Es ist schwierig, die Genexpression in menschlichen Inseln zu modulieren, auch ein größerer Rückgang der funktionierenden menschlichen Inseln stellt nach der Modulation der Genexpression große Herausforderungen dar. Durch die Kombination der lentivirus vermittelten SHR8-Transduktion und der Bildung von humangeeigneten Inseln. Dieses Protokoll ermöglicht eine effiziente Downregulation eines zielgerichteten Gens bei gleichzeitiger Erhaltung der Isletfunktion während einer längeren Kultur.
Zu Beginn, sanft wirbeln Sie die Versandflasche, um Inselchen in Suspension zu halten. Übertragen Sie das Versandmittel mit Inselchen auf ein 50 Milliliter konisches Zentrifugenrohr. Lassen Sie das Rohr 15 Minuten in einem biologischen Sicherheitsschrank sitzen, damit sich die Inselchen an der Unterseite des Rohres absetzen.
Entfernen Sie das Versandmedium vorsichtig mit einer Kapillarpipette, ohne das Isletpellet zu stören. Setzen Sie das Isletpellet in CMRL-Medium mit 1%humanem Serumalbumin auf eine Konzentration von 400 Isletäquivalent enjekten pro Milliliter wieder aus. Übertragen Sie Inselchen in eine nicht-Gewebekultur behandelte Schale und Kultur sie bei 37 Grad Celsius in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator über Nacht.
Nach der Nachtkultur menschliche Inselchen in ein 15 Milliliter kegelförmiges Zentrifugenrohr, Zentrifuge bei 250-fachm g für fünf Minuten in einem schwingenden Schaufelrotor übertragen. Und das Medium mit einer Kapillarpipette ansaugen, ohne das Inselpellet zu stören. Waschen Sie das Pellet meine Zugabe von 10 Milliliter PBS in das Rohr, mischen Sie sanft und Zentrifuge bei 250 mal g für fünf Minuten.
Nach der Zentrifugation PBS aspirieren, ohne das Inselpellet zu stören. Das Pellet in 0,5 Milliliter n einer vorgewärmten proteolytischen und kollagenlytischen Enzymmischung wieder aufhängen. Pipette fünfmal mit einer P1000 Pipette, um Inselchen zu mischen.
Bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten inkubieren. Mischen Sie nach der Inkubation pipette, die sanft auf und ab streichelt. Überprüfen Sie die Bewölkung einzelner Zellen und die Anzahl der Flocken oder unverdauten Inselchen.
Legen Sie ein 40-Mikron-Sieb in eine 35-Millimeter-Petrischale und befeuchten Sie das Sieb, indem Sie einen Milliliter CMRL-Medium mit 10% hitzeaktiviertem fetalem Rinderserum hinzufügen und mit einem Ein-Milliliter-Spritzenkolben deprimieren. Übertragen Sie die gesamte Zellsuspension auf das Sieb. Und sammeln Sie den Pass in einem frischen 15 Milliliter Rohr.
Waschen Sie das Rohr für die Vergärung der Islet mit 0,5 Millilitern frischem CMRL-Medium, um übrig gebliebene Zellen zu sammeln und die Wäsche durch das Sieb zu leiten. Kombinieren Sie den Durchgang in einem 15 Milliliter Rohr. Wiederholen Sie dies einmal.
Um unverdaute, auf dem Sieb verbleibende Inselchen zu dissoziieren, drücken Sie das Sieb mit einem Ein-Milliliter-Spritzenkolben. Sammeln Sie den Pass wieder und waschen Sie das Sieb mit frischem einfachen CMRL 1066 Medium, um alle verbleibenden verdauten Inseln aus dem Sieb und der Schale zu entfernen. Fügen Sie den Pass in das 15-Milliliter-Rohr.
