פרוטוקול זה מתאר הליך טיהור מלא עבור חלבון מחייב סידן אנושי, S100A12, ובמיוחד, עבור אוליגומרים שונים הנגרמים על ידי יונים עבור השלכות מחקר במורד הזרם. עם טכניקה זו, אנו מסוגלים לשמור על תשואה גבוהה של חלבון טהור מאוד נטול אנדוטוקסין. הצלבה כימית והפרדה בעמודת הכרומטוגרפיה של אי-הכללת הגודל היא שיטה משכנעת ליצירת חלבונים הומו-אוליגומריים להמשך בדיקות תפקודיות.
הטכניקה שלנו מאפשרת לנו היבטים מכניים של S100A12 כמו ליגנד קולטן זיהוי דפוס ומידע אמנות באופן אידיאלי לפתח התערבויות ממוקדות חדשות ולשפר בדיקות אבחון. בנוסף לצפייה בסרטון זה, אנו ממליצים על קריאה זהירה של הפרוטוקול, כפי שאנו מתארים הליך מורכב ורב שלב. כדי להתחיל, לחתוך צינורות דיאליזה לאורך המתאים, סביב 30 ס"מ, עם מקום נוסף לאוויר.
משרים את הממברנה במים deionized במשך 15 עד 30 דקות כדי להסיר גליצרול. כדי להפחית את צמיגותו של פתרון החלבון המטוהר, לדלל את הפתרון עם 25 מיליליטר של חיץ AIEX A.Attach הסגירה הראשונה על הצינור. טוענים את הדגימה לתוך הממברנה ומצרפים את הסגירה השנייה לפחות סנטימטר אחד מהחלק העליון של הצינור.
בחדר מקורר בארבע מעלות צלזיוס, מניחים את המיכל עם חיץ AIEX A על צלחת ערבוב, מוסיפים בר ערבוב, ואת הממברנה מלאה בתתברית חלבון. כוונן את המהירות כדי לסובב את הדגימה כך שלא תהיה הפרעה לסופת הסטייה המסתובבת. דיאליזה במשך 12 עד 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס ואז להחליף את החיץ דיאליזה עם חיץ מקורר מראש חינם A ולהמשיך לפחות ארבע שעות נוספות.
מעבירים את תותב החלבון הדיאליזי מהצינור לצינור של 50 מיליליטר דרך יחידת סינון של 0.45 מיקרון. הפעל את FPLC עם תחזוקה כללית. חיבור מאגרי עמודות AIEX A ו- AIEX B לשסתומי מאגר ושף חילופי אניון המכילים עמודה ליציאות העמודות של FPLC.
התאם את הפרמטרים הכרומטוגרפיים הכלליים בהתאם. הפעל את תוכנית AIEX בתוכנת FPLC ובחר את אמצעי האחסון לשווי משקל עבור מאגר A.לאחר מכן, לטעון את המדגם על העמודה ולהשתיק את החלבונים עם הדרגתי ליניארי מ 0% עד 100% מאגר מלח גבוה. לאסוף שני שברים מיליליטר במהלך elution.
נתח את השברים האלמותיים לאחר סיום הריצה. לשם כך, לטעון 10 microliters של כל שבר על דף קומאסי מוכתם 15%SDS ולזהות שברים המכילים S100A12. בריכה אלה S100A12 המכיל שברים עבור דיאליזה לתוך מלוחים במאגר TRIS.
כדי להמשיך את טיהור החלבון, לאחר דיאליזה חלבון, להוסיף סידן כלורי לדגימה לריכוז סופי של 25 מילימולר, אשר יקל על קשירה של S100A12 אלשרף בשלב הבא. לאחר מכן, לסנן את המדגם דרך מסנן עם גודל לשפוך של 0.45 מיקרון. לצייד מאגרי HIC ודגימות לארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, חבר את מאגרי העמודות HIC A ו- B ואת העמודה למערכת והתאם את הפרמטרים. התחל את השיטה כדי לצייד את העמודה עם אחד עד שני אמצעי אחסון עמודה של מאגר HIC A טען את המדגם ואת בלוק מדגם לא מאוגד לשטוף עם אות UV מגיע לרמה הבסיסית שוב. ואז להתחיל אלוטיון עם כלטור סידן המכיל חיץ EDTA.
לאסוף שני מיליליטר של שברי שיא במהלך elution. לאחר ניתוח 10 מיקרוליטרים של כל שבר בעמוד קומאסי מוכתם 15%SDS לזהות שברי S100A12 טהורים. בריכה שברים אלה דיאליזה נגד HBS.
ראשית, לטעון 15 מיליליטר של מדגם על יחידת סינון צנטריפוגלי 50 קילודלטון. צנטריפוגה ב 3200 פעמים גרם ב 10 מעלות צלזיוס במשך כ 10 דקות. מעבירים את הזרימה הסינון לתוך כלי טרי, על קרח.
עכשיו, להשתמש מיליליטר אחד של HBS לשטוף את קרום המסנן לדילול של הפתרון מרוכז בקצה המסנן. צנטריפוגה שוב כדי לשחזר חלבון רב ככל האפשר בזרימה דרך. כדי לסנן את הפתרון, חזור על הטעינה והצנטריפוגה לדוגמה בתדירות הנדרשת.
לאחר מכן, כדי לרכז את S100A12 המכיל זרימה דרך, לטעון אותו לתוך מסנן צנטריפוגלי שלושה קילודלטון צנטריפוגה ב 3200 פעמים g, 10 מעלות צלזיוס במשך כ 30 דקות. כעת עוצמת הקול מצטמצמת ל- 1/5 עד 1/10 מנפח הטעינה הראשוני. מעבירים את הפתרון המרוכז לצינור חדש.
