Wir danken dem National Institute on Aging (K99/R00 AG055683 bis JMR), dem George and Anne Ryan Institute for Neuroscience (EP, GC, JMR), dem College of Pharmacy an der University of Rhode Island (EP, GC, JMR) und Konung Gustaf V:s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse (JMR). Wir danken der Doktorandin Rebecca Senft, die bei Professor Susan Dymecki, Department of Genetics, Harvard Medical School, trainiert hat, für die Einführung in die Free-Floating-Methode. Einige Bilder, die in Abbildung 1 verwendet werden, stammen aus Quellen, die "frei zu verwenden, zu teilen oder zu modifizieren, auch kommerziell" sind: Maus und Mikrozentrifugenröhrchen (Pixabay), Mausgehirn (Jonas Töle, Wikimedia Commons), Kryostat und Mausgehirn (DataBase Center for Life Science, Wikimedia Commons), Glasbehälter (OpenClipart, FreeSvg.org) und Mikroskop (Theresa Knott, Open Clip Art Library).

1. Gewebevorbereitung für die Kryosektion
<ol><li>Fixiertes Gewebe in eine geeignete Einbettform einbetten (siehe Materialtabelle), um einen Probenblock mit einer geeigneten Probenmatrix zu erzeugen (siehe Materialtabelle) und auf Trockeneis einfrieren. Lagern Sie Probenblöcke bei -80 °C, bis sie zum Schneiden bereit sind. ANMERKUNG: Festsitzende Gewebe werden in der Regel durch Perfusionierung von erwachsenen (ca. 2,5 – 30 Monate alten) männlichen oder weiblichen Nagetieren (Maus oder Ratte)34 in Übereinstimmung mit der verfügbaren ethischen Erlaubnis mit einem geeigneten Fixiermittel (z. B. 10 % Formalin) hergestellt, gefolgt von nachfixierenden Geweben in demselben Fixiermittel für 12 h bei 4 °C, wobei das Gewebe dreimal mit 1x PBS gewaschen wird. und Gewebe in 15% und dann 30% Saccharose in 1x PBS über Nacht oder bis das Gewebe35 sinkt. Forscher können versuchen, dieses allgemeine Protokoll an verschiedene Entwicklungsstadien anzupassen.</li>
</ol>2. Kryosektion
<ol><li>Wenn Sie zum Schnitt bereit sind, akklimatisieren Sie die Proben vor dem Schneiden mindestens 1-2 h im Kryostaten, um ein Zerbrechen des Gewebes zu verhindern.</li>
	<li>Schneiden Sie das Gewebe mit einem Kryostaten in Abschnitte (20-50 μm) und sammeln Sie es in 6- oder 12-Well-Einsätzen (siehe Materialtabelle), die mit 1x PBS-Lösung gefüllt sind. HINWEIS: Abhängig von der Dicke des Abschnitts, der Menge des zu sammelnden Gewebes und der Anzahl der verwendeten Vertiefungseinsätze enthält jede Vertiefung eine variable Anzahl von Abschnitten, die sich über etwa 10 bis 40 Schichten erstreckt. Wenn zum Beispiel ein ganzes Gehirn bei 40 μm geschnitten wird, werden in jeder Vertiefung etwa 18-24 Abschnitte mit 12-Well-Einsätzen gesammelt. Außerdem können 20-μm-Abschnitte etwas schwierig zu handhaben sein, daher werden 40 μm für die Bulk-Färbung empfohlen (siehe Diskussion).</li>
</ol>3. Speichern von Abschnitten
<ol><li>Nach dem Sammeln die Abschnitte mit frisch zubereitetem 1x PBS für 5 min waschen. Wiederholen Sie 3 mal.</li>
	<li>Die Schnitte werden in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt, die mit 1-1,5 mL Aufbewahrungslösung gefüllt sind (für 250 ml 70 g Saccharose, 75 ml Ethylenglykol mischen und mit 0,1 M Phosphatpuffer zum Volumen bringen).</li>
	<li>Bei -80 °C bis zur Färbung lagern.</li>
</ol>4. Färbung Tag I
<ol><li>Proben aus dem Gefrierschrank nehmen und bei Raumtemperatur (RT) für 10 - 20 min äquilibrieren.</li>
	<li>Gießen Sie Abschnitte in einen Brunneneinsatz in einer 6-Well-Platte, um die Speicherlösung von den Abschnitten zu trennen.</li>
