Reaktive Sauerstoffspezies oder ROS sind hochreaktive Sauerstoffspezies, die von Zellen produziert werden und ihr Verhalten beeinflussen. Obwohl überschüssiges ROS kann auch weit verbreitete zelluläre Verwüstung verursachen, und in schweren Fällen, Zelltod. Daher ist die Aufrechterhaltung der ROS-Homöostase von grundlegender Bedeutung für die Zellfunktion und das Überleben.
Das hier vorgestellte Protokoll konzentriert sich auf die Messung einer bestimmten Art von ROS, die von Mitochondrien erzeugt wird, hauptsächlich als metabolisches Nebenprodukt in lebenden, normalen oder gesunden hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellpopulationen sowie in Leukämiezellen aus dem Mausmodell von Blutkrebs, akuter myeloischer Leukämie oder AML. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um zu bewerten, wie genetische Manipulation, wie Gen-Deletion oder Überexpression, mitochondriale ROS in mehreren gesunden und bösartigen hämatopoetischen Populationen beeinflusst. Und als Ergebnis, potenziell geben aufschlussreiche Informationen über Redux Zustand und möglicherweise den Stoffwechsel der Zellen.
Diese Technik erlaubt die Strömungsabgleichs-Metrikanalyse einer protogenen Sonde zur Überwachung der mitochondrialen ROS-Produktion in lebenden gesunden und bösartigen hämatopoetischen Stamm- und Vorläufer-Subpopulationen. Dieses Protokoll ist einfach und kann in wenigen Stunden abgeschlossen werden. Darüber hinaus eignet es sich für die Analyse von lebenden Zellen und ermöglicht die Unterscheidung und Analyse von mitochondrialem ROS in der Stammzellpopulation im Knochenmark unter Verwendung von Oberflächenmarkierungen der Färbung.
Nach dem Sammeln mononuklearer Knochenmarkzellen von wilden engen Mäusen und leukämischen MLL-AF9-Mäusen, laut Manuskript, aliquot 200 Mikroliter der Zellsuspension in jedem der neun einfarbigen Kontrollröhren. Aliquot die verbleibenden Zellen in andere experimentelle Röhren, jeweils 200 Mikroliter. Legen Sie dann in eine Zentrifuge zwei Versuchsröhren mit Knochenmarkzellen bzw. leukämischen Zellen und ein Kontrollrohr.
Zentrifuge bei 300 mal G für fünf Minuten. Als nächstes dekantieren Sie den Überstand und hängen Sie die Zellen bei Raumtemperatur F-PBS mit einem Lebenden/toten Zellfleck nach den Anweisungen des Herstellers wieder auf. 30 Minuten auf Eis bebrüten.
Fügen Sie danach 1 Milliliter Raumtemperatur F-PBS zu den drei lebenden/toten gebeizten Röhren und ein einziges Farbkontrollrohr für mitochondriale ROS-Färbung hinzu. Legen Sie die Rohre bei 300 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur in die Zentrifuge. Dann erhalten Sie eine 5 Millimolar mitochondriale ROS Farbstoff-Stock-Lösung durch erneutes Suspendieren von 50 Mikrogramm mitochondrialen ROS-Farbstoff in 13 Mikroliter DMSO.
Fügen Sie dann 13 Milliliter Raumtemperatur F-PBS in den 13 Mikroliter mitochondrialen ROS-Farbstoff, um eine endgültige Konzentration von fünf Mikromolaren zu verdünnen. Falls erforderlich, fügen Sie 13 Mikroliter 50 Millimolar Verapamil in die Lösung, um mitochondriale Efflux-Pumpen zu hemmen. Die Rohre aus der Zentrifuge beziehen und die Wäsche des lebenden/toten Zellflecks absaugen.
Fügen Sie 200 Mikroliter F-PBS in die Live/Dead-Färbungskontrolle ein und halten Sie sie im Eis, bis sie bereit sind, die Analyse zu starten. Fügen Sie 200 Mikroliter des mitochondrialen ROS-Farbstoffflecks, der Verapamil enthält, zu jedem Versuchsröhrchen sowie dem mitochondrialen ROS-Färbungskontrollrohr hinzu. Wirbel zu mischen und inkubieren für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius in der Dunkelheit.
Dann fügen Sie 1 Milliliter Raumtemperatur F-PBS in die Steuer- und Versuchsrohre. Zentrifuge fünf Minuten bei 300 mal G bei Raumtemperatur. Apirieren Sie das Überstand und waschen Sie die Zellen mit einem zusätzlichen Milliliter Raumtemperatur F-PBS.
