Ce protocole décrit une procédure complète de purification de la protéine liant le calcium humain, S100A12, et en particulier, car ce sont différents oligomers induits par les ion pour les implications de recherche en aval. Avec cette technique, nous sommes en mesure de maintenir un rendement élevé de protéines très pures et sans endotoxine. La liaison croisée chimique et la séparation sur la colonne chromatographie d’exclusion de taille est une méthode convaincante pour produire des protéines homo-oligomériques pour d’autres analyses fonctionnelles.
Notre technique nous permet de mécaniser les aspects de S100A12 en tant que ligand récepteur de reconnaissance de modèle et des informations d’art pour idéalement développer de nouvelles interventions ciblées et améliorer les tests diagnostiques. En plus de regarder cette vidéo, nous recommandons une lecture attentive du protocole, car nous décrivons une procédure complexe en plusieurs étapes. Pour commencer, couper un tube de dialyse dans une longueur appropriée, environ 30 centimètres, avec un espace supplémentaire pour l’air.
Faire tremper la membrane dans de l’eau déionisée pendant 15 à 30 minutes pour enlever le glycérol. Pour réduire la viscosité de la solution protéique défrichée, diluer la solution avec 25 millilitres de tampon AIEX A.Attachez la première fermeture sur le tube. Chargez l’échantillon dans la membrane et fixez la deuxième fermeture à au moins un centimètre de l’extrémité supérieure du tube.
Dans une pièce refroidie à quatre degrés Celsius, placer le récipient avec le tampon A de l’AIEX sur une plaque à remuer, ajouter une barre de remue-pièce et la membrane remplie de solution protéique. Réglez la vitesse pour faire pivoter l’échantillon de sorte qu’il n’y ait aucune interférence avec la barre de remue-remuer rotative. Dialyzez pendant 12 à 24 heures à quatre degrés Celsius, puis remplacez le tampon dialysé par le tampon A pré-refroidi gratuit et continuez pendant au moins quatre heures supplémentaires.
Transférez la solution protéique dialysée du tube dans un tube de 50 millilitres à travers une unité de filtre de 0,45 micron. Démarrez le FPLC avec maintenance générale. Connectez les tampons de colonne AIEX A et AIEX B aux vannes tampons et à la résine d’échange d’anion contenant de la colonne aux ports de colonne du FPLC.
Ajustez les paramètres chromatographiques généraux en conséquence. Démarrez le programme AIEX dans le logiciel FPLC et choisissez le volume d’équilibrage pour le tampon A.Par la suite, chargez l’échantillon sur la colonne et élisez les protéines avec un gradient linéaire de 0% à 100% tampon de sel élevé. Recueillir deux fractions millilitres pendant l’élitution.
Analyser les fractions élucidées après avoir terminé la course. Pour cela, chargez 10 microlitres de chaque fraction sur une page Coomassie tachée de 15% SDS et identifiez les fractions contenant S100A12. Mettre en commun ces S100A12 contenant des fractions pour la dialyse en solution saline tamponnée tris.
Pour poursuivre la purification des protéines, après la dialyse protéique, ajouter un chlorure de calcium à l’échantillon à une concentration finale de 25 millimolaires, ce qui facilitera la liaison de S100A12 à la résine dans la prochaine étape. Filtrez ensuite l’échantillon à travers un filtre d’une taille de coulée de 0,45 microns. Equilibrer les tampons et les échantillons hic à quatre degrés Celsius.
Ensuite, connectez les tampons de colonne HIC A et B et la colonne au système et ajustez les paramètres. Commencez la méthode pour équilibrer la colonne avec un à deux volumes de colonne de HIC A tampon et chargez l’échantillon et le bloc d’échantillon non lié de lavage avec un signal UV atteint à nouveau le niveau de ligne de base. Puis commencer l’élitution avec un chélateur de calcium contenant tampon EDTA.
Recueillir deux millilitres de fractions de pointe pendant l’élitution. Après avoir analysé 10 microlitres de chaque fraction sur une page Coomassie tachée de 15%SDS identifier les fractions pures S100A12. Mutualiser ces fractions et dialyser contre HBS.
Tout d’abord, chargez 15 millilitres d’échantillon sur une unité de filtre centrifuge de 50 kilodaltons. Centrifugeuse à 3200 fois g à 10 degrés Celsius pendant environ 10 minutes. Transférer le débit filtré dans un récipient frais, sur la glace.
Maintenant, utilisez un millilitre de HBS pour rincer la membrane du filtre et pour la dilution de la solution concentrée dans la pointe du filtre. Centrifugeuse à nouveau pour récupérer autant de protéines que possible dans le flow-through. Pour filtrer la solution, répétez la charge et la centrifugation de l’échantillon aussi souvent que nécessaire.