	<li>Schieben Sie den Well-Einsatz in eine andere Vertiefung, die ca. 6 ml 1x TBS enthält. Waschen Sie 3 mal mit 1x TBS für jeweils 5 min auf einem Orbitalschüttler mit niedriger Geschwindigkeit bei RT.</li>
	<li>Während der Schnitte gewaschen werden, bereiten Sie 7 ml (pro Probe) einer blockierenden permeabilisierenden Lösung vor, die aus 1x TBS mit 0,3% Triton X-100 und 3% normalem Serum (z. B. normalem Pferdeserum) besteht. Blockieren Sie Abschnitte für 30 Minuten bei RT auf Orbitalschüttler mit niedriger Geschwindigkeit. HINWEIS: Die Blockierung mit Seren verhindert die unspezifische Bindung von Antikörpern an Gewebe oder unspezifische Fc-Rezeptoren – ein Serum, das der Spezies des sekundären Antikörpers entspricht, wird empfohlen, aber wenn nicht verfügbar, kann ein normales Serum von einer anderen Spezies als dem primären Antikörper-Wirtstier verwendet werden. Das Reinigungsmittel Triton X-100 ermöglicht eine bessere Penetration der Antikörper durch Permeabilisierung des Gewebes.</li>
	<li>Bereiten Sie 1 ml pro Probe einer primären Antikörperlösung, bestehend aus ausgewählten Primärantikörpern (entsprechend verdünnt) in 1x TBS mit 0,3 % Triton X-100 und 1 % normalem Serum vor (siehe Hinweis zu Schritt 4.4). Transferschnitte aus dem Bohrloch in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das die primäre Antikörperlösung enthält, um an die interessierenden Antigene zu binden. HINWEIS: Es können mehrere primäre Antikörper verwendet werden (die in verschiedenen Wirtsspezies erzeugt werden).</li>
	<li>Das 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schnitten wird mit niedriger Drehzahl (z. B. Drehzahl 7 U/min) auf einen rotierenden Mischer gestellt und über Nacht für 12-16 h bei 4 °C inkubiert.</li>
</ol>5. Färbetag II
<ol><li>Gießen Sie am nächsten Tag Schnitte in eine Vertiefung in einer 6-Well-Platte, um die Abschnitte von der primären Antikörperlösung zu trennen. HINWEIS: Antikörperlösung kann gesammelt und wiederverwendet werden; Fügen Sie 0,02% (w/v) Natriumazid hinzu, um das mikrobielle Wachstum zu hemmen.</li>
	<li>Sektionen 3 mal mit 1x TBS bei RT waschen (30 s für die ersten 2 Wäschen und 10 min für die Endwäsche).</li>
	<li>Bereiten Sie 1 ml pro Probe einer sekundären Antikörperlösung, bestehend aus geeigneten sekundären Antikörpern (entsprechend verdünnt) in 1x TBS mit 0,3% Triton X-100 und 1% normalem Serum (Lichtschutzlösung) vor. HINWEIS: Die indirekte Markierung mit einem konjugierten sekundären Antikörper verstärkt das Signal und ermöglicht eine kolorimetrische oder fluoreszierende Visualisierung des Proteinziels.</li>
	<li>Überführen Sie die Schnitte in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit sekundärer Antikörperlösung. Inkubieren Sie für 2 h bei RT auf einem Orbitalschüttler mit niedriger Geschwindigkeit (Abschirmlösung vor Licht).</li>
	<li>Gießen Sie Schnitte in eine Vertiefung in einer 6-Well-Platte, um Abschnitte von der sekundären Antikörperlösung zu trennen.</li>
	<li>Um die Proben weiterhin vor Licht zu schützen, waschen Sie 2 mal mit 1x TBS für 30 s bei RT. Anschließend 15 min in 1x TB waschen, nach Belieben DAPI (1-0,1 μg/ml) hinzufügen.</li>
</ol>6. Montage
<ol><li>Gießen Sie Schnitte in eine rechteckige histologische Glaskammer, die zu drei Vierteln mit 1x TBS gefüllt ist.</li>
	<li>Tauchen Sie einen Glasträger in den 1x TBS und verwenden Sie einen feinen Pinsel, um die Abschnitte in Richtung der Folie zu locken.</li>
	<li>Klopfen Sie die Abschnitte vorsichtig auf die Schiene und achten Sie darauf, dass keine Falten oder Falten vorhanden sind.</li>
