Dieses Protokoll beschreibt ein vollständiges Reinigungsverfahren für das humane Kalziumbindungsprotein S100A12 und insbesondere für seine verschiedenen Ionen-induzierten Oligomere für nachgelagerte Forschungsimplikationen. Mit dieser Technik sind wir in der Lage, eine hohe Ausbeute an sehr reinem und Endotoxin-freiem Protein zu erhalten. Chemische Vernetzung und Trennung auf der Spalte Größenausschlusschromatographie ist eine überzeugende Methode, um homo-oligomere Proteine für weitere funktionelle Assays zu erzeugen.
Unsere Technik ermöglicht es uns, mechanistische Aspekte von S100A12 als Mustererkennungsrezeptor-Ligand und Kunstinformationen zu entwickeln, um idealerweise neue gezielte Interventionen zu entwickeln und diagnostische Assays zu verbessern. Zusätzlich zum Ansehen dieses Videos empfehlen wir ein sorgfältiges Lesen des Protokolls, da wir ein komplexes, mehrstufiges Verfahren beschreiben. Zunächst schneiden Sie einen Dialyseschlauch in eine entsprechende Länge, etwa 30 Zentimeter, mit zusätzlichem Luftraum.
Die Membran 15 bis 30 Minuten in entionisiertem Wasser einweichen, um Glycerin zu entfernen. Um die Viskosität der gelichteten Proteinlösung zu reduzieren, verdünnen Sie die Lösung mit 25 Milliliter aIEX-Puffer A.Attach den ersten Verschluss auf den Schlauch. Laden Sie die Probe in die Membran und befestigen Sie den zweiten Verschluss mindestens einen Zentimeter vom oberen Ende des Schlauches.
In einem gekühlten Raum bei vier Grad Celsius den Behälter mit AIEX-Puffer A auf eine Rührplatte legen, einen Rührstab hinzufügen und die Membran mit Proteinlösung gefüllt. Stellen Sie die Geschwindigkeit ein, um die Probe so zu drehen, dass es keine Interferenzen mit der rotierenden Rührstange gibt. Dialyze für 12 bis 24 Stunden bei vier Grad Celsius dann ersetzen Sie den Dialysepuffer mit freien vorgekühlten Puffer A und fahren Sie für mindestens vier zusätzliche Stunden fort.
Übertragen Sie die dialysierte Proteinlösung aus dem Schlauch in ein 50 Milliliter-Rohr durch eine 0,45-Mikron-Filtereinheit. Starten Sie den FPLC mit allgemeiner Wartung. Verbinden Sie die Säulenpuffer AIEX A und AIEX B mit Pufferventilen und anionenaustauscherregenden Harzen, die eine Säule enthalten, an die Säulenanschlüsse des FPLC.
Passen Sie die allgemeinen chromatographischen Parameter entsprechend an. Starten Sie das AIEX-Programm in der FPLC-Software und wählen Sie das Gleichgewichtsvolumen für Puffer A. Anschließend laden Sie die Probe auf die Säule und legen Sie die Proteine mit einem linearen Gradienten von 0% bis 100% hohem Salzpuffer ab. Sammeln Sie zwei Milliliter-Fraktionen während der Elution.
Analysieren Sie die eluierten Brüche nach Abschluss des Laufs. Laden Sie dazu 10 Mikroliter jeder Fraktion auf eine Coomassie-gefärbte 15%SDS-Seite und identifizieren Sie Brüche, die S100A12 enthalten. Diese S100A12 enthalten den Fraktionen für die Dialyse in TRIS-gepufferter Salin.
Um die Proteinreinigung nach der Proteindialyse fortzusetzen, fügen Sie der Probe ein Calciumchlorid zu einer Endkonzentration von 25 Millimolar hinzu, was die Bindung von S100A12 an das Harz im nächsten Schritt erleichtert. Filtern Sie dann die Probe durch einen Filter mit einer Gießgröße von 0,45 Mikrometern. Ausgleichs-HIC-Puffer und Proben bis zu vier Grad Celsius.
Verbinden Sie als Nächstes die Spaltenpuffer HIC A und B und die Spalte mit dem System, und passen Sie die Parameter an. Starten Sie die Methode, um die Spalte mit einem bis zwei Spaltenvolumes des Puffers HIC A auszugleichen, und laden Sie die Probe, und der nicht gebundene Probenblock mit einem UV-Signal erreicht erneut den Basiswert. Dann beginnen Sie die Elution mit einem Kalziumchelat, der Puffer EDTA enthält.
Sammeln Sie zwei Milliliter Spitzenfraktionen während der Elution. Nach der Analyse von 10 Mikrolitern jeder Fraktion auf einer Coomassie-gefärbten 15%SDS-Seite identifizieren sie reine S100A12-Fraktionen. Bündeln Sie diese Brüche und dialyze gegen HBS.
Zuerst 15 Milliliter Probe auf eine 50 Kilodalton Zentrifugalfiltereinheit laden. Zentrifuge bei 3200 mal g bei 10 Grad Celsius für ca. 10 Minuten. Übertragen Sie den filtrierten Durchfluss in ein frisches Gefäß, auf Eis.
Verwenden Sie nun einen Milliliter HBS, um die Filtermembran zu spülen und die konzentrierte Lösung in der Filterspitze zu verdünnen. Zentrifuge wieder, um so viel Protein wie möglich im Durchfluss zurückzugewinnen. Um die Lösung zu filtern, wiederholen Sie die Probenbelastung und Zentrifugation so oft wie nötig.
