Este protocolo descreve um procedimento completo de purificação para a proteína de ligação de cálcio humano, S100A12, e em particular, pois são diferentes oligômeros induzidos por íons para implicações de pesquisa a jusante. Com esta técnica, somos capazes de manter o alto rendimento de proteína muito pura e livre de endotoxinas. Ligação e separação química na coluna de cromatografia de exclusão de tamanho é um método convincente para gerar proteínas homo-oligomericas para outros ensaios funcionais.
Nossa técnica nos permite aspectos mecanicistas do S100A12 como ligante receptor de reconhecimento de padrões e informações de arte para desenvolver idealmente novas intervenções direcionadas e melhorar os ensaios diagnósticos. Além de assistir a este vídeo, recomendamos uma leitura cuidadosa do protocolo, pois descrevemos um procedimento complexo e multi-passos. Para começar, corte uma tubulação de diálise em um comprimento apropriado, em torno de 30 centímetros, com espaço adicional para o ar.
Mergulhe a membrana em água deionizada por 15 a 30 minutos para remover glicerol. Para reduzir a viscosidade da solução de proteínas desmatadas, diluir a solução com 25 mililitros de tampão AIEX A.Conecte o primeiro fechamento na tubulação. Carregue a amostra na membrana e conecte o segundo fechamento a pelo menos um centímetro da extremidade superior da tubulação.
Em uma sala resfriada a quatro graus Celsius, coloque o recipiente com tampão AIEX A em uma placa de mexida, adicione uma barra de meximento e a membrana cheia de solução proteica. Ajuste a velocidade para girar a amostra para que não haja interferência na barra de agitação rotativa. Dialise por 12 a 24 horas a quatro graus Celsius, em seguida, substitua o buffer dialisado por buffer pré-resfriado gratuito A e continue por pelo menos quatro horas adicionais.
Transfira a solução de proteína dialisada da tubulação para um tubo de 50 mililitros através de uma unidade de filtro de 0,45 míclica. Inicie o FPLC com manutenção geral. Conecte os buffers de coluna AIEX A e AIEX B às válvulas tampão e a resina de troca de ânion contendo coluna para as portas da coluna do FPLC.
Ajuste os parâmetros cromatográficos gerais em conformidade. Inicie o programa AIEX no software FPLC e escolha o volume de equilíbrio para buffer A.Posteriormente, carregue a amostra na coluna e elute as proteínas com um gradiente linear de tampão de sal de 0% a 100% de altura. Colete duas frações mililitros durante a eluição.
Analise as frações elucidadas após o término da corrida. Para isso, carregue 10 microlitadores de cada fração em uma página de Coomassie manchada de 15% SDS e identifique frações contendo S100A12. Acumule estes S100A12 contendo frações para diálise em soro fisiológico com tampol atrofes.
Para continuar a purificação da proteína, após a diálise proteica, adicione um cloreto de cálcio à amostra a uma concentração final de 25 mililitros, o que facilitará a ligação de S100A12 à resina na próxima etapa. Em seguida, filtre a amostra através de um filtro com um tamanho de derramamento de 0,45 mícrons. Equilibre os buffers e amostras de HIC a quatro graus Celsius.
Em seguida, conecte os buffers de coluna HIC A e B e a coluna ao sistema e ajuste os parâmetros. Inicie o método para equilibrar a coluna com um a dois volumes de coluna de HIC A tampão e carregue a amostra e o bloco de amostra desvinculado da lavagem com um sinal UV atinge novamente o nível da linha de base. Em seguida, inicie a elução com um quedor de cálcio contendo EDTA tampão.
Colete dois mililitros de frações de pico durante a eluição. Depois de analisar 10 microliters de cada fração em uma página de Coomassie manchada de 15% SDS identificar frações puras de S100A12. Acumule essas frações e diálise contra HBS.
Primeiro, carregue 15 mililitros de amostra em uma unidade de filtro centrífugo de 50 kilodalton. Centrifugar a 3200 vezes g a 10 graus Celsius por aproximadamente 10 minutos. Transfira o fluxo filtrado para um novo vaso, no gelo.
Agora, use um mililitro de HBS para enxaguar a membrana do filtro e para diluição da solução concentrada na ponta do filtro. Centrifugar novamente para recuperar o máximo de proteína possível no fluxo. Para filtrar a solução, repita o carregamento da amostra e a centrifugação quantas vezes for necessário.
