zerkleinern. Übertragen Sie die Gewebefragmente in einen 70-Mikrometer-Filter und fügen Sie kleine Aliquots von bis zu einem Milliliter von Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) hinzu, um sicherzustellen, dass alle Zellen durch das Sieb geleitet werden. Dann zählen Sie die Zellen, bevor Sie die Zellsuspension auf ein mal 10 bis zu den sieben VX2-Zellen pro Milliliter HBSS-Konzentration in einer sterilen Röhre auf Eis verdünnen.
Nachdem Sie einen Mangel an Reaktion auf Stimulus bestätigt haben, legen Sie das anästhesierte weibliche weiße neuseeländische Kaninchen in die dorsale Position auf den Operationstisch. Schneiden Sie das Haar über das Becken und den Bauch, und verwenden Sie eine dreistufige chirurgische Hautvorbereitung, um die exponierte Haut zu reinigen. Mit einer chirurgischen Mütze und Gesichtsmaske, schrubben Sie die Hände mit Desinfektionsmittel, bevor Sie ein steriles Kleid und sterile chirurgische Handschuhe anziehen.
Landmark die Spitze des Schambeins und drapieren das operationsopische Feld mit Laparotomie-Vorhänge, so dass eine fünf mal fünf Zentimeter Bereich des Unterbauchs ausgesetzt. Als nächstes verwenden Sie eine Nummer 11 Skalpellklinge, um einen 2,5-Zentimeter-Schnitt einen Zentimeter Schädel zur Symphyse pubis durch Haut und Subkutangewebe zu machen. Incise die rectus fascia und sezieren Sie die Rectus-Muskeln seitlich, um das zugrunde liegende Peritoneum zu entlarven.
Bestätigen Sie, dass die Unterfläche frei von Darm oder anderen Bauchorganen ist. Sgenau in das Peritoneum, um die Harnblase zu identifizieren und einen gehandicapten Finger überlegen, nachträvoll und seitlich über die Spitze der Blase zu fegen, um die Gebärmutterhörner zu lokalisieren. Extrahieren Sie die Uterushörner durch den Bauchschnitt, um auf der Bauchwand zu ruhen.
Verwenden Sie eine 3-0 geflochtene resorbierbare Naht, um eine einzige Nahtligation jedes Gebärmutterhorns durchzuführen, etwa 1,5 bis zwei Zentimeter distal zu den Cervices und nur medial zu den Gebärmutterarterien. Dann binden Sie die Nähte eng, um die distalen Uterushörner einzuschließen. Um das Myometrium mit der zuvor vorbereiteten VX2-Zellsuspension zu impfen, laden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 27-Spur-Nadel mit einem Milliliter Zellen.
Injizieren Sie langsam 0,5 Milliliter der Zellsuspension über eine Minute in jedes Gebärmutterhorn proximal in die Nahtstelle zwischen der Naht und dem Gebärmutterhals. Dann drücken Sie 30 Sekunden lang druck auf die myometriale Injektionsstelle, um zelllose Leckagen zu minimieren. Inspizieren Sie die Injektions- und Nahtstellen auf Hämostase, bevor Sie die Uterushörner wieder in den Bauch legen.
Für tiefe Bauchwandverschluss, identifizieren Sie die Spitze des peritonealen Schnittund und verwenden Sie eine chirurgische Klemme, um das Peritoneum rectus Muskel und Faszien zu erfassen. Verankern Sie die Naht, indem Sie eine 3-0 resorbierbare Polyfilament-Naht, oberflächlich bis tief auf einem Scheitelpunkt des Einschnitts, und tief bis oberflächlich auf der anderen. Mit der beigefügten Naht, machen Laufstiche senkrecht zum Schnitt durch die Schichten der Bauchwand, arbeiten schrittweise entlang des Schnittes von Seite zu Seite, bevor Sie die Naht binden und schneiden Die losen Enden.
Für oberflächliche Bauchwandverschluss, verwenden Sie eine vergrabene laufende untergeschnittene subcuticular 3-0 resorbierbare Polyfilament-Naht, um tief bis oberflächlich auf der einen Seite des Einschnitts und oberflächlich bis tief auf der anderen zu verschließen. Nach dem Verknoten der Nähte verwenden Sie die verankerten Nähte, um Laufstiche in der dermalen Schicht parallel zum Schnitt zu machen, und arbeiten sie schrittweise entlang des Schnitts von Seite zu Seite. Binden Sie die Nähte und entfernen Sie die losen Enden.
Tragen Sie chirurgischen Kleber auf den geschlossenen Schnitt auf, um die Hautränder zu appose. Dann legen Sie das Tier auf eine warme Decke mit Sauerstoff und Überwachung, bis das Tier wachsam ist und in der Lage ist, unabhängig zu sitzen. Bei der Etablierung dieses Modells war eine Dosis von zwei mal 10 auf die sieben Zellen pro Gebärmutterhorn bei vier Kaninchen erfolgreich, in einer durchschnittlichen Zeit von 45 Tagen von der Impfung bis zum Experiment und wurde somit als optimale Injektionsdosis für das kultivierte VX2-Modell bestimmt.
Für das in vivo-vermehrte VX2-Modell, das erfolgreich bei 16 Kaninchen mit einer durchschnittlichen Zeit von der Impfung bis zum Experiment von 29 Tagen erstellt wurde, wurde fünfmal 10 bis zu den sechs Zellen pro Gebärmutterhorn als optimale Injektionsdosis bestimmt. Alle Modelle führten zu einer erfolgreichen metastasierenden Transformation der retroperitonealen Lymphknoten. Darüber hinaus erschienen Tumore und metastasierende Lymphknoten aus kultivierten VX2-Zellen tumoren aus in vivo-vermehrten VX2-Zellen durch histologische Analyse ähnlich, wobei Densymetoxolin-gefärbte Zellen im eindringenden Muskel beobachtet wurden und drüsenähnliche Strukturen mit vielen pathologischen mytotischen Figuren bildeten.
Legen Sie Ihre Naht medial auf die Gebärmutterarterie, um Blutungen aus einer Gefäßpunktion zu vermeiden und achten Sie darauf, die Zellen in das Myometrium und nicht in die Endometriumhöhle zu infiltrieren. Achten Sie darauf, während der Modellerstellung die richtige sterile Technik zu verwenden, um eine postoperative Infektion zu verhindern und sich während der Operation mit dem Bariummaterial zu schützen.