חזור על שלב הריכוז לעתים קרובות ככל הנדרש. לאחר הצלבה כימית, על פי כתב היד, לבצע כרומטוגרפיה הדרת גודל. לצייד את העמודה ב- HBS, לטעון את המדגם, ולאסוף שברי שיא של אחד עד שני מיליליטר במהלך הריצה.
לאחר ניתוח שברים אלה בדף SDS הדרגתי של 4 עד 20%, שברי מאגר עם רצועות עיקריות של תסביך החלבון הרצוי. ואז לרכז את הפתרונות כפי שנעשה בעבר. כדי לבודד מונוציטים ממעילים אנושיים על ידי צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות, יש לצייד תחילה את פתרון ההפרדה לטמפרטורת החדר.
מעבירים 20 מיליליטר ל-15 צינורות צנטריפוגה מיליליטר, שני צינורות לכל מעיל באפי. לדלל את הדם מן מעיל באפי אנושי עם HBSS לנפח כולל של 60 מיליליטר ושכבה 30 מיליליטר של תערובת זו בזהירות על גבי מדיום ההפרדה. צנטריפוגה ב 550 פעמים g במשך 35 דקות בטמפרטורת החדר.
כבה את הבלם של הצנטריפוגה. לאחר הצנטריפוגה, תאי הדם ההיקפיים המונונוקלאואריים ממוקמים ישירות על גבי מדיום ההפרדה. עם פיפטה, העבר את התאים האלה לצינור צנטריפוגה טרי ב-50 מיליליטר.
ממלאים את הצינור עם HBSS ל 50 מיליליטר וצנטריפוגה ב 170 פעמים g במשך 10 דקות. שאף את העל-טבעי ולחץ מחדש על גלולת התא בנפח קטן של HBSS על-ידי צינורות. לאחר מכן, למלא את הצינור עד 50 מיליליטר וצנטריפוגה ב 290 פעמים g במשך 10 דקות.
שאף שוב את העל-טבעי. תן שימוש חוזר בתאים ב-50 מיליליטר של HBSS וצנטריפוגה פי 170 למשך 10 דקות. שאפו את העל-טבעי והתינו מחדש את גלולת התא בנפח קטן של מיליליטר אחד של מאגר ההפרדה, ספורו את התאים והוסיפו חיץ לריכוז של פי 5 מ-10 לשבעת התאים למיליליטר.
לבידוד מונוציטים מתאי דם היקפיים מונונוקלאריים, השתמש בערכת בידוד תאים שליליים מגנטיים ופעל בהתאם לפרוטוקול היצרן. השתמש ב מונה תאים אוטומטי כדי לספור את המונוציטים ולתלות מחדש במדיום מונוציטים לריכוז של פי 2 10 עד ששת התאים למיליליטר. כדי לתרבות מונוציטים, לפרוס צלחת תרבות התא עם גז הידרופובי חדיר הסרט מתאים לתאים תלויים.
מניחים את הצלחות תחת אור UV במשך כ 30 דקות עבור עיקור. מעבירים 15 עד 25 מיליליטר של ההשעיה התא לצלחות תרבות אלה ולתת להם לנוח לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר טרום טיהור בעמודת AIEX ו- HIC תלוי סידן לאחר מכן, הושג חלבון טהור מאוד.
כבקרה נוספת, מונוציטים אנושיים היו מגורים עם LPS וייצרו חלבון מסוג בר. חשיפה לחלבון ליונים שונים גורמת לסידור של אוליגומרים שונים מסוג S100A12. הגדלת ריכוזי האבץ גורמת לסידור של S100A12 לתוך טטרם והקסמרים עם ההפרדה בדף SDS מוכתם בארבעה עד 20%.
כאשר עודף של יונים הוחל לפני הצלבה, זה גרם לשינוי בולט של שיווי המשקל אוליגומרי. S100A12 היה מקושר צולבת בנוכחות סידן 25 מילימולר או סידן 25 מילימולר ואבץ מילימולר אחד. לאחר קישור צולב במאגר HBS עם 25 מילימולר סידן כלורי ואחד מילימולר אבץ כלורי, הקסמר וטרמר הופרדו.
טטרמר ודימר הופרדו במאגר HBS עם 25 מילימולר סידן כלורי. דוגמה לאוליגומרים מרוכזים ומרוכזים לאחר ההפרדה בעמוד SDS מוכתם בקומאסי המוכתם בארבעה עד 15% מציגה עמעום, טטרמר והקסמר. גירוי מונוציטים עם S100A12 הקסדציטי הביא לשחרור אלפא TNF מבוטא.
לאחר הסרת אנדוטוקסין, חשוב לא להציג מחדש את הזיהום לתוך הדגימות במהלך הדור הבא וטיהור של אוליגומרים. ניתוח במורד הזרם של כל תהליך הקשור אוליגומריזציה S100A12 הוא מתקבל על הדעת. באופן דומה, ניתן לנתח חומצות אמינו ותנאי יונים המשפיעים על תהליך האוליגומריזציה עצמו.
אנו משתמשים כעת אוליגומרים S100A12 מופרדים על פי הפרוטוקול המתואר לפתח ליגנדים פפטיד ספציפיים ונוגדנים כדי לחסום את האיתות של החלבון באמצעות TLF4 ולפתח ולשפר בדיקות אבחון.
