Das Zytotoxizitäts-Assay-Protokoll unter Verwendung von Zebrafisch-Zelllinien kann Fragen zur akuten Toxizität von Chemikalien bei Fischen beantworten oder helfen, die geeigneten Testkonzentrationen für andere alternative Fisch-Assays zu definieren. Der Hauptvorteil dieses 96-Well-Plattentests besteht darin, verschiedene Viabilitätsendpunkte zu kombinieren, um die Zytotoxizität für Zebrafischzellen zu bestimmen, die eine wichtige Fischart in Ökotoxizitätsstudien sind. Das Protokoll ist sehr einfach.
Wenn Sie alle beschriebenen Schritte korrekt ausführen, sollte kein Problem auftreten. Dieses Protokoll trägt dazu bei, keine tierbasierten Ökotoxizitätsstudien durchzuführen, in denen die Auswirkungen von Fischzelllinien aus verschiedenen Organen oder Lebensstadien wie Hepatozyten in embryonalen Zellen bewertet werden. Um mit der Beschichtung der ZEM2S- oder ZFL-Zellen zu beginnen, berechnen Sie das Volumen der jeweiligen Zellsuspensionen, die benötigt werden, um die gewünschte Anzahl von Zellen für Assays zu erhalten.
Füllen Sie ein steriles Reagenzreservoir mit dem kompletten Nährmedium für die entsprechende Zelllinie und überführen Sie das berechnete Volumen der Zellsuspension in das Reservoir für ein Gesamtvolumen von 20 Millilitern. Mischen Sie die Lösung mit einer Mehrkanalpipette vorsichtig auf und ab, ohne Schaum oder Blasen zu bilden. Geben Sie dann mit der Mehrkanal-Mikropipette 200 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer transparenten Polystyrol-96-Well-Platte, um eine lebensfähige Zellzahl von 60.000 Zellen pro Vertiefung für die ZEM2S-Zellen und 40.000 Zellen pro Vertiefung für die ZFL-Zellen zu erhalten.
Inkubieren Sie die Platte 24 Stunden lang bei 28 Grad Celsius. Um einen der beiden Zelltypen unterschiedlichen Konzentrationen der Prüfchemikalien auszusetzen, wird die gewünschte Konzentration der Prüfchemikalienlösungen in den Nährmedien für die interessierende Zelllinie ohne fötales Rinderserum oder FBS hergestellt. Nach der 24-stündigen Inkubation entsorgen Sie die verbrauchten Medien vorsichtig mit einer Mehrkanal-Mikropipette aus den Vertiefungen.
Fügen Sie dann 100 Mikroliter einer bestimmten Prüfchemikalienlösung pro Vertiefung in technischen Dreifachteilen hinzu, d. h. drei Vertiefungen für jede Prüfchemikalienkonzentration. Die Kontrollgruppen werden in technischen Dreifachraten auf die gleiche Platte wie die Prüfchemikalien gelegt. Für die Blindkontrolle werden 100 Mikroliter des Belichtungsmediums in drei zellfreie Vertiefungen gegeben.
Für die Negativkontrolle werden 100 Mikroliter des Belichtungsmediums in drei Vertiefungen mit Zellen gegeben. Für die Positivkontrolle werden drei Vertiefungen, die Zellen enthalten, einer 1%igen Triton X-100-Lösung ausgesetzt, die in den Expositionsmedien hergestellt wurde. Versiegeln Sie die Platten mit Parafilm oder klebender Siegelfolie, um die Verdunstung des Nährmediums zu verhindern, und inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang bei 28 Grad Celsius.
Nach 24 Stunden Exposition gegenüber der Prüfchemikalie entsorgen Sie die Expositionsmedien vorsichtig aus den Vertiefungen, indem Sie den Inhalt in eine Auffangschale gießen und jede Vertiefung mit 200 Mikrolitern PBS waschen. Um das PBS zu entfernen, ohne Zellen zu verlieren, gießen Sie es vorsichtig in eine Auffangschale. Um die Alamar Blue- oder AB- und CFDA-AM-Assays durchzuführen, fügen Sie 100 Mikroliter der jeweiligen Lösung pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang im Dunkeln bei 28 Grad Celsius.
Als nächstes messen Sie die Fluoreszenz in einem Fluoreszenzplatten-Reader bei den im Text genannten geeigneten Anregungs- und Emissionswellenlängen. Um den neutralen Rot- oder NR-Test durchzuführen, nehmen Sie die NR-Arbeitslösung mit einer Konzentration von 40 Mikrogramm pro Milliliter und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 600 G. Entfernen Sie anschließend vorsichtig die zuvor hinzugefügten AB- und CFDA-AM-Lösungen aus den Vertiefungen, indem Sie den Inhalt in eine Auffangschale gießen.
