Este protocolo describe un procedimiento de purificación completo para la proteína de unión al calcio humano, S100A12, y en particular, para sus diferentes oligómeros inducidos por iones para implicaciones de investigación posteriores. Con esta técnica, somos capaces de mantener un alto rendimiento de proteínas muy puras y libres de endotoxinas. La reticulación química y la separación en la columna de cromatografía de exclusión de tamaño es un método convincente para generar proteínas homo-oligoméricas para otros ensayos funcionales.
Nuestra técnica nos permite los aspectos mecanicistas de S100A12 como ligando del receptor de reconocimiento de patrones e información de arte para desarrollar idealmente nuevas intervenciones dirigidas y mejorar los ensayos diagnósticos. Además de ver este vídeo, recomendamos una lectura cuidadosa del protocolo, ya que describimos un procedimiento complejo de varios pasos. Para comenzar, corte un tubo de diálisis en una longitud adecuada, alrededor de 30 centímetros, con espacio adicional para el aire.
Sumerja la membrana en agua desionizada durante 15 a 30 minutos para eliminar el glicerol. Para reducir la viscosidad de la solución proteica despejada, diluya la solución con 25 mililitros de Tampón A.Adjunte el primer cierre en el tubo. Cargue la muestra en la membrana y conecte el segundo cierre al menos un centímetro del extremo superior del tubo.
En una habitación enfriada a cuatro grados centígrados, coloque el recipiente con Tampón A DEIEX en una placa de agitación, agregue una barra de agitación y la membrana llena de solución proteica. Ajuste la velocidad para girar la muestra de modo que no haya interferencias con la barra de agitación giratoria. Dialyze durante 12 a 24 horas a cuatro grados Centígrados luego reemplace el búfer dializado por el búfer A libre y continúe durante al menos cuatro horas adicionales.
Transfiera la solución de proteína dializada del tubo a un tubo de 50 mililitros a través de una unidad de filtro de 0,45 micras. Inicie el FPLC con mantenimiento general. Conecte los búferes de columna AIEX A y AIEX B a las válvulas de almacenamiento intermedio y a la resina de intercambio de aniones que contiene la columna a los puertos de columna del FPLC.
Ajuste los parámetros cromatográficos generales en consecuencia. Inicie el programa AIEX en el software FPLC y elija el volumen de equilibrio para el búfer A.Posteriormente, cargue la muestra en la columna y elula las proteínas con un gradiente lineal de 0%a 100% de alto tampón de sal. Recoger dos fracciones de mililitro durante la elución.
Analice las fracciones eluidas después de finalizar la carrera. Para ello, cargue 10 microlitros de cada fracción en una página de Coomassie manchada 15%SDS e identifique fracciones que contengan S100A12. A la vez, a la venta de estas fracciones que contienen S100A12 para diálisis en solución salina con búfer TRIS.
Para continuar la purificación de proteínas, después de la diálisis proteica, añadir un cloruro de calcio a la muestra a una concentración final de 25 milimolares, lo que facilitará la unión de S100A12 a la resina en el siguiente paso. A continuación, filtre la muestra a través de un filtro con un tamaño de vertido de 0,45 micras. Equilibrar los tampones HIC y las muestras a cuatro grados centígrados.
A continuación, conecte los búferes de columna HIC A y B y la columna al sistema y ajuste los parámetros. Inicie el método para equilibrar la columna con volúmenes de una a dos columnas de búfer HIC A y cargue la muestra y el bloque de muestra sin enlazar de lavado con una señal UV alcance de nuevo el nivel de línea de base. A continuación, comience la elución con un quelante de calcio que contenga tampón EDTA.
Recoger dos mililitros de fracciones pico durante la elución. Después de analizar 10 microlitros de cada fracción en una página de Coomassie manchada 15%SDS identificar fracciones S100A12 puras. Agrupa estas fracciones y dialyze contra HBS.
En primer lugar, cargue 15 mililitros de muestra en una unidad de filtro centrífugo de 50 kilodalton. Centrifugar a 3200 veces g a 10 grados Celsius durante aproximadamente 10 minutos. Transfiera el flujo filtrado a través de un recipiente fresco, sobre hielo.
Ahora, utilice un mililitro de HBS para enjuagar la membrana del filtro y para la dilución de la solución concentrada en la punta del filtro. Centrifugar de nuevo para recuperar tanta proteína como sea posible en el flujo a través. Para filtrar la solución, repita la carga y centrifugación de la muestra tantas veces como sea necesario.
