이 프로토콜은 인간 칼슘 결합 단백질, S100A12에 대한 완전한 정화 절차를 설명하고, 특히 다운스트림 연구 의미에 대한 상이온 유도 올리고머의 상이한 이온 유도 올리고머입니다. 이 기술을 통해, 우리는 매우 순수하고 내독신이없는 단백질의 높은 수율을 유지할 수 있습니다. 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 대한 화학적 교차 연결 및 분리는 추가 기능적 분석을 위해 호모-올리고메릭 단백질을 생성하는 설득력 있는 방법입니다.
우리의 기술은 우리가 이상적으로 새로운 표적 내정간섭을 개발하고 진단 적인 연구력을 향상시키기 위하여 패턴 인식 수용체 리간드 및 예술 정보로 S100A12의 기계적인 양상을 허용합니다. 이 비디오를 보는 것 외에도 복잡한 다단계 절차를 설명하기 때문에 프로토콜을 주의 깊게 읽는 것이 좋습니다. 우선 투석 튜브를 약 30cm 의 적절한 길이로 자르고 공기를 위한 추가 공간을 확보하십시오.
글리세롤을 제거하기 위해 15-30 분 동안 탈이온 물에 멤브레인을 담급니다. 클리어된 단백질 용액의 점도를 줄이기 위해 AIEX 버퍼 A.Attach의 25 밀리리터로 용액을 희석하여 튜브에 첫 번째 클로저를 부착합니다. 샘플을 멤브레인에 적재하고 튜브의 상단 끝에서 적어도 1센티미터 떨어진 두 번째 클로저에 부착합니다.
섭씨 4도의 냉각실에 AIEX 버퍼 A를 넣고 저어줄과 단백질 용액으로 채워진 멤브레인을 넣습니다. 회전하는 교반 바에 간섭이 없도록 속도를 조정하여 시료를 회전시킵니다. 섭씨 4도에서 12~24시간 동안 투석한 버퍼를 무료 미리 냉각된 버퍼 A로 교체하고 최소 4시간 동안 계속합니다.
투석 단백질 용액을 튜브에서 50 밀리리터 튜브로 0.45 미크론 필터 장치를 통해 전달합니다. 일반적인 유지 보수로 FPLC를 시작합니다. 열 버퍼A와 AIEX B를 FPLC의 열 포트에 열을 포함하는 밸브 및 음이온 교환 수지에 연결합니다.
그에 따라 일반적인 크로마토그래피 매개 변수를 조정합니다. FPLC 소프트웨어에서 AIEX 프로그램을 시작하고 버퍼 A.Subsequently에 대한 평형 볼륨을 선택하고, 샘플을 컬럼에 로드하고 0%에서 100% 높은 염분 버퍼로 선형 그라데이션으로 단백질을 엘테우한다. 용출 중에 밀리리터 분수 2개를 수집합니다.
실행을 완료한 후 용출된 분수를 분석합니다. 이를 위해 15%SDS 페이지에 각 분수의 마이크로리터 10개를 적재하고 S100A12를 포함하는 분획을 식별합니다. 투석용 분획을 포함하는 이러한 S100A12를 TRIS 버퍼식식라인으로 풀링합니다.
단백질 정화를 계속하기 위해, 단백질 투석 후, 다음 단계에서 수지에 S100A12의 결합을 용이하게 할 것이다 25 밀리몰라의 최종 농도에 샘플에 염화 칼슘을 추가합니다. 그런 다음 0.45 미크론의 붓는 크기로 필터를 통해 샘플을 필터링합니다. HIC 버퍼와 샘플을 섭씨 4도까지 상화합니다.
다음으로 열 버퍼HIC A와 B와 열을 시스템에 연결하고 매개 변수를 조정합니다. 버퍼 HIC A의 1~2개의 열 볼륨으로 컬럼을 상화하고 UV 신호로 시료를 로드하고 UV 신호가 기준선 수준에 다시 도달하는 방법을 시작합니다. 그런 다음 완충제 EDTA를 함유한 칼슘 첼라토르로 용출을 시작합니다.
용출 시 피크 분수 2밀리리터를 수집합니다. 쿠마시에서 각 분수의 10 마이크로리터를 분석한 후 15% SDS 페이지에 스테인드되어 순수 S100A12 분획을 식별합니다. 이러한 분획을 풀과 HBS에 대한 투석.
첫째, 50킬로달톤 원심 필터 장치에 15밀리리터의 시료를 적재합니다. 원심분리기는 섭씨 10도에서 3200배 g로 약 10분간. 얼음에, 신선한 선박에 여과 된 흐름을 전송합니다.
이제 HBS의 1밀리리터를 사용하여 필터 멤브레인을 헹구고 필터 팁에서 농축 된 용액의 희석을 하십시오. 원심분리기는 다시 유동에서 가능한 한 많은 단백질을 회복합니다. 솔루션을 필터링하려면 필요한 경우 시료 적재 및 원심 분리를 자주 반복합니다.
다음으로, 플로우를 포함하는 S100A12를 농축하기 위해 3킬로달톤 원심 필터와 원심분리기를 3200g, 섭씨 10도에서 약 30분간 적재한다. 이제 볼륨이 초기 로딩 볼륨의 1/5에서 1/10까지 감소합니다. 농축 솔루션을 새로운 튜브로 전송합니다.
