このプロトコルは、ヒトカルシウム結合タンパク質S100A12の完全な精製手順を説明し、特に、下流の研究への影響に対する異なるイオン誘発オリゴマーです。この技術により、非常に純粋で、内毒素を含まないタンパク質の高い収率を維持することができます。サイズ排除クロマトグラフィーカラム上の化学的架橋および分離は、さらなる機能アッセイ用ホモオリゴマータンパク質を生成する説得力のある方法である。
この技術により、S100A12のパターン認識受容体リガンドやアート情報としての機械化的側面が可能になり、新たな標的介入を理想的に開発し、診断アッセイを改善することができます。このビデオを見る以外に、複雑な複数ステップの手順を説明しているので、プロトコルを注意深く読むことをお勧めします。まず、透析管を適切な長さ約30センチメートルにカットし、空気のためのスペースを追加します。
膜を脱イオン水に15~30分間浸し、グリセロールを除去します。クリアしたタンパク質溶液の粘度を下げるには、25ミリリットルのAIEXバッファーAで溶液を希釈し、最初のクロージャーをチューブに取り付けます。サンプルを膜に積み込み、チューブの上端から少なくとも1センチメートルの第2の閉鎖を取り付けます。
冷却された部屋に摂氏4度で、AIEXバッファーAの容器を攪拌板の上に置き、攪拌棒を加え、タンパク質溶液で満たされた膜を加えます。回転するひきかき混じり棒に干渉がないように、サンプルを回転させる速度を調整します。4°Cで12〜24時間透析し、透析バッファーをフリーの事前冷却バッファAに置き換え、少なくとも4時間続けます。
チューブから0.45ミクロンのフィルターユニットを介して50ミリリットルチューブに透析タンパク質溶液を移します。一般的なメンテナンスで FPLC を起動します。列バッファー AIEX A および AIEX B をバッファーバルブに接続し、列を含むアニオン交換樹脂を FPLC のカラム ポートに接続します。
それに応じて、一般的なクロマトグラフィーパラメータを調整します。FPLC ソフトウェアで AIEX プログラムを起動し、バッファー A の平衡容積を選択します。溶出中に2ミリリットル分を集める。
実行を終了した後、溶出した分数を分析します。このために、15%SDSのページを染色したクーマシーの各画分の10マイクロリットルをロードし、S100A12を含む画分を識別します。透析用の分数を含むこれらのS100A12をTRISバッファ状の生理液にプールします。
タンパク質精製を継続するには、タンパク質透析後、サンプルに塩化カルシウムを25ミリモルの最終濃度に添加し、次のステップでS100A12の樹脂への結合を容易にする。次に、0.45ミクロンの注ぎ量のフィルターを通してサンプルをフィルターします。HICバッファーとサンプルを摂氏4度に平衡化します。
次に、列バッファー HIC A と B と列をシステムに接続し、パラメーターを調整します。バッファー HIC A の 1 ~ 2 列のボリュームで列を平衡化するメソッドを開始し、サンプルをロードし、UV 信号を使用して非バインドサンプル ブロックを UV 信号で洗浄がベースライン レベルに達します。次に、バッファーEDTAを含むカルシウムキレートで溶出を開始する。
溶出中に2ミリリットルのピーク画分を収集します。15%SDSのページに染色されたクーマシーの各画分の10マイクロリットルを分析した後、純粋なS100A12画分を識別します。これらの分数をプールし、HBSに対して透析します。
まず、15ミリリットルのサンプルを50キロダルトン遠心フィルターユニットに積み込みます。摂氏10度で約10分間3200倍の遠心分離機。濾過されたフロースルーを氷の上の新鮮な容器に移します。
さて、フィルター膜をすすぐと、フィルター先端に濃縮された溶液の希釈のためにHBSの1ミリリットルを使用してください。再び遠心分離機は、フロースルーでできるだけ多くのタンパク質を回収する。溶液をフィルタリングするには、サンプルの負荷と遠心分離を必要な回数繰り返します。