	<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Abschnitte auf den Schienen montiert sind. ANMERKUNG: Wenn z.B. ein ganzes Gehirn bei 40 μm geschnitten wird, gesammelt in 12-Well-Inserts, wobei ein Aliquot 18-24 Abschnitte enthält; Slices werden in der Regel auf 1-2 Folien montiert, aber je nach Präferenz des Forschers können auch weniger Abschnitte pro Folie montiert werden.</li>
</ol>7. Coverslipping
<ol><li>Nachdem die Abschnitte auf den Objektträgern getrocknet sind, etwa 10-15 Minuten bei RT oder bis die Abschnitte undurchsichtig aussehen (denken Sie daran, die Objektträger vor Licht zu schützen), tragen Sie ein geeignetes wässriges Einbettmedium auf (aushärtend oder nicht aushärtend). Antifading wird bevorzugt, wenn ein fluoreszierender konjugierter sekundärer Antikörper verwendet wird. HINWEIS: Die Fluoreszenzqualität kann bei Verwendung eines aushärtenden Einbettmediums geringer sein, aber die Objektträger sollten länger halten.</li>
	<li>Legen Sie mit einer Pinzette ein Deckglas auf das Medium. Decken Sie das Gerät mit Filterpapier ab und drücken Sie es fest an, um überschüssiges Befestigungsmedium zu entfernen. HINWEIS: Wenn Sie eine nicht aushärtende Halterung verwenden, streichen Sie die Kanten des Deckglas-Objektträgers mit klarem Nagellack zum Versiegeln.</li>
	<li>Bildausschnitte mit einem geeigneten Mikroskop. In einem dunklen Schieberkasten bei 4 °C lagern. HINWEIS: Schnitte können mit einer Vielzahl von Mikroskopen abgebildet werden, z. B. mit konfokaler und inverser Laserscanning- oder aufrechter Weitfeldfluoreszenz, bei Vergrößerungen (z. B. 10x, 20x, 40x), je nach den Bedürfnissen des Forschers.</li>
</ol>

<ol>
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Nichts zu verraten

Die Immunhistochemie (IHC) ist eine vielseitige Technik, die für die Identifizierung der Proteinexpression und -lokalisation in Gewebeschnitten von entscheidender Bedeutung ist. Dieser Assay wird in der gesamten wissenschaftlichen Gemeinschaft verwendet, um die Eigenschaften von Gewebe über Stadien der normalen Funktion bis hin zu Krankheitszuständen besser zu verstehen. IHC wird in einer Vielzahl von Bereichen eingesetzt, von der klinischen Diagnose von Krankheiten wie Krebs bis hin zu ersten Entdeckungen in der prä...

Die Immunfärbung ist eine populäre Forschungspraxis, die vor 130 Jahren mit der Entdeckung von Serumantikörpern im Jahr 1890 durch von Behring1 begann. Während des frühen 20. Jahrhunderts wurden Farbstoffe an Antigene und später an Antikörper gebunden, um Reaktionen zu quantifizieren und zu visualisieren1, und 1941 entwickelte Albert Coons die ersten fluoreszierenden Antikörpermarkierungen, eine Entdeckung, die die Lichtmikroskopie revolutionierte 2,3. Der Begriff "Immunfärbung" umfasst viele Techniken, die nach diesem Prinzip entwickelt wurden, einschließlich Western Blot, Durchflusszytometrie, ELISA, Immunzytochemie und Immunhistochemie 3,4. Western Blot weist das Vorhandensein bestimmter Proteine aus Gewebe- oder Zellextraktennach 5. Proteine werden mittels Gelelektrophorese nach Größe getrennt, auf eine Membran übertragen und mit Antikörpern untersucht. Diese Technik zeigt das Vorhandensein von Protein an und wie viel Protein vorhanden ist. Es gibt jedoch keine Informationen über die Lokalisation des Proteins in Zellen oder Geweben. Eine andere Methode, die Immunzytochemie (ICC), markiert Proteine in Zellen, typischerweise Zellen, die in vitro kultiviert werden. ICC zeigt sowohl die Proteinexpression als auch die Lokalisation innerhalb zellulärer Kompartimente6. Um ein spezifisches Protein auf Gewebeebene zu erkennen und sichtbar zu machen, wird die Immunhistochemie (IHC) eingesetzt.