Ensuite, pour concentrer le S100A12 contenant l’écoulement, chargez-le dans un filtre centrifuge de trois kilodaltons et centrifugeuse à 3200 fois g, 10 degrés Celsius pendant environ 30 minutes. Maintenant, le volume est réduit à 1/5 jusqu’à 1/10 du volume de chargement initial. Transférer la solution concentrée dans un nouveau tube.
Répétez l’étape de concentration aussi souvent que nécessaire. Après la liaison chimique croisée, selon le manuscrit, effectuer la chromatographie d’exclusion de taille. Equilibrer la colonne dans HBS, charger l’échantillon, et recueillir des fractions de pointe d’un à deux millilitres pendant la course.
Après avoir analysé ces fractions sur une page SDS de quatre à 20 %, mutualiser les fractions avec les principales bandes du complexe protéique désiré. Ensuite, concentrez les solutions comme cela a été fait précédemment. Pour isoler les monocytes des couches buffy humaines par centrifugation de gradient de densité, équilibrer d’abord la solution de séparation à la température ambiante.
Transférer 20 millilitres dans des tubes centrifugeuses de 15 millilitres, deux tubes par pelage bouffi. Diluer le sang de la couche buffy humaine avec HBSS à un volume total de 60 millilitres et superposer 30 millilitres de ce mélange soigneusement sur le dessus du milieu de séparation. Centrifugeuse à 550 fois g pendant 35 minutes à température ambiante.
Éteignez le frein de la centrifugeuse. Après centrifugation, les cellules sanguines périphériques mononucléaires sont situées directement au-dessus du milieu de séparation. À l’intérieur d’une pipette, transférer ces cellules dans un tube de centrifugeuse frais de 50 millilitres.
Remplissez le tube de HBSS à 50 millilitres et centrifugeuse à 170 fois g pendant 10 minutes. Aspirer le supernatant et réutiliser la pastille cellulaire dans un petit volume de HBSS par pipetting. Ensuite, remplissez le tube jusqu’à 50 millilitres et centrifugeuse à 290 fois g pendant 10 minutes.
Aspirez à nouveau le surnatant. Resuspendez les cellules en 50 millilitres de HBSS et centrifugeuse à 170 fois g pendant 10 minutes. Aspirez le supernatant et résuspendez la pastille cellulaire dans un petit volume d’un millilitre de tampon de séparation, comptez les cellules et ajoutez un tampon à une concentration de cinq fois 10 aux sept cellules par millilitre.
Pour l’isolement des monocytes des cellules sanguines périphériques mononucléaires, utilisez un kit d’isolement cellulaire négatif magnétique et suivez le protocole du fabricant. Utilisez un compteur cellulaire automatisé pour compter les monocytes et résuspendez dans le milieu des monocytes à une concentration de deux fois 10 à six cellules par millilitre. Pour la culture des monocytes, placez un plat de culture cellulaire avec un film perméable au gaz hydrophobe adapté aux cellules de suspension.
Placer les plaques sous la lumière UV pendant environ 30 minutes pour la stérilisation. Transférer 15 à 25 millilitres de suspension cellulaire dans ces plaques de culture et les laisser reposer toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après la pré-purification sur la colonne AIEX et le HIC dépendant du calcium, des protéines très pures ont été obtenues.
En tant que contrôle supplémentaire, les monocytes humains ont été stimulés par le LPS et ont produit des protéines de type sauvage. L’exposition de protéine à différents ions a comme résultat l’arrangement de différents oligomers de S100A12. L’augmentation des concentrations de zinc induire l’arrangement de S100A12 dans les tétramers et les hexamers lors de la séparation sur quatre à 20%Coomassie taché SDS page.
Quand un excès d’ions a été appliqué avant le croisement, il a induit un décalage prononcé de l’équilibre d’oligomer. S100A12 a été relié en présence de calcium de 25 millimlaires ou de calcium de 25 millimlaires et d’un zinc millimolaire. Après un croisement dans le tampon HBS avec du chlorure de calcium de 25 millimlaires et un chlorure de zinc millimolaire, l’hexamer et le tétramer ont été séparés.
Le tétramer et le dimère ont été séparés dans le tampon HBS avec du chlorure de calcium de 25 millimlaires. Un exemple d’oligomers mis en commun et concentrés après séparation sur une page SDS tachée de coomassie de quatre à 15% montre le dimère, le tétramer et l’hexamer. La stimulation de monocyte avec le S100A12 hexaméricain a eu comme conséquence la libération alpha prononcée de TNF.
Après l’élimination de l’endotoxine, il est important de ne pas réintroduire la contamination dans les échantillons lors de la génération suivante et de la purification des oligomers. L’analyse en aval de tout processus lié à l’oligomérisation S100A12 est concevable. De même, les acides aminés et les conditions ioniques qui affectent le processus d’oligomérisation lui-même peuvent être analysés.
Nous utilisons actuellement des oligomers S100A12 séparés selon le protocole décrit pour développer des ligands et des anticorps spécifiques au peptide pour bloquer la signalisation de la protéine par tlf4 et pour développer et améliorer les tests diagnostiques.