Zeichnen Sie das Gesamtvolumen der Zellsuspension auf und nehmen Sie einen 10 Mikroliter Aliquot von Zellen, um die Zellzahl auf einem Hämozytometer zu zählen. Nach dem Zentrieren der Zellsuspension für fünf Minuten bei 200 mal g, entfernen Sie das Medium, ohne das Pellet zu stören. Um Pseudo-Inseln mit einer 96 gut ultra niedrigen Befestigungsplatte zu produzieren, berechnen Sie zunächst das Gesamtvolumen der erforderlichen ein mal 10 bis die fünften Zellen pro Milliliter der Einzelzellsuspension.
Dann setzen Sie das Isletpellet in CMRL-Medium mit 10% Hitze inaktivierten fetalen Rinderserum wieder auf, so dass 30 Mikroliter der Zellsuspension 3000 Zellen haben. Als nächstes übertragen Sie das benötigte Volumen der Einzelzellensuspension in ein frisches 15-Milliliter-Rohr. Bei 250 Transduktionseinheiten pro Zelle eines Lentivirus, das SH-RNA enthält und auf ein Gen von Interesse oder eine Kontrolle abzielt.
Um die Zellsuspension mit dem Virus zu mischen, Pipette vorsichtig fünf Mal mit einer P1000 Pipette. Dann übertragen Sie die gemischten Zellen in ein 50 Milliliter steriles Reagenzreservoir, wenn Sie eine Achtkanalpipette verwenden. Mit einer Achtkanalpipette oder einer P200-Pipette 30 Mikroliter pro Brunnen der mit Lentivirus vermischten Zellsuspension in jeden Brunnen geben.
Als nächstes zentrifugieren Sie die 96-Wellplatte in einer schwingenden Schaufelplattenzentrifuge bei 270-fachg bei Raumtemperatur sieben Minuten lang. Kultur bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5% Kohlendioxid-Inkubator über Nacht. Nach der Inkubation die 96-Wellplatte aus dem Inkubator entfernen und in den biologischen Sicherheitsschrank legen.
Pipette 100 Mikroliter pro Insel von 10%hohe FBSCMRL in einen Brunnen zu verhindern, trocknen von Inselchen und weiterhin Kultur für eine Woche. Pipette 100 Mikroliter pro Brunnen cmRL Medium mit 10% Hitze inaktivierten fetalen Rinderserum aus dem Reservoir zu den Pseudo-Inseln und Pipette auf und ab zwei bis drei Mal sanft im Brunnen, um Inselchen zu heben. Dann das Medium im Brunnen, das eine Pseudoinsel enthält, ansaugen und in eine 10 Zentimeter lange Petrischale auswerfen.
Überprüfen Sie die Platte unter einem Lichtmikroskop, um die vollständige Entfernung aller Pseudo-Inseln sicherzustellen, und fahren Sie mit nachgelagerten Experimenten fort. Um Pseudo-Inseln mit einer 24 Well-Mikro-Well-Kulturplatte zu produzieren, fügen Sie zuerst 500 Mikroliter pro Brunnen einer Anti-Haft-Spüllösung hinzu. Zentrifuge bei 1300 mal g für fünf Minuten in einer schwingenden Schaufelplattenzentrifuge.
Beobachten Sie dann die Platte unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass Luftblasen aus Mikrobrunnen entfernt werden. In einem biologischen Sicherheitsschrank die Anti-Haft-Spüllösung aus den Brunnen ansaugen. Spülen Sie jeden Brunnen mit zwei Milliliter warme ebene CMRL 1066 medium einmal.
Dann aspirieren Sie die ebene CMRL 1066 medium und fügen Sie 0,5 Milliliter pro Brunnen warmes CMRL mit 10% Hitze inaktiviertfetales Rinderserum zu jedem gut geplanten für den Einsatz. Bestimmen Sie die Gesamtzahl der Zellen, die für jeden Brunnen benötigt werden. Setzen Sie die einzelzellen in 0,8 Milliliter CMRL-Medium mit 10% Hitze inaktivierten fetalen Rinderserum in einem sterilen 1,5 Milliliter-Rohr wieder auf.
