Mit diesem Protokoll können humane linksventrikuläre Gewebeschnitte ex vivo in einer biomimetischen Kammer kultiviert werden. Die Anwendung von Pre- und Afterloads verbessert die Ähnlichkeit der physiologischen Umgebung. Diese Technik ermöglicht eine kontinuierliche Registrierung der Gewebekontraktion.
Benutzerdefinierte Stimulationsprotokolle ermöglichen die Beurteilung von Vitalkontraktionsparametern wie Potenzierung nach der Pause, Stimulationsschwelle, Kraft-Frequenz-Beziehung und Feuerfestperiode. Die langfristige Kultivierung von Myokardscheiben unter Verwendung dieses Aufbaus wird den Weg für die zukünftige Ex-vivo-Forschung ebnen und dieses Screening auf therapeutische und kardiotoxische Arzneimittelwirkungen in der kardiovaskulären Medizin erleichtern. Um zu beginnen, tauchen Sie die Kultivierungskammern und Graphitelektroden in einen Liter einer 10% Isopropanollösung und rühren Sie über Nacht.
Am nächsten Tag die Kammern für 3 Minuten in eine 100% Isopropanol-Lösung überführen und dann die Kammern und Graphitelektroden unter einer Laminar-Flow-Haube an der Luft trocknen lassen. Befestigen Sie eine Leiterplatte an jeder Kammer entsprechend den verfügbaren Positionen auf der Wippe. Legen Sie zwei Graphitelektroden gemäß den Anweisungen des Herstellers auf die Leiterplatte und legen Sie dann einen 35-Millimeter-Petrischalendeckel auf die Kammer, um eine Infektion zu verhindern.
Als nächstes füllen Sie das Schneidefach bis zu 90 bis 95% mit Schneidepuffer. Die Gewebeprobe in eine 100-Millimeter-Petrischale geben, die mit Kaltschneidepuffer gefüllt ist, und die Schale bei 4 Grad Celsius auf eine Kühlplatte legen. Entfernen Sie endokardiale Trabekula, indem Sie das Endokard mit einer Pinzette halten, und schneiden Sie dann mit einer Schere etwa 3 Millimeter Endokardgewebe ab.
Fixieren Sie die geschnittene Gewebeprobe, endokardial seitlich bis zu einem 2 x 2 Zentimeter großen Gummipflaster mit vier 0,9 x 70 Millimeter großen 20-Gauge-Nadeln, die in einer quadratischen Position fixiert sind. Stellen Sie sicher, dass der diagonale Rand jeder Nadelspitze nach innen zeigt, die Fixierung verbessert und Schäden am Myokard verhindert. Schneiden Sie mit einem Skalpell das gesamte überschüssige Gewebe außerhalb der vier Nadelquadrate weg.
Legen Sie die getrimmte Probe mit einer Pinzette für 10 Sekunden auf ein steriles Stück Gewebe, um überschüssigen Schneidepuffer zu entfernen. Als nächstes entfernen Sie die Agarosespritze aus dem Wasserbad und tauchen Sie die Probe in Agarose. Lassen Sie die Agarose fünf Minuten lang auf einer Kühlplatte erstarren.
Die endokardiale Seite der Probe muss in der Agarose sichtbar sein. Legen Sie mit einer Pinzette die epikardiale Seite der in Agarose enthaltenen Probe auf die verklebte Fläche und drücken Sie dann die agarosehaltige Probe vorsichtig mit einem stumpfen Werkzeug von oben, ohne die Agarose zu schneiden oder zu beschädigen. Lassen Sie den Kleber für 1 Minute erstarren.
Stellen Sie die Schwingungsamplitude auf 1 Millimeter, die anfängliche Schnittgeschwindigkeit auf 0,07 Millimeter pro Sekunde und die Dicke der Scheibe auf 300 μm ein. Nachdem Sie das Anbausystem an einen Computer angeschlossen haben, starten Sie das entsprechende Softwareprogramm. Stellen Sie die Wippgeschwindigkeit auf 60 U / min ein und stellen Sie die Stimulationsparameter vor.
Stellen Sie für menschliche Herzschnitte die Standardstimulation auf biphasische Impulse mit 50 Milliampere oder Strom ein, die aus 3 Millisekunden positivem Strom, 1 Millisekunde Pause und einem 3-Millisekunden-Impuls mit invertiertem Strom bei einer Schrittfrequenz von 30 Schlägen pro Minute oder bpm bestehen, überprüfen Sie dann die Elektrodenanzeigen der Software und überprüfen Sie, ob die Elektroden der Kultivierungskammern korrekt funktionieren. Trennen Sie mit einer Pinzette die Agarose vom Gewebe. Vermeiden Sie es, das Gewebe zu berühren und behandeln Sie es vorsichtig, da jede Schädigung des Gewebes die Erfolgsrate der Kultivierung verringert.