필요한 경우 농도 단계를 자주 반복합니다. 화학 적 교차 연결 후, 원고에 따르면, 크기 배제 크로마토그래피를 수행. HBS의 컬럼을 상화하고, 샘플을 로드하고, 실행 중에 1~2밀리리터의 피크 분수를 수집합니다.
4 ~20% 그라데이션 SDS 페이지에서 이러한 분획을 분석한 후 원하는 단백질 복합체의 주요 대역으로 풀 분획을 제공합니다. 그런 다음 이전에 수행된 대로 솔루션을 집중합니다. 밀도 그라데이션 원심분리에 의해 인간의 버피 코트로부터 단핵구를 분리하려면 먼저 분리 용액을 실온에 상량화합니다.
20 밀리리터를 15밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고, 버피 코트당 2개의 튜브를 전달합니다. HBSS로 인간의 버피 코트에서 혈액을 희석하여 총 60 밀리리터로 희석하고 분리 매체 위에 이 혼합물의 30 밀리리터층을 조심스럽게 층으로 희석시다. 원심분리기는 실온에서 35분 동안 550배 g로 원심분리기.
원심분리기의 브레이크를 끕시합니다. 원심분리 후, 단핵 말초 혈액세포는 분리 배지 의 바로 위에 위치한다. 파이펫을 사용하면 이 세포를 50밀리리터 원심분리기 튜브로 이송합니다.
튜브를 HBSS로 50밀리리터와 원심분리기를 10분 동안 170배 g로 채웁니다. 피펫팅에 의해 소량의 HBSS에서 슈퍼나티를 흡인하고 셀 펠릿을 재연합니다. 그런 다음 튜브를 최대 50 밀리리터와 원심분리기를 290배g에서 10분간 채웁니다.
슈퍼상을 다시 흡인합니다. HBSS와 원심분리기의 50 밀리리터에서 10분 동안 170배 g로 세포를 재중단합니다. 상류체를 흡인하고 분리 버퍼의 1 밀리리터의 작은 부피로 세포 펠릿을 재보페, 세포를 계산하고, 밀리리터 당 7개의 세포에 5배 10의 농도에 버퍼를 추가한다.
단핵 말초 혈액 세포에서 단핵 절연을 위해 자기 음성 세포 격리 키트를 사용하고 제조업체의 프로토콜을 따릅니다. 자동화된 세포 카운터를 사용하여 단핵구를 계산하고 단핵 매체에서 밀리리터당 6개의 세포에 2배 10의 농도로 재연한다. 모노사이클을 배양하려면 현탁세포에 적합한 소수성 가스 투과성 필름을 사용하여 세포 배양 접시를 배치한다.
플레이트를 UV 광 아래에 약 30분간 배치하여 살균합니다. 이 배양 판에 세포 현탁액의 15 에서 25 밀리리터를 전송하고 37 섭씨 및 5 %의 이산화탄소에서 하룻밤 휴식을 취하십시오. AIEX 컬럼과 후속 칼슘 의존 HIC에 대한 사전 정제에 이어, 고순수 단백질을 얻었다.
추가 대조군으로서 인간의 단핵구는 LPS로 자극되어 야생 형 단백질을 생산했습니다. 다른 이온에 단백질 노출은 다른 S100A12 올리고머의 배열을 초래한다. 아연 농도가 증가하면 4~20%의 Coomassie 염색 SDS 페이지에서 분리시 S100A12의 배열을 테트라머와 hexamers로 유도합니다.
교차 연결 전에 과도한 이온이 적용되었을 때, 올리고머 평형의 뚜렷한 변화를 유도했다. S100A12는 25밀리몰라 칼슘 또는 25 밀리몰라 칼슘과 1밀리몰라 아연의 존재속에서 교차 연결되었다. HBS 버퍼에서 25밀리머 칼슘 염화물 및 1 밀리머 아연 염화물, hexamer 및 테트라머를 교차 연결한 후 분리되었습니다.
테트라머와 이머는 25 밀리몰라 칼슘 염화칼슘으로 HBS 완충제에서 분리되었다. 4~15%의 그라데이션 SDS 페이지에 스테인드된 쿠마시에 분리된 후 풀링및 농축 된 올리고머의 예로 는 디머, 테트라머 및 hexamer를 보여줍니다. hexameric S100A12와 단세포 자극은 발음 TNF 알파 릴리스 결과.
내독신을 제거한 후, 후속 생성 및 올리고머의 정제 시 시료에 오염을 재도입하지 않는 것이 중요하다. S100A12 올리고머화와 관련된 모든 공정의 다운스트림 분석은 생각할 수 있습니다. 유사하게, 올리고머화 공정 자체에 영향을 미치는 아미노산 및 이온 조건을 분석할 수 있다.
현재 TLF4를 통해 단백질의 신호를 차단하고 진단 분석량을 개발하고 개선하기 위해 특정 펩타이드 리간드 및 항체를 개발하기 위해 기술된 프로토콜에 따라 분리된 S100A12 올리고머를 사용하고 있습니다.
