Metabolische Veränderungen in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen ermöglichen es ihnen, von ihrem Ruhezustand in einen Differenzierungszustand überzugehen, um die Anforderungen an die Blutbildung zu erhalten. Die Veränderung der metabolischen Plastizität von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen führt zu hämatologischen Störungen. Unser Protokoll wird dazu beitragen, die metabolische Regulation und die Gesundheit von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen während der Blutentwicklung und Krankheiten zu messen.
Die Analyse der mitochondrialen Atmung und Glykolyse von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen ist schwierig, da sie zerbrechlich und selten sind. Unser optimiertes Protokoll ermöglicht die Isolierung einer höheren Menge hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen aus murinen Knochenmark, verbessert deren Lebensfähigkeit während der Inkubation, erleichtert die extrazelluläre Flussanalyse nicht-anhaftender HSPCs und bietet optimierte Injektionsparameter für die bekämpfungde oxidative Phosphorylierung sowie glykolytische Wege. Um dieses Verfahren zu beginnen, füllen Sie die Brunnen der Versorgungsplatte und die Kammern um die Brunnen mit sterilem Wasser.
Tauchen Sie die Sensorpatrone in die Netzteilplatte ein, um sicherzustellen, dass die Sensoren vollständig mit Wasser bedeckt sind. Dann legen Sie die Patrone in der Versorgungsplatte in einem Nicht-CO2-Inkubator bei 37 Grad Celsius, um über Nacht zu brüten. In einem Biosicherheitsschrank der Klasse II fügen Sie 40 Mikroliter handelsüblichen 0,1%PLL-Lösung zu jedem Brunnen der Assayplatte hinzu.
Bedecken Sie die Assayplatte mit dem im Kit enthaltenen Deckel und bebrüten Sie die geschlossene Platte bei Raumtemperatur unter der Haube für eine Stunde. Danach verwenden Sie einen sterilen Vakuum-aspirator, um die überschüssige Lösung zu entfernen und die Platte unter der Haube zu trocknen. Um mononukleierte murinierte Knochenmarkzellen zu ernten, fügen Sie fünf Milliliter Dichtegradienten medium zu einem 15 Milliliter konischen Rohr hinzu.
Fügen Sie langsam fünf Milliliter der Knochenmarkzellsuspension hinzu, um sicherzustellen, dass die Zellen als Schicht über dem Dichtegradientenmedium bleiben. Zentrifuge bei 500 mal g und bei Raumtemperatur für 30 Minuten, um sicherzustellen, dass die Zentrifuge bei der geringstmöglichen Beschleunigung ist. Ernten Sie die mittlere Schnittstelle der mononukleierten Zellen in eine frische 15 Milliliter Tube.
Waschen Sie dann die Zellen mit fünf Millilitern 1X PBS, die 2%FBS enthalten. Zentrifuge bei 500 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 300 Mikrolitern 1X PBS mit 2%FBS wieder auf.
Als nächstes aliquot 10 Mikroliter der Zellsuspension für ungefärbte oder einfarbige Kontrolle in einem FACS-Rohr. Um LSK HSPCs aus mononukleierten murinen Knochenmarkzellen zu ernten, fügen Sie 15 Mikroliter Biotin-Antikörpercocktail zu 300 Mikrolitermononukleated Knochenmarkzellen hinzu. Um LSK HSPCs aus mononukleierten murinen Knochenmarkzellen zu ernten, fügen Sie 15 Mikroliter Biotin-Antikörpercocktail zu 300 Mikrolitermononukleated Knochenmarkzellen hinzu.
Legen Sie die Rohre in einen Eiskübel, der auf einem Shaker in einem Kühlschrank positioniert ist, um bei vier Grad Celsius mit Rührung für 30 Minuten zu brüten. Fügen Sie dann 10 Milliliter vorgekühlte 1X PBS mit 2%FBS zu den Zellen hinzu. Zentrifuge bei 500 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 400 Mikrolitern 1X PBS mit 2%FBS wieder auf. Kurz wirbeln die Anti-Biotin-Mikroperlen vor der Verwendung. Fügen Sie 80 Mikroliter der Mikroperlen zu jeder Probe hinzu und mischen Sie sie gut.
Weitere 20 Minuten bei vier Grad Celsius mit Aufregung inkubieren. Danach fügen Sie 10 Milliliter vorgekühlter PBS, die 2%FBS enthalten, zu den Zellen hinzu. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 500 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in einem Milliliter PBS mit 2%FBS wieder auf. Bewahren Sie die Zellsuspension bei vier Grad Celsius auf, während Sie die magnetische Trenneinheit einrichten. Platzieren Sie die Säule in einem Magnetfeld für den magnetisch unterstützten Zellsortierabscheider bei vier Grad Celsius.
Bereiten Sie die Säule für die magnetische Trennung vor, indem Sie sie mit drei Millilitern 1X PBS mit 2%FBS unter Schwerkraftfluss bei vier Grad Celsius spülen. Fügen Sie die Zellsuspension bei vier Grad Celsius in die vornasse Säule ein. Lassen Sie alle Zellen bei vier Grad Celsius durch die Säule passieren und sammeln Sie das Abwasser in einem 15 Milliliter konischen Rohr.
Als nächstes waschen Sie die Säule mit drei Millilitern 1X PBS und 2%FBS bei vier Grad Celsius. Wiederholen Sie diese Wäsche dreimal. Sammeln Sie den Durchfluss und halten Sie ihn bei vier Grad Celsius.
Zentrifugieren Sie das konische Rohr, das den Durchfluss bei 500 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten enthält. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 0,5 Millilitern 1X PBS mit 2%FBS wieder aus und übertragen Sie die Suspension in ein FACS-Rohr. Dann fügen Sie 24 Mikroliter des LSK-Antikörpercocktails zu je 10 Millionen Zellen hinzu.
