Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die sich darauf konzentriert, die beiden am häufigsten vorkommenden Gliazellpopulationen, Astrozyten und Mikroglia, von postnatalen Mäusen zu extrahieren. Unsere Methode unterscheidet sich von anderen zuvor beschriebenen Protokollen für die Isolierung von Astrozyten und Mikroglia, da wir uns darauf konzentrieren, beide Zelltypen in der gleichen Extraktion unter demselben Zustand zu erhalten und zu isolieren, wodurch die Verwendung von Versuchstieren optimiert und die Untersuchung der relativen Rollen für diese Zellen in immunologischen Kontexten verbessert wird. Dieses Protokoll kann nützlich sein, um Mikroglia- und Astrozytenrollen in vielen Kontexten und Krankheiten im zentralen Nervensystem wie Alzheimer, Parkinson und Infektionen durch z. B. Protozoenparasiten oder Viren besser zu untersuchen.
Die Beschaffung und Isolierung beider Zelltypen aus der gleichen Extraktion ist wünschenswert, um die vergleichende Rolle jeder Zelluntermenge immunologischer Kontexte wie Infektion oder Entzündung zu bewerten. Die Menschen sollten vorsichtig sein, vor allem während der Gehirnentfernung und Nervengewebe wäresst, aber ich glaube, dass mit diesem Protokoll und dem Video aufgenommen, Menschen nicht kämpfen. Dieses Protokoll kann lang sein, abhängig von der Anzahl der Tiere, um die Kortiken zu extrahieren, also bereit sein, etwa vier Stunden oder mehr zu verbringen.
Bereiten Sie am ersten Tag reine HBSS und HBSS plus 10% wärmeinaktivierte FBS vor. Vorbereiten Sie den dmEM F12 und filtern Sie es mit einem 0,22-Mikron-Filter. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente in einem Autoklaven und verwenden Sie 70% Ethanol während des Eingriffs.
Neugeborene Mäuse in eine versiegelte Kammer mit mit Isofluran getränkter Baumwolle für fünf Minuten für eine tiefe Anästhesie. Den Mauswelpen mit 70% Ethanol besprühen und das Tier mit einer Schere enthaupten. Machen Sie einen sagittalen Schnitt mit einer Schere entlang des Schädels, um es zu öffnen und das Gehirn freizulegen.
Entfernen Sie das Gehirn mit einem Mikrospachtel, um die Integrität des Gehirns zu erhalten. Legen Sie das Gehirn in eine trockene Petrischale mit sechs Zentimeterdurchmesser. Entfernen Sie mit einem Mikrospachtel die Olfaktor-Lampe und das Kleinhirn.
Verschieben Sie den Kortex in eine andere Petrischale, die zwei Milliliter HBSS plus 10%FBS enthält. Schneiden Sie das Hirngewebe mit einer sterilen Schere in kleine Stücke und übertragen Sie mit einer P1000-Mikropipette jedes Hirngewebe mit HBSS plus 10% FBS in verschiedene 15 Milliliter konische Röhren. Verwenden Sie bei Bedarf HBSS plus 10%FBS, um das endige Volumen auf zwei Milliliter zu füllen.
Waschen Sie das geschnittene Hirngewebe mit drei Millilitern HBSS plus 10%FBS für jede Röhre. Nach der Dekantierung den Überstand vorsichtig entfernen. Wiederholen Sie die Wäsche mit HBSS plus 10%FBS dreimal zusätzlich.
Dann mit drei Millilitern reinen HBSS dreimal waschen. Nach der Dekantierung den Überstand vorsichtig entfernen. Als nächstes fügen Sie drei Milliliter Trypsin hinzu und legen Sie die Röhre in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten sanft schütteln die Rohre alle fünf Minuten.
Dadurch wird das gesammelte Gewebe verdaut. Vermeiden Sie Blasen. Um das Trypsin zu inaktivieren, waschen Sie das Gewebe mit drei Millilitern HBSS plus 10%FBS und entfernen Sie nach der Dekantierung des Gewebes vorsichtig den Überstand.
Wiederholen Sie diese Wäsche dreimal. Dann waschen Sie das Gewebe mit drei Millilitern reinen HBSS und wiederholen Sie zwei weitere Male. Nach der Dekantierung des Gewebes, entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
Fügen Sie sieben Milliliter reine HBSS hinzu und homogenisieren Sie das Gewebe durch aufeinander folgende Passagen in Pipetten, zuerst mit einer 10 Milliliter serologischen Pipette, gefolgt von einer Fünf-Milliliter-Pipette und schließlich mit einer P1000-Mikropipette. Nach der Homogenisierung zentrieren Sie die Rohre bei 450 mal g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet mit vier Millilitern HBSS plus 10% FBS für jedes Rohr wieder auf.