Um zwei Kunststoffdreiecke an einer Probe zu befestigen, geben Sie 1 Mikroliter Kleber auf einen sterilen Petrischalendeckel. Verwenden Sie eine hakenförmige Pinzette, um ein autoklaviertes Kunststoffdreieck aufzunehmen. Tauchen Sie schnell die Vorderkante des Dreiecks in den Kleber und kleben Sie das Dreieck senkrecht zur Kardiomyozytenausrichtung auf die Probe.
Wiederholen Sie den Vorgang für das andere Dreieck. Schneiden Sie mit einem Skalpell das Gewebe ab, das die Dreiecksbreite überschreitet, und legen Sie die Scheibe mit den beiden montierten Dreiecken zurück in die Schneideschale mit dem Schneidepuffer. Entfernen Sie die mediengefüllte Kultivierungskammer aus dem Inkubator.
Wählen Sie eine vorbereitete Scheibe aus und führen Sie sie in die Kammer ein, indem Sie ein Dreieck mit jedem Stift verbinden. Passen Sie den Abstand zwischen den Montagestiften an die Stichprobengröße an. Stellen Sie sicher, dass die Probe in das Medium eingetaucht ist.
Nachdem Sie die Schüssel auf die Wippe gelegt haben, verringern Sie die Vorspannung, indem Sie die Einstellschraube gegen den Uhrzeigersinn drehen, bis sich die Grundlinie des entsprechenden Diagramms auf dem Computerbildschirm nicht mehr ändert, und erhöhen Sie dann vorsichtig die Vorspannung oder Spannung, indem Sie die Einstellschraube im Uhrzeigersinn drehen. Fahren Sie bei Kammern mit hoher Steifigkeit fort, bis die entsprechende Baseline im Diagramm um 1.000 bis 1.200 Einheiten gestiegen ist, was einer Millinewton-Vorspannung entspricht. Nach der Zubereitung des frischen Kulturmediums das Medium in einem Wasserbad oder Heißluftinkubator bei 37 Grad Celsius für 30 bis 45 Minuten vorwärmen.
Entfernen Sie das Medium aus der Kammer, wobei Sie etwa 0,8 Milliliter in der Kammer verbleiben, und fügen Sie dann 1,6 Milliliter frisches Medium in dieselbe Kammer hinzu, wodurch ein Gesamtvolumen von Medium bis 2,4 Milliliter pro Kammer entsteht. Legen Sie schließlich die Abdeckung der Kammer zurück und stellen Sie die Kultivierungskammer in ihre jeweilige Position. Das Auslesen der Kontraktion von fünf Myokardschnitten während einer typischen Stimulation bestand aus vier verschiedenen Abschnitten der Potenzierung nach der Pause, der Stimulationsschwelle, der Kraft-Frequenz-Beziehung und der Refraktärperiode.
Im Vergleich zur Kontrolle war die Kontraktionskraft der mit Calciumantagonisten, Nifedipin und Calciseptin behandelten Scheiben, innerhalb von 10 Minuten verringert. Im Gegensatz dazu erhöhte der spannungsgesteuerte Kalziumkanal-Agonist Bay-K8644 die Kontraktionskraft. Die post-pausierende Potenzierung der Kontroll- und behandelten Schnitte wurde für die intrazelluläre Calciumfreisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum untersucht.
Das Steuerelement-Slice zeigte keine Änderungen an. In Gegenwart von Calciseptin und Nifedipin führte die Hemmung der L-Typ-Calciumkanäle nach einer Pause von 50 Sekunden zu einer Potenzierung der ersten Kontraktion, was einen höheren relativen Beitrag der intrazellulären Calciumfreisetzung zur totalen Kontraktilität widerspiegelt. Der gegenteilige Effekt wurde bei Bay-K8644 beobachtet, das den Eintritt von extrazellulärem Kalzium über die L-Typ-Calciumkanäle stimuliert.
Bei der Kraft-Frequenz-Beziehungsanalyse wurde keine Änderung in der Kontrollschicht beobachtet. Die Calciseptin-Behandlung änderte nichts an der Fähigkeit des Slices, den Reizen bei einer Erhöhung der Stimulationsfrequenz zu folgen, wenn die Daten vor und nach der Behandlung verglichen wurden. Im Vergleich zu Calciseptin verhinderte Nifedipin eine Erhöhung der Kontraktilität bei höheren Schrittmacherraten und reduzierte die maximale Abscheidungsrate bei 80 bpm.
Bei Bay-K8644 wurde eine erhöhte Kontraktionskraft bei sehr niedrigen Stimulationsfrequenzen beobachtet. Bei Frequenzen von mehr als 50 bpm war die Kontraktionskraft jedoch geringer als während des Vorbehandlungszustands. Ausgeschnittenes Gewebe sollte schnell auf 4 Grad Kardioplegie übertragen werden.
Nach dem Schneiden müssen Kunststoffdreiecke senkrecht zur Faserrichtung angebracht werden. Die Vorspannung sollte 1500 Millinewton nicht überschreiten. Die biomimetische Schnittkultur kann Forschern helfen, genetische Manipulationen sowie zellbasierte Therapien zur Untersuchung der Regeneration und Reparatur bei erwachsenen menschlichen Myokarden einzusetzen.