Fügen Sie mit einer Mehrkanal-Mikropipette 100 Mikroliter der NR-Arbeitslösung pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Platte drei Stunden lang bei 28 Grad Celsius. Sobald die Inkubation beendet ist, gießen Sie die NR-Lösung vorsichtig von der Platte in eine Auffangschale und waschen Sie die Vertiefungen mit 150 Mikrolitern PBS pro Vertiefung. Fügen Sie nach dem Waschen 150 Mikroliter der NR-Extraktionslösung pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Platte, indem Sie sie 10 Minuten lang vorsichtig auf einem Plattenschüttler schütteln, bevor Sie die Absorption bei 540 Nanometern mit einem Plattenleser messen.
Um den MTT-Assay durchzuführen, entfernen Sie nach der 24-stündigen Exposition gegenüber der Testchemikalie vorsichtig das Expositionsmedium, indem Sie den Inhalt in eine Auffangschale gießen und mit einer Mehrkanal-Mikropipette 100 Mikroliter MTT-Arbeitslösung pro Vertiefung im Dunkeln hinzufügen. Inkubieren Sie die Platte bei 28 Grad Celsius vier Stunden lang im Dunkeln. Entsorgen Sie dann die MTT-Lösung, indem Sie den Inhalt in eine Auffangschale gießen und 100 Mikroliter DMSO in jede Vertiefung geben, um die Formazankristalle zu extrahieren.
Inkubieren Sie die Platte 10 Minuten lang auf einem Plattenschüttler, bevor Sie die Absorption bei 517 Nanometern mit einem Plattenleser messen. Für den AP-Assay zeigten die Vertiefungen, die den Blind-, Positivkontroll- und hochzytotoxischen Konzentrationen von Testchemikalien entsprachen, eine blaue Farbe und eine geringe Fluoreszenz, was entweder auf das Fehlen oder eine Verringerung lebensfähiger Zellen hinweist. Im Gegensatz dazu wandelten die Vertiefungen, die niedrigen zytotoxischen Konzentrationen der Prüfchemikalie und der Negativkontrolle entsprachen und eine hohe Anzahl lebensfähiger Zellen enthielten, das Resazurin in rosa Resorufin mit höherer Fluoreszenz um.
Für den NR-Assay sind die hochzytotoxischen Konzentrationen der Testchemikalien und die Positivkontrolle transparent oder blassrosa mit geringer Absorption, während Vertiefungen, die lebensfähige Zellen enthielten, die den NR-Farbstoff zurückhielten, eine dunkelrosa Farbe und eine hohe Absorption aufwiesen. In ähnlicher Weise sind für den MTT-Assay Vertiefungen ohne lebensfähige Zellen transparent, während diejenigen, die lebensfähige Zellen enthalten, MTT in violett gefärbtes Formazan umwandeln. Basierend auf den berechneten Zellviabilitätsprozentsätzen wurde die halbmaximale Inhibitorkonzentration oder der IC50-Wert für die verschiedenen Testchemikalien in ZFL- und ZEM2S-Zelllinien geschätzt.
Für Kulturen mit und ohne FBS wurde kein signifikanter Unterschied in der Zellviabilität beobachtet, was auf die Eignung von Nährmedien hinweist, denen FBS für die chemische Expositionsdauer von 24 Stunden entzogen wurde. MTT- und NR-Assays zeigten keinen signifikanten Einfluss unterschiedlicher DMSO-Konzentrationen von 0,1 % bis 1 % auf die Zellviabilität, was darauf hindeutet, dass diese Zelllinien die Verwendung von DMSO als Lösungsmittel bis zu 1 % unterstützen. Achten Sie beim Umgang mit plattierten Zellen besonders darauf, eine Selbstablösung während des gesamten Verfahrens zu vermeiden, und bereiten Sie die neutrale rote Arbeitslösung sorgfältig vor, um eine Ausfällung des Farbstoffs zu vermeiden. Dieses Verfahren kann auf Studien angewendet werden, die sich mit verschiedenen Aspekten der chemischen Auswirkungen auf Fische unter Verwendung von In-vitro-Modellen befassen, und trägt dazu bei, dass keine tierbasierten Ökotoxizitätsstudien durchgeführt werden.
