Dieses Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte bei der Erzeugung und Optimierung effizienter sgRNA-Vektoren. Unsere Vorbeschleunigung der Kandidaten sgRNA zielt auf relative Zeit und Inferenz. Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es es ermöglicht, die DNA-Kodierungsimpressionen für jeden der sgRNAs zu analysieren, ohne endogene Gene zu bearbeiten.
Diese Vorauswahlmethode kann auch auf andere Genbearbeitungsmaßnahmen durch doppelsträngige Pausen angewendet werden. Beginnen Sie mit der Verdünnung der lyophilisierten Oligonukleotide auf eine Endkonzentration von 10 Mikromolaren in doppelt destilliertem Wasser. Mischen Sie Oligonukleotide in einem dünnwandigen PCR-Rohr im Verhältnis eins zu eins nach vorne und kehren Sie sie um, ohne einen zusätzlichen Puffer hinzuzufügen.
Inkubieren Sie die Mischung bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten, dann rampondien die Temperatur auf 72 Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie die Oligonukleotid-Mischung von der PCR-Maschine und lassen Sie sie bei Raumtemperatur abkühlen. Um den pX330-xCas9-Vektor mit Bbs1 zu verdauen, kombinieren Sie den Vektor-, Enzym- und Verdauungspuffer in einem Volumen von 50 Mikrolitern und inkubieren Sie die Reaktion bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden.
Nach der Durchführung der Zelltransformation, wählen Sie fünf bis zehn Bakterienkolonien aus der LB-Platte und verwenden Sie jede von ihnen, um einen Milliliter LB-Medien mit 60 Milligramm Ampicillin in einem 1,5 Milliliter-Rohr zu impfen. Dann die Rohre auf einem Drehschüttler für zwei bis drei Stunden inkubieren. Führen Sie PCR auf den Bildschirm für rekombinante Plasmide aus, wie im Textmanuskript beschrieben, und führen Sie die Produkte dann auf einem 2%Agarose-Gel unter 10 Volt pro Zentimeter aus.
Nachdem Sie die positiven Plasmide identifiziert haben, verwenden Sie sie zusammen mit einem Reportervektor, um eine geeignete Zelllinie mitzuverwechseln. Um die Zellen zu lysieren, entfernen Sie das Wachstumsmedium aus den kultivierten Zellen. Waschen Sie die Oberfläche des Kulturgefäßes vorsichtig mit PBS und geben Sie 100 Mikroliter PLB in jede Kultur gut aus, um die Zellmonoschicht vollständig zu bedecken.
Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur für 20 Minuten inkubieren, dann übertragen Sie das Lysat in ein Rohr oder eine Durchstechflasche für die weitere Handhabung oder Lagerung. Um den dualen Luziferase-Assay durchzuführen, programmieren Sie die Luminometer, um eine zwei Sekunden vorgelesene Verzögerung, gefolgt von einem 10-Sekunden-Messzeitraum, bereitzustellen. Geben Sie dann 100 Mikroliter Luziferase-Assay-Reagenz in die entsprechende Anzahl von Luminometer-Röhren.
20 Mikroliter Zelllysat vorsichtig in das Luminometerrohr geben und zwei- bis dreimal durch Pipettieren mischen. Legen Sie das Rohr in das Luminometer und initiieren Sie die Messung. Entfernen Sie das Probenrohr aus dem Luminometer.
100 Mikroliter Stop-Reagenz und Wirbel kurz mischen. Geben Sie die Probe auf das Luminometer zurück und initiieren Sie die Messung. Zeichnen Sie die Renilla Luciferase Aktivität auf, normalisiert auf die Firefly Luciferase Aktivität, insbesondere die Gegenseitigkeit des Verhältnisses auf dem Bildschirm angezeigt.
Entsorgen Sie das Reaktionsrohr, wenn Sie fertig sind. Diese Methode wurde verwendet, um drei sgRNA-Vektoren für Schafe DKK2 Exon 1 zu generieren. sgRNA- und xCas9-Expressionsvektoren wurden durch vorverdauendes Vektor-Rückgrat aufgebaut, gefolgt von der Ligaung in einer Reihe kurzer, doppelsträngiger DNA-Fragmente durch glühende Oligopaare.
Sieben Bakterienkolonien wurden mit einem spezifischen Primerpaar geführtPCR gescreent und die positiven Kolonien wurden nachgewiesen. Die Gen-Targeting-Kapazitäten von pX330-xCas9 T1, T2 und T3 wurden gleichzeitig mit dem dualen Luziferase-Assay nachgewiesen. Der letzte sgRNA-Vektor zeigte das höchste Nachweissignal und wurde anschließend für die Schaf-Gen-Editing-Forschung verwendet.
Nach diesem Protokoll kann ein T7EI-Assay oder ein Ribonuclease-Assay durchgeführt werden. Diese zusätzlichen Maßnahmen geben genauere Eindrücke der endogenen Genbearbeitung.