Um den durchfließenden S100A12 zu konzentrieren, laden Sie ihn ca. 30 Minuten lang in einen drei Kilodalton-Zentrifugalfilter und eine Zentrifuge bei 3200 mal g, 10 Grad Celsius. Nun wird das Volumen auf 1/5 bis 1/10 des ursprünglichen Ladevolumens reduziert. Übertragen Sie die konzentrierte Lösung auf eine neue Röhre.
Wiederholen Sie den Konzentrationsschritt so oft wie nötig. Nach der chemischen Vernetzung führen Sie nach dem Manuskript eine Größenausschlusschromatographie durch. Equilibrate die Spalte in HBS, laden Sie die Probe, und sammeln Sie Spitzenfraktionen von ein bis zwei Milliliter während des Laufs.
Nach der Analyse dieser Brüche auf einer SDS-Seite mit vier bis 20 % Gradienten, Pool-Fraktionen mit Hauptbändern des gewünschten Proteinkomplexes. Konzentrieren Sie dann die Lösungen wie bisher. Um Monozyten von menschlichen Buffy-Schichten durch Dichtegradientenzentrifugation zu isolieren, gleicht zuerst die Trennlösung auf Raumtemperatur aus.
20 Milliliter in 15 Milliliter Zentrifugenrohre, zwei Tuben pro Buffy-Mantel. Das Blut aus dem menschlichen Buffy-Mantel mit HBSS auf ein Gesamtvolumen von 60 Millilitern verdünnen und 30 Milliliter dieser Mischung sorgfältig auf das Trennmedium schichten. Zentrifuge bei 550 mal g für 35 Minuten bei Raumtemperatur.
Schalten Sie die Bremse der Zentrifuge aus. Nach der Zentrifugation befinden sich die mononukleären peripheren Blutkörperchen direkt auf dem Trennmedium. Mit einer Pipette diese Zellen in ein frisches 50 Milliliter Zentrifugenrohr übertragen.
Füllen Sie das Rohr mit HBSS auf 50 Milliliter und Zentrifuge bei 170 mal g für 10 Minuten. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in einem kleinen Volumen von HBSS durch Pipettieren wieder auf. Dann füllen Sie das Rohr bis zu 50 Milliliter und Zentrifuge bei 290 mal g für 10 Minuten.
Aspirieren Sie den Überstand wieder. Die Zellen in 50 MilliliterN HBSS und Zentrifuge bei 170 mal g für 10 Minuten wieder aussetzen. Den Überstand ansaugen und das Zellpellet in einem kleinen Volumen von einem Milliliter Trennpuffer wieder aufsetzen, die Zellen zählen und einer Konzentration von fünf mal 10 zu den sieben Zellen pro Milliliter Puffer hinzufügen.
Verwenden Sie für die Monozytenisolation von mononukleären peripheren Blutzellen ein magnetisches Negativzellisolationskit und folgen Sie dem Herstellerprotokoll. Verwenden Sie einen automatisierten Zellzähler, um die Monozyten zu zählen und in Monozytenmedium auf eine Konzentration von zwei mal 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter wieder aufzuhängen. Um Monozyten zu kultiieren, legen Sie eine Zellkulturschale mit einem hydrophoben Gas-permeablen Film für Suspensionszellen.
Stellen Sie die Platten für die Sterilisation ca. 30 Minuten unter UV-Licht. 15 bis 25 Milliliter der Zellsuspension auf diese Kulturplatten übertragen und über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid ruhen lassen. Nach der Vorreinigung der AIEX-Säule und der anschließenden kalziumabhängigen HIC wurde hochreines Protein gewonnen.
Als zusätzliche Kontrolle wurden menschliche Monozyten mit LPS stimuliert und produzierten Wildprotein. Die Proteinexposition gegenüber verschiedenen Ionen führt zur Anordnung verschiedener S100A12-Oligomere. Steigende Zinkkonzentrationen induzieren die Anordnung von S100A12 in Tetramere und Hexamer bei Trennung auf vier bis 20%Coomassie gebeizt SDS-Seite.
Wenn ein Überschuss an Ionen vor der Vernetzung angewendet wurde, induzierte es eine ausgeprägte Verschiebung des Oligomergleichgewichts. S100A12 wurde in Gegenwart von 25 Millimolar Calcium oder 25 Millimolar Calcium und einem Millimolar Zink vernetzt. Nach Der Vernetzung im HBS-Puffer mit 25 Millimolaren Calciumchlorid und einem Millimolaren Zinkchlorid wurden Hexamer und Tetramer getrennt.
Tetramer und Dimer wurden im HBS-Puffer mit 25 Millimolar Calciumchlorid getrennt. Ein Beispiel für gepoolte und konzentrierte Oligomere nach der Trennung auf einer Coomassie-gefärbten SDS-Seite mit 15% Gradient zeigt Dimer, Tetramer und Hexamer. Die Monozytenstimulation mit hexamerischem S100A12 führte zu einer ausgeprägten TNF-Alpha-Freisetzung.
Nach der Entfernung von Endotoxin ist es wichtig, bei der anschließenden Erzeugung und Reinigung der Oligomere keine Kontamination in die Proben einzuleiten. Eine nachgelagerte Analyse eines Prozesses, der sich auf die S100A12-Oligomerisierung bezieht, ist denkbar. Ebenso können Aminosäuren und Ionenbedingungen analysiert werden, die den Oligomerisierungsprozess selbst beeinflussen.
Wir verwenden derzeit S100A12-Oligomere, die gemäß dem beschriebenen Protokoll getrennt sind, um spezifische Peptidligaden und Antikörper zu entwickeln, um die Signalisierung des Proteins durch TLF4 zu blockieren und diagnostische Assays zu entwickeln und zu verbessern.
