Herkömmliche RT-PCRs erlauben keine Diskriminierung zwischen Sinn- und Anti-Sinn-Sequenzen, wenn sie verwendet werden, um RNAs zu erkennen, die durch überlappende Gene kodiert sind. Dieses Protokoll ermöglicht es, speziell anti-sense-RNAs zu erkennen. Die Verwendung einer biotynyolierten Grundierung zusammen mit hohen RNA-Denaturierungstemperaturen ermöglicht eine Verstärkung von Anti-Sense-CDNAs und verhindert die Bildung unspezifischer RT-Produkte.
Wir haben diese Methode verwendet, um zu zeigen, dass ASP entweder als RNA-Anti-Sinn oder als Protein-Vorläufer, es ist ein neues HIV-Antigen, tut es potenziell ein neues HIV-Ziel für die Therapie. Diese Methode kann auf jedes System angewendet werden, in dem Anti-Sense-RNAs aus überlappenden Genen nachgewiesen werden können. Beginnen Sie mit der Entwicklung patientenspezifischer Primer unter Verwendung der proviralen DNA-Sequenz, die intern in den PanASP-Primern ist.
Als nächstes quantifizieren Sie die RNA und beseitigen Sie die DNA-Kontamination, indem Sie Proben mit DNase behandeln. Transfer zwischen 0,1 und einem Mikrogramm gesamter RNA in die entsprechenden Brunnen auf einer 96 Well PCR Platte. Richten Sie dann die umgekehrte Transkription oder RT-Reaktion gemäß manuskripten Anweisungen ein.
Bereiten Sie die endogenen RT-Kontrollen vor, indem Sie anstelle des ASP-Reverseprimers fünf Mikroliter nukleasefreies Wasser hinzufügen. Die Platte in den Thermocycler geben und die RNA fünf Minuten lang auf 94 Grad Celsius erhitzen. Dann sofort in Eiswasser für mindestens eine Minute abkühlen.
Bereiten Sie das Reaktionsgemisch in einem 1,5-Milliliter-Rohr vor, wie im Textmanuskript beschrieben, und übertragen Sie dann 17,5 Mikroliter auf jede der RNA enthaltenden Brunnen. Die RNA-Denaturierung muss bei 94 Grad Celsius durchgeführt werden. Ohne vollständige Denaturierung können Synthesen von unspezifischen Produkten aus Sinnes-RNA auftreten, was zur Amplifikation unspezifischer cDNAs führt.
Mischen Sie den Inhalt der Brunnen sanft und bebrüten Sie die Platte bei 55 Grad Celsius für 60 Minuten. Dann inaktivieren Sie die Reaktionen, indem Sie die Platte 15 Minuten lang auf 70 Grad Celsius erwärmen. Bereiten Sie einen Liter 2X Wasch- und Bindungspuffer nach Manuskriptrichtungen vor und filtern Sie die Lösung.
Als nächstes bereiten Sie 50 Milliliter 1X Wasch- und Bindungspuffer mit PCR-Wasser vor. Übertragen Sie die entsprechende Anzahl von streptavidin-konjugierten Magnetperlen auf ein 1,5 Milliliter-Rohr und waschen Sie sie dann, indem Sie ein gleiches Volumen von 2X Wasch- und Bindungspuffer hinzufügen und das Rohr für 15 Sekunden wirbeln. Legen Sie das Rohr in ein magnetisches Trennregal und inkubieren Sie es für drei Minuten bei Raumtemperatur.
Entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand, ohne die Perlen zu stören, und fügen Sie das gleiche Volumen des 2X Wasch- und Bindungspuffers hinzu wie das Anfangsvolumen der Perlen. Wirbeln Sie die Perlen für 30 Sekunden und übertragen Sie 10 Mikroliter der Suspension auf eine entsprechende Anzahl von 1,5 Milliliter-Röhren. Legen Sie die Rohre in das magnetische Trennregal und inkubieren Sie sie für drei Minuten bei Raumtemperatur.
