Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung und Analyse eines einzigartigen Biosensors, der entwickelt wurde, um die chemischen Komponenten von Schussrückständen zu erkennen. Der Einsatz von Biosensoren für forensische Anwendungen ist einzigartig. Es stellt eine kostengünstige, einfach zu bedienende Alternative zu den hochspezialisierten Instrumenten dar, die typischerweise in forensischen Laboratorien verwendet werden.
Die beschriebenen Methoden der synthetischen Biologie können für jedes System verwendet werden, das standardsynthetische Biologieteile verwendet. Die beschriebene chemische Analyse ist auf jeden Biosensor anwendbar, der rotes fluoreszierendes Protein ausdrückt. Demonstriert wird das Verfahren von Andrea Soles und Elle Richardson, Studenten der Longwood University.
Um dieses Verfahren zu beginnen, fügen Sie zehn Mikroliter der zuvor isolierten J10060-Plasmid-DNA in ein Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie acht Mikroliter Wasser und je einen Mikroliter der EcoRI- und NHEL-Enzyme vorgemischt mit einem Mikroliter Puffer hinzu. Für die Promotor-DNA fügen Sie zehn Mikroliter geglühter Promotor-DNA-Sequenzen in ein frisches Mikrozentrifugenrohr ein.
Fügen Sie acht Mikroliter Wasser und je einen Mikroliter der EcoRI- und NHEL-Enzyme vorgemischt mit einem Mikroliter Puffer hinzu. Mit einer Auf zehn Mikroliter eingestellten Pipette pipette die Proben vorsichtig nach oben und unten, um sie zu mischen. Inkubieren Sie die Proben bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten.
Dann die Enzyme bei 80 Grad Celsius fünf Minuten lang erhitzen und aktivieren. Bewahren Sie die verdaute DNA in einem Gefrierschrank auf, bis sie fertig ist. Verwenden Sie zunächst die Plasmid- und Promotor-DNA, die zuvor verdaut wurden, um die Reaktion in einem Mikrocetrifugenrohr auf Eis einzurichten, wie in Tabelle 1 des Textprotokolls beschrieben.
Achten Sie darauf, die T4 DNA Ligase zuletzt hinzuzufügen. Pipette sanft nach oben und unten, um die Reaktion zu mischen, und Zentrifugieren Sie kurz. Bei Raumtemperatur zehn Minuten lang inkubieren.
Dann erhitzen und bei 65 Grad Celsius für zehn Minuten aktivieren. Führen Sie die Transformation wie im Textprotokoll beschrieben durch. Richten Sie zunächst die Reaktionsgemische für PCR ein, wie in Tabelle 2 des Textprotokolls beschrieben.
Sanft Pipette nach oben und unten, um die Reaktionen zu mischen. Mit einer gelben Pipettespitze eine Kolonie des transformierten E.coli kratzen. Übertragen Sie einen Wisch dieses E.coli auf eine neue LB-Ampicillin-Agarplatte, die abgetrennt wurde, und legen Sie dann die Pipettenspitze in das PCR-Rohr ein.
Schütteln Sie die Pipettenspitze, um den E.Coli mit dem PCR-Mix zu mischen. Wiederholen Sie diesen Vorgang drei weitere Male für zusätzliche Kolonien. Laden Sie dann die PCR-Röhren in eine PCR-Maschine und beginnen Sie mit dem Thermocycling, wie in Tabelle 3 des Textprotokolls beschrieben.
Um mit der Bezeichnung der entsprechenden Anzahl steriler Kulturröhren zu beginnen, wie in Tabelle 4 des Textprotokolls beschrieben. Fügen Sie zwei Milliliter der vorbereiteten Kulturbrühe zu jeder Röhre hinzu. Fügen Sie die Anilite-Stammlösung zu den Rohren hinzu, wie in Tabelle 4 beschrieben.