次に、フロースルーを含むS100A12を濃縮し、3キロダルトン遠心フィルターと遠心分離機に3200倍g、摂氏10度で約30分間積み込みます。これで、ボリュームは初期読み込みボリュームの 1/10 まで 1/5 に減少します。濃縮溶液を新しいチューブに移します。
必要に応じて、濃度ステップを繰り返します。化学架橋後、原稿に従って、サイズ排除クロマトグラフィーを行う。HBSでカラムを平衡化し、サンプルをロードし、走行中に1〜2ミリリットルのピーク分率を収集します。
これらの画分を4〜20%の勾配SDSページで分析した後、目的のタンパク質複合体の主要バンドと画分をプールする。次に、前に行ったソリューションを集中します。密度勾配遠心分離によりヒトバフィーコートから単球を分離するために、まず分離溶液を室温に平衡化する。
20ミリリットルを15ミリリットルの遠心分離チューブに移し、1つのバフィーコートにつき2本のチューブを入れ替えます。HBSSでヒトのバフィーコートから血液を60ミリリットルの総体積に希釈し、この混合物の30ミリリットルを分離媒体の上に慎重に塗布します。室温で35分間550回gで遠心分離機。
遠心分離機のブレーキを切ります。遠心分離後、単核末梢血細胞は分離培地の上に直接配置される。ピペットを使用して、これらの細胞を新鮮な50ミリリットルの遠心分離管に移します。
チューブに50ミリリットル、遠心分離機を170倍の10分間充填します。上清を吸引し、ピペット処理により少量のHBSSで細胞ペレットを再懸濁する。その後、チューブを最大50ミリリットル、遠心分離機を290倍gで10分間充填します。
再び上清を吸引する。HBSSと遠心分離機の50ミリリットルで細胞を10分間170倍に再懸濁します。上清を吸引し、細胞ペレットを1ミリリットルの分離バッファーの少量で再懸濁し、細胞を数え、1ミリリットル当たり7個の細胞に5倍の10の濃度にバッファーを加える。
単核末梢血細胞からの単球分離のためには、磁気陰性細胞分離キットを使用し、製造業者の議定書に従ってください。自動化された細胞カウンターを使用して単球をカウントし、1ミリリットル当たり6細胞に対して2倍の濃度に単球培地で再懸濁する。単球を培養するために、懸濁細胞に適した疎水性ガス透過性フィルムを用いた細胞培養皿をレイアウトする。
プレートをUV光下に約30分間置き、滅菌します。これらの培養プレートに細胞懸濁液の15〜25ミリリットルを移し、摂氏37度と5%の二酸化炭素で一晩休ませます。AIEXカラム及びそれに続くカルシウム依存性HICに対する予精製後、高純度タンパク質が得られた。
さらなるコントロールとして、ヒト単球をLPSで刺激し、野生型タンパク質を産生した。異なるイオンへのタンパク質暴露は異なるS100A12オリゴマーの配置で生じる。亜鉛濃度を上げると、4~20%のクーマシー染色SDSページで分離した際に、S100A12を四量体とヘキサマーに配置することが必要になります。
過剰なイオンを架橋前に適用すると、オリゴマー平衡の顕著なシフトを誘導した。S100A12は、25ミリモルカルシウムまたは25ミリモルカルシウムおよび1ミリモル亜鉛の存在下で架橋された。25ミリモル塩化カルシウムと塩化亜鉛1ミリモルとHBS緩衝液中で架橋した後、六重体と四量体を分離した。
四量体と二量体を、25ミリモルクロライドでHBS緩衝液中で分離した。クーマシー染色した後にプール及び濃縮オリゴマーの一例は、4〜15%の勾配SDSのページに染色され、二量体、四量体、およびヘキサマーを示す。六方体S100A12による単球刺激は顕著なTNFα放出をもたらした。
内毒素除去後、オリゴマーの後の発生および精製中にサンプルに汚染を再導入しないことが重要である。S100A12オリゴマー化に関する任意のプロセスの下流分析が考えられる。同様に、オリゴマー化プロセス自体に影響を与えるアミノ酸およびイオン条件を分析することができる。
現在、記載されているプロトコルに従って分離されたS100A12オリゴマーを使用して、特定のペプチドリガンドと抗体を開発して、TLF4を介してタンパク質のシグナル伝達を遮断し、診断アッセイを開発および改善しています。