Um einen Brunnen von Pseudo-Islet durch ein Lentivirus transduziert zu erstellen, fügen Sie 125 Transduktionseinheiten pro Zelle zur Einzelzellsuspension hinzu, wodurch das Virusvolumen unter 0,2 Milliliter bleibt. Inkubieren Sie die Zell- und Virusmischung bei 37 Grad Celsius mit gelegentlicher sanfter Vermischung für eine Stunde, um den Kontakt von Zellen mit Viren vor kondensierender Zellen zu ermöglichen. Passen Sie nach einer Stunde das Gesamtvolumen der Ischenzelle und des Virusgemisches auf einen Milliliter an, indem Sie CMRL-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum hinzufügen.
Wenn Zellen nach einer einstündigen Inkubation Klumpen bilden, dispergieren Sie sich in eine Einzelzellsuspension durch sanftes und schnelles Pipetieren zwei- bis dreimal. Übertragen Sie die Zellsuspension auf einen Brunnen der 24 Well-Mikro-Well-Kulturplatte. Unmittelbar nach der Pipettierung zentrifugieren Sie bei 100-facher g bei Raumtemperatur für drei Minuten, um Zellen in alle Mikrobrunnen einzufangen.
Beobachten Sie unter dem Mikroskop, um zu überprüfen, ob die Zellen gleichmäßig in allen Mikrobrunnen verteilt sind. Es ist wichtig, die Mikro-Well-Platte sofort nach dem Hinzufügen des Brunnens, der die Einzelzellsuspension der Islet in die Brunnen mischt, zu zentrieren. Sequenzielle Veränderungen in der Morphologie von Pseudo-Inselchen aus 3000 menschlichen Inselzellen, die in einer 96 gut ultra niedrigen Befestigungsplatte erstellt wurden, zeigten monolayer oder lose Zellklumpen, die in einer Woche in feste Aggregate mit einem glatten runden Rahmen verwandelt wurden.
Im Gegensatz dazu ist in einer Mikrobrunnenkulturplatte die Bildung von Zell- und Pseudoinseln aus nur 500 Inselzellen in der Regel innerhalb von vier Tagen sichtbar. Die einheitliche Größe von Pseudo-Inseln reduziert die Variation innerhalb einer Testgruppe und ermöglicht eine statische Inkubation mit nur fünf Pseudo-Inseln pro Messung. Der Perry Fusion Assay für Insulin-Antwort zeigte, dass menschliche Pseudo-Islets nach sieben Tagen Kultur eine robuste Insulinsekretion in der ersten Phase als Reaktion auf Glukose aufrechterhielten.
Die Einführung des Lentivirus, das auf humane Fetttriglyceridlipase oder Perilipin fünf Gene in eine Einzelzellsuspension abzielt, gewährleistet eine effiziente und homogene Transduktion von Isletzellen und erreicht eine hocheffiziente Downregulation von Genen. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Zeit, die für die Dispergierung menschlicher Zelle in einzelne Zellen benötigt wird, durch viele Faktoren wie Größe, Verteilung und das Spendermerkmal beeinflusst wird. Daher ist es wichtig, während der Verdauung genau auf das Verschwinden menschlicher Inseln zu achten.
Während des gesamten Protokolls ist es wichtig, die Einzelzellsuspension vorsichtig zu behandeln, um Zellverlust zu vermeiden. Die entstehenden menschlichen Pseudo-Inseln können für viele Anwendungen verwendet werden, um die Wirkung der Genmodulation zu bestimmen, wie:Western Blot, histologische Studie und die Messung der Sauerstoffverbrauchsraten. Dieses Protokoll ermöglicht die Bewertung des niedrigen Zielgens bei der Regulierung der Inselgesundheit und der Funktion in menschlichen Inselchen unter Verwendung gängiger Laborwaren und einfacher Techniken.
Die Verwendung menschlicher Inselchen kann eine vorherige Genehmigung durch ein lokales Fachgremium erfordern. Bitte wenden Sie sich vor Beginn der Studie an die örtliche Überprüfungskommission. Lentivirus wird als Biosicherheitsstufe zwei eingestuft.
Kontakt zum Ausschuss für biosicherheitssicherheit vor Beginn der Verwendung des Lentivirus.