Übertragen Sie die Zellen in einen kommerziell vorbehandelten T75-Kolben für eine optimale Zellkulturhaftung. Legen Sie den Kolben in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius bei 5% Kohlendioxid für 30 Minuten für die Einhaltung. Dann fügen Sie 10 Milliliter zusätzliche DMEM F12 in den Kolben und inkubieren bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für zwei Nächte.
Entfernen Sie am dritten Tag sieben Milliliter Kulturmedium aus dem T75-Kolben und fügen Sie sieben Milliliter frisch ergänztem DMEM F12 hinzu. Geben Sie den Kolben an den Inkubator zurück. Um am fünften Tag Trümmer und nicht haftende Zellen zu entfernen, tauschen Sie das gesamte Medium aus dem T75-Kolben mit 14 Millilitern frisch ergänztem DMEM F12 aus.
Dann alle 48 Stunden, entfernen Sie sechs Milliliter des Überstandes und fügen Sie sieben Milliliter frisch ergänzt DMEM F12 Medium bis Tag 14 der Kultur. Am 14. Tag, nach dem Entfernen von sechs Millilitern Überstand und Zugabe von sieben Milliliter nfrisch ergänztDMEM F12 Medium, schließen Sie die T75-Flaschen fest mit Kunststoffverpackung. Legen Sie sie in den Boden Orbital-Shaker bei 200 RPM und 37 Grad Celsius über Nacht, um mechanisch zu trennen Mikroglia von Astrozyten.
Nehmen Sie am 15. Tag die Kolben vom Shaker und waschen Sie sie kräftig mit ihrem eigenen Medium, um die Zelldissoziation zu optimieren und die maximale Anzahl von Mikroglia zu ernten. Dann den Überstand sammeln und in ein 50 Milliliter konisches Rohr übertragen. Als nächstes fügen Sie vier Milliliter Trypsin zu jedem Kolben hinzu und brüten für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius, um die Astrozyten zu lösen.
Fügen Sie dann fünf Milliliter ergänztdmEM F12 hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren. Waschen Sie die Kolben mit ihrem eigenen Medium und übertragen Sie den Inhalt in ein 50 Milliliter konisches Rohr. Zentrifugieren Sie alle Röhren, die dissoziierte Mikroglia oder Astrozyten enthalten, bei 450-fachem g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.
Entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie das Mikrogliapellet in einem Milliliter ergänzter DMEM F12 und die Astrozyten in 10 Millilitern ergänzter DMEM F12 aus. Fahren Sie mit der Zellzählung in einer Neubauer-Kammer oder einem automatischen Zellzähler fort.
Die Zellen mit ergänztem DMEM F12 in der gewünschten Dichte in einer vorbehandelten flachen Bodenzellkulturplatte verkleben. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 24 Stunden, damit sie sich anbringen können. Am 14. Tag wurde die Gliazellkultur mechanisch dissozial.
Es wurde mit einer Reinheit von 89,5% für die Astrozytenpopulation und 96,6% für die Mikroglia-Population beobachtet. Astrozyten und Mikroglia von C57BL6-Mäusen wurden mit T.cruzi Y infiziert. Nach zwei Stunden, 48 Stunden und 96 Stunden wurden die Kammern mit Methanol fixiert und mit dem Zellnukleasemarker DAPI und anti-GFAP gefärbt. Die Verwendung genetisch veränderter Parasiten, die fluoreszierende Reporter oder parasiten, die mit spezifischen fluoreszierenden Antikörpern gekennzeichnet sind, verbesserte die Immunfluoreszenzmikroskopie, da sie sich besser vom Zellkern unterscheiden.
Zwei Beispiele werden hier vorgestellt. T.gondii RH-Stamm konstitutiv exezierend YFP- und T.cruzi Y-Stamm, gefärbt mit nicht-kommerziellem monoklonalen Antikörper 2C2 Anti-SSP4-Protein. Es ist wichtig, die Zellen sorgfältig zu waschen, um keine Zellaggregate zu verlieren.
Nach einer Glialzelleninfektion können andere Parameter wie ELISA für die Zytokinproduktion im Überstand, Western Blotting für die Proteinexpression und quantitative PCR in Echtzeit für die RNA-Transkriptionsbewertung ausgewertet werden. Viele Fragen im Zusammenhang mit der Funktion von Gliazellen, zum Beispiel ihr Stoffwechsel, immunantwort, und Zellbiologie selbst können von dieser Technik angesprochen und profitiert werden. Alle Protozoenparasiten sind in der Lage, menschliche Zellen sowie Kultur-Mauszellen zu infizieren, so ist es wichtig, vorsichtig zu sein, wenn sie mit diesem Parasiten umgehen.