A continuación, para concentrar el S100A12 que contiene flujo a través, cárguelo en un filtro centrífugo de tres kilodalton y centrífuga a 3200 veces g, 10 grados Celsius durante aproximadamente 30 minutos. Ahora el volumen se reduce a 1/5 hasta 1/10 del volumen de carga inicial. Transfiera la solución concentrada a un tubo nuevo.
Repita el paso de concentración tantas veces como sea necesario. Después de la reticulación química, según el manuscrito, realizar cromatografía de exclusión de tamaño. Equilibre la columna en HBS, cargue la muestra y recoja fracciones máximas de uno a dos mililitros durante la ejecución.
Después de analizar estas fracciones en una página SDS de cuatro a 20%gradiente, las fracciones de grupo con bandas principales del complejo proteico deseado. A continuación, concentre las soluciones como se hizo anteriormente. Para aislar los monocitos de las capas de puly humana por centrifugación de gradiente de densidad, primero equilibre la solución de separación a temperatura ambiente.
Transfiera 20 mililitros en tubos centrífugos de 15 mililitros, dos tubos por capa de buffy. Diluir la sangre de la capa de buffy humana con HBSS a un volumen total de 60 mililitros y capa 30 mililitros de esta mezcla cuidadosamente en la parte superior del medio de separación. Centrifugar a 550 veces g durante 35 minutos a temperatura ambiente.
Apague el freno de la centrífuga. Después de la centrifugación, las células sanguíneas periféricas mononucleares se encuentran directamente en la parte superior del medio de separación. Con una pipeta, transfiera estas células a un tubo de centrífuga fresco de 50 mililitros.
Llene el tubo con HBSS a 50 mililitros y centrifugar a 170 veces g durante 10 minutos. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en un pequeño volumen de HBSS por pipeteo. A continuación, llene el tubo hasta 50 mililitros y centrifuga a 290 veces g durante 10 minutos.
Aspirar el sobrenadante de nuevo. Resuspender las células en 50 mililitros de HBSS y centrífuga a 170 veces g durante 10 minutos. Aspirar el sobrenadante y resuspender el gránulo celular en un pequeño volumen de un mililitro de tampón de separación, contar las células y agregar buffer a una concentración de cinco veces 10 a las siete células por mililitro.
Para el aislamiento de monocitos de las células sanguíneas periféricas mononucleares, utilice un kit de aislamiento magnético negativo de células y siga el protocolo del fabricante. Utilice un contador de células automatizado para contar los monocitos y resuspend en el medio de monocitos a una concentración de dos veces 10 a las seis células por mililitro. Para cultivar monocitos, establecer un plato de cultivo celular con una película permeable al gas hidrófobo adecuado para las células de suspensión.
Coloque las placas debajo de la luz UV durante aproximadamente 30 minutos para la esterilización. Transfiera de 15 a 25 mililitros de la suspensión celular a estas placas de cultivo y déjelos reposar durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Tras la pre-purificación en la columna AIEX y el posterior HIC dependiente del calcio, se obtuvo proteína altamente pura.
Como control adicional, los monocitos humanos fueron estimulados con LPS y produjeron proteínas de tipo silvestre. La exposición proteica a diferentes iones da como resultado la disposición de diferentes oligómeros S100A12. El aumento de las concentraciones de zinc induce la disposición de S100A12 en tetrámeros y hexámeros tras la separación en la página de SDS teñida de cuatro a 20%Coomassie.
Cuando se aplicó un exceso de iones antes de la reticulación, indujo un cambio pronunciado del equilibrio del oligómero. S100A12 se retició en presencia de 25 mililitros de calcio o 25 milimolares de calcio y un zinc milimolar. Después de la reticulación en tampón HBS con cloruro de calcio 25 milimolar y un cloruro de zinc milimolar, se separaron hexámeros y tetrámeros.
El tetrámero y el dimer se separaron en tampón HBS con cloruro de calcio de 25 milimolares. Un ejemplo de oligómeros agrupados y concentrados después de la separación en una página SDS de cuatro a 15% de gradiente de Coomassie muestra dimer, tetrámero y hexámero. La estimulación monocito con S100A12 hexamérico dio como resultado una liberación alfa TNF pronunciada.
Después de la eliminación de la endotoxina, es importante no reintroducir la contaminación en las muestras durante la posterior generación y purificación de los oligómeros. El análisis descendente de cualquier proceso relacionado con la oligomerización S100A12 es concebible. Del mismo modo, se pueden analizar aminoácidos y condiciones iónicas que afectan al propio proceso de oligomerización.
Actualmente estamos usando oligómeros S100A12 separados según el protocolo descrito para desarrollar ligandos de péptidos específicos y anticuerpos para bloquear la señalización de la proteína a través de TLF4 y para desarrollar y mejorar los ensayos de diagnóstico.