IHC ist eine Methode, die Forscher verwenden, um spezifische Antigene im Gewebe zu bekämpfen und dabei die chemischen Eigenschaften des Immunsystems zu nutzen 7,8. Durch die Erzeugung spezifischer primärer und sekundärer Antikörper, die entweder an ein Enzym oder einen Fluoreszenzfarbstoff gebunden sind, können interessante Antigene in den meisten Geweben markiert und nachgewiesen werden (wie in Mepham und Britten beschrieben)9. Der Begriff "Immunhistochemie" an sich spezifiziert nicht die Markierungsmethode, die verwendet wird, um das interessierende Antigen zu enthüllen; Daher wird diese Terminologie oft mit der Detektionstechnik kombiniert, um die Markierungsmethode klar abzugrenzen: chromogene Immunhistochemie (CIH), um anzuzeigen, wann der sekundäre Antikörper an ein Enzym wie Peroxidase konjugiert ist; oder fluoreszierende IHC, um anzuzeigen, wann der sekundäre Antikörper an ein Fluorophor wie Fluoresceinisothiocyanat (FITC) oder Tetramethylrhodamin (TRITC) konjugiert ist. Die Selektivität der IHC ermöglicht es Klinikern und Forschern, die Proteinexpression und -verteilung in verschiedenen Geweben über verschiedene Gesundheits- und Krankheitszustände hinweg zu visualisieren10. Im klinischen Bereich wird IHC häufig zur Diagnose von Krebs sowie zur Bestimmung von Unterschieden bei verschiedenen Krebsarten eingesetzt. IHC wurde auch verwendet, um verschiedene Arten von mikrobiellen Infektionen im Körper zu bestätigen, wie Hepatitis B oder C11. In der biomedizinischen Forschung wird IHC häufig verwendet, um die Proteinexpression in Geweben abzubilden und ist wichtig für die Identifizierung abnormaler Proteine, die in Krankheitszuständen beobachtet werden. Zum Beispiel geht die Neurodegeneration oft mit einer Anhäufung abnormaler Proteine im Gehirn einher, wie z. B. Αβ-Plaques und neurofibrilläre Verwicklungen bei der Alzheimer-Krankheit. Tiermodelle werden dann oft entwickelt, um diese pathologischen Zustände nachzuahmen, und IHC ist eine Methode, die Forscher verwenden, um die interessierenden Proteine zu lokalisieren und zu quantifizieren10,12,13. Im Gegenzug können wir mehr über die Ursachen dieser Krankheiten und die Komplikationen, die mit ihnen auftreten, erfahren.
Es gibt viele Schritte, die bei der Durchführung von IHC erforderlich sind. Zuerst wird das interessierende Gewebe gesammelt und für die Färbung vorbereitet. Die meisten Forscher präparieren wohl fixierte Gewebeproben, wobei die Perfusion des Fixiermittels über das Kreislaufsystem optimal ist, da es die Morphologie bewahrt14,15. Eine nachträgliche Fixierung von Gewebeproben kann ebenfalls verwendet werden, kann jedoch zu weniger als idealen Ergebnissen führen16. Vernetzende Fixiermittel wie Formaldehyd wirken, indem sie chemische Bindungen zwischen Proteinen im Gewebeherstellen 17. Fixiertes Gewebe wird dann mit einem Mikrotom in sehr dünne Schichten oder Abschnitte geschnitten, wobei viele Forscher es vorziehen, gefrorene Abschnitte mit einem Kryostaten zu sammeln. Von dort wird das Gewebe gesammelt und entweder direkt auf einen Objektträger montiert (Slide-Mounted-Methode) oder in einer Lösung suspendiert (Free-Floating-Methode), wie z.B. phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)18. Die verwendete Erfassungsmethode wird auf der Grundlage der Bedürfnisse des Forschers festgelegt, wobei jede dieser beiden Methoden ihre eigenen Vor- und Nachteile aufweist.
