Das Protokoll bietet eine einfach zu handhabende und weitgehend kompatible primäre Zellkulturmethode für wirbellose Meerestiere. Diese Technik gibt Forschern eine Möglichkeit, die marinen wirbellosen Zellen für vergleichsweise lange Zeit zu kultiton. Eine Zellkultur sollte mit einem konsistenten genetischen Hintergrund für verschiedene weitere biologische experimentelle Anwendungen in der Meeresbiologieforschung versehen werden.
Für die neuen Forschungsarbeiten in diesem Bereich sind wir der Meinung, dass das angegebene vereinfachte Protokoll die gute Wahl sein sollte. Nach der Anästhesisierung, sezieren und sammeln Sie den vorderen Darm, dann schneiden Sie die Gewebeproben vertikal und entfernen Sie den inneren Inhalt. Waschen Sie die Gewebeproben zweimal in PBS und desinfizieren Sie sie durch Eintauchen in eine 75%Ethanol-Lösung für nicht länger als zwei Sekunden.
Dann waschen Sie die Gewebeproben in PBS dreimal, um das Ethanol zu entfernen, und übertragen Sie etwa 100 Milligramm Gewebeprobe in eine zwei Milliliter sterile Mikrozentrifugenröhre. Fügen Sie 1,5 Milliliter voroptimiertes Kulturmedium in den Darmgewebeblock der Seegurken ein und zerkleinern Sie den Block mit einer sterilisierten chirurgischen Schere, bis die Lösung trüb ist. Fügen Sie 400 Mikroliter 0,25%Trypsin hinzu.
Mischen Sie die Lösung durch Inversion und inkubieren Sie sie für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Dann filtern Sie die Lösung mit einem 100 Mikron Zellsieb und sammeln Sie das Filtrat in einem neuen sterilen Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr. Für optionalvereinfachtes Protokoll können in kultivierten Medien geschnittene Gewebeblöcke direkt in Gerichte übertragen und anschließend inkubiert werden.
Zentrifugieren Sie das Rohr bei 1700xG für drei Minuten, entsorgen Sie den Überstand, dann setzen Sie das Pellet im Kulturmedium mit Antibiotika wieder auf und waschen Sie es zweimal mit Kulturmedium. Stellen Sie den Inkubator für die Zellkultur vor und führen Sie ihn im Voraus mindestens 24 Stunden mit einer Temperatur von 18 Grad Celsius und gesättigter Luftfeuchtigkeit aus. Dann die Zellen mit 200 Mikroliter des angegebenen Mediums wieder aussetzen und in vier Zentimeter große Gerichte übertragen.
Kultur die Zellen in einem Inkubator. Nach sechs Stunden, nehmen Sie sie aus dem Inkubator und fügen Sie zwei Milliliter des angegebenen Mediums auf die Zellkultivierung Gerichte. Wechseln Sie alle 12 Stunden die Hälfte des Mediums.
Nach fünf bis sieben Tagen beginnen sich die Zellen zu teilen. Reduzieren Sie die Nebenwirkungen von Antibiotika, indem Sie die Konzentration von indizierungsgemäßen Antibiotika, Penicillin, Streptomycin und Gentamicin im Kulturmedium um die Hälfte reduzieren. Ersetzen Sie alle zwei bis drei Tage das Zellkulturmedium.
Wenn die primäre Zelldichte 60% erreicht, leiten Sie die Zelldurchlaufung. Waschen Sie zunächst die kultivierten Zellen zweimal mit PBS bei Raumtemperatur. Fügen Sie 200 Mikroliter 0,25%Trypsin-Lösung zu jedem Gericht, und manuell die Gerichte zu erregen, um sicherzustellen, dass der gesamte Boden abgedeckt ist.
Entsorgen Sie die Trypsin-Lösung, und inkubieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter frischem Kulturmedium, indem Sie die Zellen abpfeifen und wieder aufhängen. 0,5 Milliliter Zellsuspension auf ein neues Gericht übertragen.
Fügen Sie 1,5 Milliliter frisches Medium hinzu und brüten Sie die Zellen bei 18 Grad Celsius. Wechseln Sie nach 12 Stunden das Medium, und beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um die Bedingungen zu bewerten. Bereiten Sie drei experimentelle Gruppen, einschließlich einer Steuerung, und zwei Gruppen von Lösungen mit einem Mikromolar und 100 Mikromolar-Deximethazone vor.
Nach der Inkubation mit oder ohne Deximethazon für Null, 24 oder 48 Stunden, waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Nach dem Ausschalten des Lichts 300 Mikroliter Hacken 33258 Lösung pro Brunnen zu einer 12 Brunnenplatte hinzufügen, und sanft die Platte zu rühren, um alle Zellen zu bedecken, um ihre Färbung zu gewährleisten. Bei 18 Grad Celsius 30 Minuten inkubieren.
Entfernen Sie dann die Hackchst-Färbelösung und fixieren Sie die Zellen, indem Sie jedem Brunnen 300 Mikroliter von vier Prozent Paraformaldehydlösung in PBS hinzufügen. Sanft rühren für 15 Minuten. Danach waschen Sie die festen Zellen dreimal in PBS.
Bewahren Sie die PBS nach dem letzten Waschen auf, um die Zellen bedeckt zu halten. Schalten Sie die Fluoreszenzmikroskop-Hardware ein, einschließlich der Quecksilberlampenleistung, der Fluoreszenzlichtleistung und des PCs. Melden Sie sich beim Betriebssystemkonto an, starten Sie die Software, und überprüfen Sie deren Konfiguration. Legen Sie die vorbereitete Platte auf die Mikroskopstufe.
Positionieren Sie die Probe mit dem Stufenregler über der Objektivlinse. Finden Sie die Zellen von Interesse unter dem Lichtmikroskop. Wechseln Sie zur fluoreszierenden Mikroskopie und passen Sie die Parameter der Anregung und Emission auf ca. 352 bzw. 461 Nanometer für die Kern-DNA-Beobachtung an.
Erfassen Sie die Bilder. In dieser Studie wurde die primäre Darmzellkultur von Seegurken etabliert und durchdrungen. Hier werden runde Zellen in verschiedenen Stadien der Kultivierung gezeigt.
Hier sind Zellen, die am unteren Rand des Geschirrs am dritten Tag, nach der Aussaat, befestigt sind. Hier ist die Zellproliferation am siebten Tag. Hier sind Zellen, die nach dem Passieren an der Unterseite des Geschirrs befestigt sind.
Und Zellen, die Aktivität verloren und nach 10 Passagen starben. Die EDU-Angaben liefern direkte Beweise, um die proliferative Aktivität dieser runden Zellen in späteren Stadien zu offenbaren. Die Stimulation mit einem Mikromolar-Deximethaum erhöhte die apoptotische Zellrate am schnellsten im Vergleich zur Kontrolle und der 100 mikromolaren Deximethazone-Stimulation.
Die kultivierten Zellen wurden für verschiedene Zeiträume mit Deximethaon behandelt, gefolgt von hoechst 33258 Färbung für die Apoptotikzelldetektion. Zellbehandlungen vor der Inkubation sind entscheidend für die Langzeitkontrolle. Es ist eine Erinnerung, das optionale vereinfachte Protokoll auszuprobieren, wenn die Zelle nicht gut wächst.
Paraformaldehyd ist mäßig giftig durch Hautkontakt oder Inhalation, und es ist als wahrscheinlich menschliches Karzinogen dokumentiert.