Zentrifuge wieder für fünf Minuten bei 300 mal G, bei Raumtemperatur. Bereiten Sie zunächst zwei Antikörpercocktails für gesunde und Leukämie-Knochenmarkzellen zu. Aspirieren Sie den Überstand aus dem Versuchsröhrchen, der gesunde Knochenmarkzellen enthält, und fügen Sie 200 Mikroliter des Antikörpercocktails Nummer eins in die Röhre ein.
Wirbel zu mischen. Bereiten Sie auch die einzelnen Farbkontrollröhrchen vor, indem Sie 200 Mikroliter F-PBS und einen Mikroliter des entsprechenden Antikörpers hinzufügen. 60 Minuten auf Eis im Dunkeln bebrüten.
Aspirieren Sie den Überstand aus dem Versuchsröhre, das Leukämieknochenmark enthält, und fügen Sie 200 Mikroliter des Antikörpercocktails Nummer zwei in die Röhre ein. Wirbel zu mischen. 60 Minuten auf Eis im Dunkeln bebrüten.
Danach alle Schläuche mit 1 Milliliter kaltem F-PBS und Zentrifuge fünf Minuten bei 300-fachem G bei Raumtemperatur waschen. Die Zellen in 500 Mikroliter kaltem F-PBS wieder aussetzen. Übertragen Sie die Zellsuspension in jedes Durchflusszytometerrohr mit einem 40-Mikrometer-Filter zum Ausschließen von Aggregaten.
Legen Sie zunächst ein Fleckenregelrohr in die Durchflusszytometriemaschine und starten Sie die Erfassung, um die Durchflusszytometriemaschine zu kompensieren. Wiederholen Sie dies für andere Steuerrohre. Danach lesen Sie die Versuchsrohre, um die Tore aufzustellen.
Um die Größe und Komplexität der Zellpopulation zu analysieren, zuerst für gesunde HSPC, legen Sie die Vorwärtsstreufläche und die Seitenstreuungsflächen zu, die Populationen darstellen. Drücken Sie die Quadratische Tor-Taste, um fremde Trümmer aus dem vorderen und seitlichen Streudiagramm herauszuräumen. Verwenden Sie dann auf einem vorderen Streubereich und Höhendiagramm einen doppelten Diskriminator, um Doublets auszuschalten.
Wählen Sie lebende Zellen, Linien-niedrige Zellen und die verschiedenen gesunden HSPC. Analysieren Sie für jede Voninteressespopulation die mediane Fluoreszenzintensität des TRPE-Kanals in einem Histagram-Plot, um Unterschiede im mitochondrialen ROS-Signal zu bewerten. Wiederholen Sie das gleiche Verfahren der Größenanalyse, Gating und Histogramm-Plotting für Leukämiepopulationen.
Knochenmarkzellen, die von gesunden Mäusen isoliert wurden, wurden mit einem lebenden/toten Farbstoff und einem mitochondrialen ROS-Farbstoff gefärbt und anschließend mit Antikörpern gefärbt, die Linienmarker erkennen:plus CD48, C-Kit, Sca-1, CD34 und CD150. Darüber hinaus wurden Knochenmarkzellen von Leukämiemäusen auch mit CD45.2 gefärbt, um zwischen MLL-AF9-Leukämiezellen aus gesunden Empfängerknochenmarkzellen zu unterscheiden, die mit CD45.1 gefärbt sind. Ein Vergleich der mitochondrialen ROS-Färbung, zwischen gesunden CD48 negativen LSK, und myeloiden Vorläufern, zeigt, dass myeloische Vorläufer deutlich höhere Konzentrationen von mitochondrialer ROS-Färbung aufweisen.
Darüber hinaus zeigen c-Kit-Vorläufer mit hoher Leukämie signifikant höhere Konzentrationen von mitochondrialer ROS-Färbung im Vergleich zu c-Kit-Mittel-Niederleukämiezellen, gesunden CD48-negativen LSK- und myeloischen Vorläufern. C-Kit-Mittel-Niedrigleukämie-Zellen, zeigte auch einen deutlich höheren Wert im Vergleich zu CD48 negativen LSK-Zellen, aber nicht zu myeloischen Vorläufern. Mitochondriale ROS-Farbstoffe sind hochreaktiv und geeignete Waschschritte sind erforderlich, um sicherzustellen, dass ein Überschuss des Farbstoffs entfernt wurde, bevor die folgenden Schritte beginnen.
Es gibt mehrere chemisch unterschiedliche ROS fluorogene Farbstoffe, die in diesem Protokoll verwendet werden können, um ein wenig Wissen über den Redux-Status in lebenden hämatopoetischen Zellen zu erreichen. Diese Technik wurde in der Literatur ausgiebig verwendet und kann nützliche Einblicke in die stoffwechsel- und Signalwege liefern, die in Leukämiezellen differential reguliert werden, wenn sie mit ihren normalen Gegenstücken verglichen werden.