Legen Sie dann die Schnappkappen auf die Kulturrohre, damit sie lose sind, um Luftinlauf in das Rohr zu ermöglichen. Wirbel jede Kulturröhre. Danach die Rohre bei 37 Grad Celsius und mindestens 24 Stunden in einen Schüttel-Inkubator geben.
Verwenden Sie zunächst ein Aufdemaum basierendes Tuch auf Ethanolbasis zum Entfernen von Blei, um alle Oberflächen der Hände, einschließlich zwischen den Fingern, abzuwischen. Bewahren Sie die Tücher bis zur Analyse in einem entsprechend beschrifteten verschließbaren Baggie auf. Verwenden Sie ein alkoholbasiertes Tuch, um alle zu prüfenden großen Oberflächen abzuwischen.
Verwenden Sie einen mit Ethanol befeuchteten Baumwolltausch, um zu prüfende kleine Oberflächen abzuwischen. Mit sauberen Handschuhen und mit einer Schere, die mit Alkohol gereinigt wurde, schneiden Sie einen Abschnitt, der etwa einen Quadratzentimeter aus der Mitte des Wischens ist. Legen Sie dann das geschnittene Stück Wisch, oder Wattestäbchen, direkt in ein Kulturrohr mit zwei Millilitern der Sensorbakterien, und stellen Sie sicher, dass es vollständig in der Brühe versunken ist.
Bereiten Sie das Spektrometer vor, um fluoreszierende Unterwerfung bei der entsprechenden Wellenlänge für die RFP-Variante mit einer Anregungswellenlänge von 500 Nanometern zu sammeln. Dann verwenden Sie einen Wirbelmischer, um die Rohre zu schütteln. Übertragen Sie jeden Überstand vorsichtig auf eine Küvette mit geringem Volumen und erfassen Sie die Emissionsintensität.
Schütteln Sie die Rohre mit einem Wirbelmischer. 200 Mikroliter der Brühe in einen Brunnen in der Brunnenplatte geben. Zeichnen Sie auf, welche Proben in jeden Brunnen dieser Platte gelangt sind.
Richten Sie das Mehlometer ein, um die Emissionsintensität bei der entsprechenden Wellenlänge für die RFP-Variante zu erfassen. Die Fluoreszenzspektren für eine repräsentative RFP-Variante zeigen sowohl die Negativkontrolle als auch die Spektren auf zwei verschiedenen Anilite-Stufen. Das maximale Fluoreszenzsignal für die bei dieser Arbeit verwendete RFP-Variante wird bei 575 Nanometern beobachtet.
Repräsentative Daten werden für den gleichen Satz von Lösungen gesammelt, sowohl vom tragbaren Spektrometer als auch vom Fluorometer. Es gibt einen allgemeinen Trend der Fluoreszenz steigt mit der Konzentration von Anlit zu erhöhen. Es ist erwähnenswert, dass bei hohen Konzentrationen, die für den Bleisensor über 800 Teile pro Milliarde liegen, die Reaktion aufgrund der Toxizität von Blei bei einer so hohen Konzentration abfällt.
Die Analyse von Ethanol-Tupferproben von der Innenseite eines verbrauchten 40-Kaliber-Patronengehäuses liefert einen Beweis für die wichtigsten Ergebnisse. Die positiven Ergebnisse von jedem der drei Sensorbakterien deuten auf einen positiven Test auf Schussrückstände hin. Die in diesem Protokoll hergestellten Biosensoren können auch einzeln eingesetzt werden, um Verunreinigungen in Lebensmitteln, Wasser oder Umweltproben zu erkennen.
Diese Technik ebnet den Weg für Forscher, Biosensoren mit Standard-Synthetikbiologie-Techniken für eine Vielzahl von verschiedenen chemischen Aniliten zu entwickeln. Persönliche Schutzausrüstung sollte getragen werden, und Analysten sollten Hände waschen und Oberflächen nach dem Umgang mit E.coli desinfizieren. Abfälle sollten autoklaviert werden, und alle altmetallhaltigen Abfälle sollten entsprechend behandelt werden.