Em seguida, para concentrar o S100A12 contendo fluxo através, carregue-o em um filtro centrífugo de três quilodalton e centrífuga a 3200 vezes g, 10 graus Celsius por aproximadamente 30 minutos. Agora, o volume é reduzido para 1/5 até 1/10 do volume inicial de carregamento. Transfira a solução concentrada para um novo tubo.
Repita o passo de concentração quantas vezes for necessário. Após a ligação química, de acordo com o manuscrito, realize cromatografia de exclusão de tamanho. Equilibre a coluna no HBS, carregue a amostra e colete frações de pico de um a dois mililitros durante a execução.
Depois de analisar essas frações em uma página SDS de quatro a 20%, acumule frações com as principais bandas do complexo proteico desejado. Em seguida, concentre as soluções como feito anteriormente. Para isolar monócitos de casacos de buffy humanos por centrifugação gradiente de densidade, primeiro equilibre a solução de separação à temperatura ambiente.
Transfira 20 mililitros em tubos de centrífugas de 15 mililitros, dois tubos por casaco de buffy. Diluir o sangue do casaco de buffy humano com HBSS para um volume total de 60 mililitros e camada 30 mililitros desta mistura cuidadosamente em cima do meio de separação. Centrifugar a 550 vezes g por 35 minutos em temperatura ambiente.
Desligue o freio da centrífuga. Após a centrifugação, as células sanguíneas periféricas mononucleares estão localizadas diretamente em cima do meio de separação. Com uma pipeta, transfira essas células para um tubo de centrífuga fresco de 50 mililitros.
Encha o tubo com HBSS a 50 mililitros e centrífuga a 170 vezes g por 10 minutos. Aspire o supernatante e resuspenque a pelota de célula em um pequeno volume de HBSS por pipetação. Em seguida, encha o tubo até 50 mililitros e centrífuga a 290 vezes g por 10 minutos.
Aspire o supernasso novamente. Resuspengue as células em 50 mililitros de HBSS e centrífuga a 170 vezes g por 10 minutos. Aspire o supernasciente e resuspenque a pelota celular em um pequeno volume de um mililitro de tampão de separação, conte as células e adicione tampão a uma concentração de cinco vezes 10 às sete células por mililitro.
Para o isolamento monócito das células sanguíneas periféricas mononucleares, use um kit de isolamento celular negativo magnético e siga o protocolo do fabricante. Use um contador celular automatizado para contar os monócitos e resuspend em meio monócito para uma concentração de duas vezes 10 às seis células por mililitro. Para cultivar monócitos, coloque um prato de cultura celular com um filme permeável de gás hidrofóbico adequado para células suspensas.
Coloque as placas sob luz UV por aproximadamente 30 minutos para esterilização. Transfira de 15 a 25 mililitros da suspensão celular para essas placas de cultura e deixe-os descansar durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após a pré-purificação na coluna AIEX e subsequente HIC dependente de cálcio, obteve-se proteína altamente pura.
Como controle adicional, os monócitos humanos foram estimulados com LPS e produziram proteína silvestre. A exposição proteica a diferentes íons resulta em arranjo de diferentes oligômeros S100A12. O aumento das concentrações de zinco induz o arranjo de S100A12 em tetramers e hexamers após a separação na página SDS manchada de quatro a 20% Coomassie.
Quando um excesso de íons foi aplicado antes da ligação cruzada, induziu uma mudança pronunciada do equilíbrio oligômero. O S100A12 foi cruzado na presença de 25 milimônios de cálcio ou 25 mililitros de cálcio e um mililitro de zinco. Após a ligação cruzada no tampão HBS com cloreto de cálcio de 25 milimilas e um cloreto de zinco milimila, hexamer e tetramer foram separados.
Tetramer e dimer foram separados em tampão HBS com cloreto de cálcio de 25 milialares. Um exemplo de oligômeros agrupados e concentrados após a separação em uma página de SDS de quatro a 15% de gradiente mostra dimer, tetramer e hexamer. A estimulação monócito com hexameric S100A12 resultou em liberação alfa TNF pronunciada.
Após a remoção da endotoxina, é importante não reintroduzir a contaminação nas amostras durante a posterior geração e purificação dos oligômeros. A análise a jusante de qualquer processo relacionado à oligomerização S100A12 é concebível. Da mesma forma, podem ser analisados aminoácidos e condições de íons que afetam o processo de oligomerização em si.
Atualmente estamos usando oligômeros S100A12 separados de acordo com o protocolo descrito para desenvolver ligantes e anticorpos específicos para bloquear a sinalização da proteína através do TLF4 e para desenvolver e melhorar os ensaios diagnósticos.