Entsorgen Sie dann den Überstand und fügen Sie 50 Mikroliter 2X Wasch- und Bindungspuffer hinzu. 50 Mikroliter biotynylatierte cDNA mit den Perlen in die entsprechenden Schläuche geben und 30 Minuten lang bebrüten, während sie sich sanft drehen. Legen Sie die Rohre nach der Inkubation drei Minuten lang auf das magnetische Trenngestell und waschen Sie die Perlen mit 200 Mikrolitern 1X Wasch- und Bindungspuffer, gefolgt von einer dreiminütigen Inkubation auf dem Trennträger.
Entsorgen Sie den Überstand und wiederholen Sie die Wäsche zweimal. Dann setzen Sie die Perlen in 10 Mikroliter PCR-Wasser wieder aus. Bereiten Sie ein entsprechendes Volumen von PCR Master Mix entsprechend den Manuskriptanweisungen vor.
Mischen Sie es gut und drehen Sie es schnell nach unten, dann übertragen 49 Mikroliter pro Brunnen auf eine 96 well PCR Platte. Wirbeln Sie die Rohre mit der gereinigten cDNA 15 Sekunden lang vorsichtig aus und fügen Sie den entsprechenden Brunnen einen Mikroliter der Suspension hinzu. Führen Sie die PCR aus und trennen Sie die Produkte auf einem 1%Agarose-Gel.
Schneiden Sie die Bänder aus dem Gel und klonen Sie die verstärkten Produkte in ein PCR 2.1 Plasmid. Sequenzieren Sie dann die Klone und analysieren Sie jede Sequenz. Die ersten RT-Reaktionen wurden mit dem regulären nicht-biotynyolierten Anti-Sense-Primer durchgeführt und führten zu einer erfolgreichen Amplifikation von ASP.
Allerdings wurde auch ein Band mit dem gleichen Molekulargewicht und der gleichen Grundierung minus Kontrollen verstärkt. Um dieses Problem zu umgehen, wurde der spezifische Anti-Sinn-Primer mit Biotyn gekennzeichnet und die resultierende Anti-Sense-cDNA wurde vor PCR gereinigt. Dadurch konnte die ASP-Sequenz mit stark reduzierter Kontamination durch die unspezifische cDNA im Primer minus-Kontrollen verstärkt werden.
Eine weitere Optimierung dieser Methode wurde durch eine vollständige Denaturierung der RNA bei 94 Grad Celsius vor RT erreicht, gefolgt von einer sofortigen Abkühlung auf Eiswasser, was zu einer effektiven Verstärkung des ASP-Bandes und ohne unspezifische Produkte führte. Die Kinetik der ASP-RNA wurde gemessen und CD4-Zellen von drei HIV-positiven Probanden mit nachweisbarer Virämie und fehlender Therapie nach Stimulation mit Anti-CD3/CD28 isoliert. Die Quantifizierung der ASP-RNA war auch bei Patienten mit ART-Behandlung mit nicht nachweisbarer Virämie möglich.
Bei zwei von drei Patienten wurde ASP-RNA in niedrigen Konzentrationen an drei bis fünf Tagen nach der Stimulation nachgewiesen. Zwei Patienten wurden auf ASP- und Env-RNAs untersucht, einer unbehandelt und einer behandelt. Für den unbehandelten Patienten konnten beide RNAs nachgewiesen werden.
Für den behandelten Patienten waren ASP und Env nach mehrtägiger Stimulation kaum nachweisbar. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Denaturierung die RNA linearisiert, so dass sekundäre Strukturen, die RT primieren können, zerstört werden. Während das Waschen der Perlen nicht-biotynylated cDNAs wegspült.
Nach der Reinigung der cDNAs mit der richtigen Polarität kann qPCR durchgeführt werden, um die Genexpression zu analysieren. Darüber hinaus können cDNAs auch geklont und für die Sequenzanalyse verwendet werden. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Genen, die sich in entgegengesetzter Ausrichtung überlappen, und kann bei der Aufklärung der Regulierung und Pathogenese eines Bakteriums und einer virusbedingten Krankheit, einschließlich einiger Krebsarten, nützlich sein.