Das Rohr mit Folie bedecken und im Dunkeln bei vier Grad Celsius eine Stunde lang mit Aufregung bedecken. Danach fügen Sie drei Milliliter 1X PBS mit 2%FBS in das FACS-Rohr. Zentrifuge bei 500 mal g und bei vier Grad Celsius für fünf Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die antikörperbeschrifteten Zellen in einem Milliliter 1X PBS mit 2%FBS wieder aus. Kurz vor der Sortierung einen Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter Propidiumjodid in die Zellsuspension geben und mit einem 40-Mikrometer-Sieb den Inhalt der FACS-Röhre filtern. Zunächst zentrifugieren Sie die gesammelten LSK-Zellen bei 500-fachem g und bei Raumtemperatur für fünf Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in vollständigen Medien auf eine Endkonzentration von mindestens 70 000 Zellen pro 40 Mikroliter wieder aus. Samen 40 Mikroliter dieser Zellsuspension in die Brunnen einer PLL beschichteten Acht-Well-Platte, die sicherstellen, dass alle Eckbrunnen leer zu lassen. Zentrifugieren Sie die Platte bei 450 mal g und bei Raumtemperatur für eine Minute.
Verwenden Sie ein invertiertes Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen an der Unterseite der Brunnen befestigt sind. Danach fügen Sie 135 Mikroliter komplette Medien in die Zellen in jedem Brunnen hinzu und bringen das Endvolumen jedes Brunnens auf 175 Mikroliter. Fügen Sie 175 Mikroliter komplettemedien als Rohlinge in die beiden Ecken der Platte.
Inkubieren Sie die Zellen in einem Nicht-CO2-Inkubator bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden. Richten Sie dann ein Programm für den Analysator ein, um jedem Brunnen der Platte Medikamente hinzuzufügen, wie in Tabelle 2 und Tabelle drei des Textprotokolls beschrieben. Für den mitochondrialen Stresstest, holen Sie die Sensorpatrone in der Gebrauchsplatte aus dem Inkubator, so dass jeder Brunnen eine endgültige Konzentration von zwei mikromolaren Oligomycin, 1,5 Mikromolar FCCP, und 0,5 Mikromolar von entweder Roton und Anti-Mycin A nach Bedarf hat.
Entfernen Sie den Deckel von der Sensorpatrone und legen Sie ihn auf das Gerätefach. Beginnen Sie den Kalibrierungsprozess, der 20 Minuten dauert. Wenn die Kalibrierung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Versorgungsplatte und ersetzen Sie sie durch die Assayplatte, die die LSK-Zellen enthält.
Drücken Sie die Taste continue, um das zuvor eingestellte Programm zu starten. Wenn das Programm abgeschlossen ist, rufen Sie die Daten ab und analysieren Sie sie. In dieser Studie wird eine maximale Menge an lebensfähigen murinen LSK HSPCs isoliert und ihre Glykolyse und ihr mitochondrialer Stoffwechsel mit einem extrazellulären Flussanalysator gemessen.
Obwohl die extrazelluläre Flussanalyse traditionell für anhäßende Zellen verwendet wird, macht diese Methode LSK HSPCs an PLL-beschichtete Brunnen haften, was die Messung des extrazellulären Flusses und damit des metabolischen Zustands von LSK HSPCs ermöglicht. Um die mitochondriale Atmung durch die Sauerstoffverbrauchsrate und Glykolyse durch die extrazelluläre Versauerungsrate bei Basal- und Stressbedingungen zu messen, werden Medikamente, die die Glykolyse und die mitochondriale Atmung stören, sequenziell injiziert. Wie erwartet ist der Basalgehalt der extrazellulären Versauerungsrate bei LSK HSPCs, die in Glukose- und Pyruvat-positiven Medien kultiviert sind, höher als bei den in negativen Medien kultivierten.
Die Injektion mit Glukose änderte nicht die extrazelluläre Versauerungsrate für die zellenkultiviert in den positiven Medien, aber es steigerte die Glykolyse der Zellen in negativen Medien. Der Basalgehalt dieser Zellen blieb jedoch in der positiven Gruppe niedriger. Die Injektion mit Oligomycin aktivierte die Glykolyse auf ihrem maximalen Niveau in der positiven Gruppe, hatte aber keinen Einfluss auf die negative Gruppe.
Die Injektion mit dem Glukose-Analog bei 2-DG brachte die extrazelluläre Versauerungsrate auf nicht-glykolytische Werte zurück. Für den mitochondrialen Stresstest hyperpolarisierte die Injektion von Oligomycin die mitochondriale Membran, die mehr Protonenpumpen durch die ETC-Komplexe verhinderte und somit die Rate der mitochondrialen Atmung reduzierte. Die Injektion von FCCP drückt die Sauerstoffverbrauchsrate auf das Maximum, da Zellen versuchen, das mitochondriale Membranpotenzial zurückzugewinnen.
Die Injektion mit zwei weiteren Elektronentransportketteninhibitoren bewirkt, dass die mitochondriale Atmung vollständig zum Stillstand kommt und damit die Sauerstoffverbrauchsrate auf ihr Mindestniveau zurückgesetzt wird. Bitte vermeiden Sie die Verwendung eines Red-Zell-Lysepuffers für die mononukleäre Zellisolation. Wir empfehlen die Ficoll Gradiententrennung, um die Verklumpbildung zu verhindern und den Verlust von LSK zu reduzieren.
Mit unserer optimierten Methode können wir die mitochondriale Atmung und Glykolyse seltener und zerbrechlicher hämatosischer Stamm- und Vorläuferzellen messen und die Untersuchung von metabolischen Hinweisen normale und bösartige Hämatopoese regulieren.