Die Slide-Mounted-Methode ist mit Abstand die am weitesten verbreitete, mit einem wichtigen Vorteil, dass sehr dünne Schnitte (10-14 μm) hergestellt werden können, was z.B. wichtig ist, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Es gibt auch eine minimale Handhabung der Probe, was eine mögliche Schädigung der strukturellen Integrität des Gewebesverringert 19. Forscher verwenden diese Technik häufig mit frischem gefrorenem Gewebe (Gewebe, das sofort mit Trockeneis, Isopentan usw. eingefroren wird), das im Vergleich zu festem Gewebe sehr empfindlich ist und viel Sorgfalt walten lässt, um ein Auftauen der Probe zu verhindern. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von auf Objektträgern montierten Abschnitten besteht darin, dass in der Regel keine großen Mengen an Lösungen für die Färbung benötigt werden4. So können Forscher eine kleinere Menge teurer Antikörper oder anderer Chemikalien verwenden, um die Färbung zu vervollständigen. Darüber hinaus ist es möglich, Schnitte aus mehreren verschiedenen Versuchsgruppen auf demselben Dia zu montieren, was insbesondere bei der Bildaufnahme von Vorteil sein kann. Auf der anderen Seite gibt es einige Nachteile bei der Verwendung von Objektträgerschnitten, vor allem, dass der Gewebeschnitt auf dem Objektträger haftet, wodurch das Eindringen von Antikörpern auf eine Seite des Abschnitts beschränkt wird, was die Schnittdicke und die 3D-Darstellung des Gewebes begrenzt. Es kann auch vorkommen, dass sich beim Waschen die Ränder des Gewebes und ganze Abschnitte vom Objektträger lösen und das gesamte Experiment unbrauchbar machen. Darüber hinaus muss die IHC in der Regel relativ schnell durchgeführt werden, wenn der Objektträgeransatz verwendet wird, um einen Abbau des Antigenepitops 20,21 zu vermeiden, wobei unverarbeitete Objektträger typischerweise bei -20 oder -80 °C gelagert werden, oft abgedeckt und horizontal oder in Objektträgerkästen gelagert werden, was zu einem relativ großen Speicherbedarf führt. Schließlich kann die Slide-Mounted-Technik auch zeitaufwendig sein, wenn Forscher eine große Anzahl von Objektträgern handhaben müssen, um eine große Anzahl von Gewebeschnitten zu verarbeiten.
Aufgrund einiger dieser Herausforderungen bei der Verwendung der Slide-Mounted-Methode ist eine Modifikation, die als Free-Floating-Methode bezeichnet wird, zu einer beliebten Alternative geworden. Diese Technik kam in den 1960-70er Jahren in die Literatur 22,23,24 und gewann in den 1980er Jahren an Popularität 25,26,27,28,29 und ist heute eine etablierte Methode, bei der die Färbung auf den gesammelten Abschnitten in Suspension durchgeführt wird, anstatt an einem Objektträger zu haften 12,30,31 . Die Free-Floating-Methode wird nicht empfohlen, wenn die Gewebeschnitte kleiner als 20 μm sind. Unserer Erfahrung nach ist es jedoch der Ansatz der Wahl, wenn dickere (40-50 μm) Abschnitte gefärbt werden sollen. Ein deutlicher Vorteil besteht darin, dass Antikörper frei schwebende Abschnitte aus allen Winkeln durchdringen können und aufgrund eines effektiveren Waschens weniger Hintergrundfärbung erzeugen, was zu einer besseren Signalübertragung bei der Bildgebung führt. Darüber hinaus werden die Schnitte nach der Verarbeitung auf die Objektträger montiert, wodurch die Möglichkeit einer Gewebeablösung ausgeschlossen wird und die Verweildauer des Kryostaten verringert wird. Die Free-Floating-Methode kann auch viel weniger arbeitsintensiv sein, insbesondere für groß angelegte biomedizinische Studien. Zum Beispiel ist es möglich, viele (18-40) Schnitte aus derselben Probe zusammen in derselben Vertiefung zu färben, was Zeit bei der Durchführung der Wasch- und Antikörperinkubationsschritte spart. Da mit diesem Ansatz eine größere Anzahl (12-16) von Schnitten pro Folie montiert werden kann, ist es für den Forscher oft bequemer und schneller, Schnitte anzuzeigen und abzubilden. Insbesondere bei der Montage von Gewebeschnitten auf den Objektträgern können Abschnitte befestigt und abgenommen werden, bis die gewünschte Orientierung erreicht ist. Die Forscher verwenden auch oft etwas niedrigere Konzentrationen von Antikörpern mit der Free-Floating-Methode, und da die Inkubationen in Mikrozentrifugenröhrchen durchgeführt werden, können die Antikörper leicht gesammelt und mit Natriumazid für die Wiederverwendung konserviert werden (siehe Schritt 5.1). Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass die Schnitte direkt bei -80 °C in kleinen Mikrozentrifugenröhrchen mit kryoprotektiver Lösung32 gelagert werden können, wodurch der Lagerraum minimiert und die Langlebigkeit der Proben33 maximiert wird. Ein Nachteil dieser Technik ist, dass die Abschnitte viel gehandhabt werden und daher anfällig für Beschädigungen sind. Dies kann jedoch durch niedrige Schüttel- und Drehgeschwindigkeiten sowie durch eine angemessene Schulung der Forscher für den Transfer der Proben und die Montage der Abschnitte auf den Objektträgern gemildert werden.
Zusammengenommen ist IHC ein etabliertes, essentielles Werkzeug für die Visualisierung und Lokalisierung der Proteinexpression sowohl in der klinischen als auch in der biomedizinischen Forschung. Free-floating-IHC ist eine effiziente, flexible und wirtschaftliche Methode, insbesondere bei der Durchführung umfangreicher histologischer Studien. Hier stellen wir ein zuverlässiges, frei schwebendes fluoreszierendes IHC-Protokoll für die wissenschaftliche Gemeinschaft vor, das entsprechend für chromogene IHC- und andere Färbungen wie Hämatoxylin- und Eosin- oder Kresylviolettfärbung angepasst werden kann.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding molds</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF98-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum, heat inactivated</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide boxes</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>71370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-081</td>
			<td>24 x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular staining dish</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>70312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round artist paintbrush #2</td>
			<td>Princeton Select Series</td>
			<td>3750R</td>
			<td>Brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen matrix for embedding</td>
			<td>OCT Tissue-Tek, Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stain tray &#8211; slide staining system</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>71396-B</td>
			<td>Use dark lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Micro Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield antifade mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Non-hardening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well inserts for 12-well plates</td>
			<td>Corning Netwells</td>
			<td>3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well inserts for 6-well plates</td>
			<td>Corning Netwells</td>
			<td>3479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>WHA1440042</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

histological-based stainings using free-floating tissue sections

Die Immunhistochemie ist eine weit verbreitete Technik zur Visualisierung spezifischer Gewebestrukturen sowie der Proteinexpression und -lokalisation. Zwei alternative Ansätze werden häufig verwendet, um die Gewebeschnitte während des Färbeverfahrens zu handhaben, ein Ansatz besteht darin, die Abschnitte direkt auf Glasobjektträgern zu montieren, während ein zweiter Ansatz, der freischwebende Ansatz, es ermöglicht, feste Abschnitte zu erhalten und zu färben, während sie in Lösung suspendiert sind. Obwohl Slide-Mounted- und Free-Floating-Ansätze zu ähnlichen Ergebnissen führen können, ermöglicht die Free-Floating-Technik eine bessere Penetration von Antikörpern und sollte daher die Methode der Wahl sein, wenn dickere Schnitte für die 3D-Rekonstruktion des Gewebes verwendet werden sollen, zum Beispiel wenn der Fokus des Experiments darauf liegt, Informationen über dendritische und axonale Projektionen in Hirnregionen zu gewinnen. Da die Schnitte in Lösung gehalten werden, können in einem einzigen Aliquot problemlos 30 bis 40 Schnitte aufgenommen werden, deren Handhabung insbesondere bei groß angelegten biomedizinischen Studien weniger aufwendig ist. Hier zeigen wir, wie die Free-Floating-Methode auf die fluoreszierende immunhistochemische Färbung angewendet werden kann, wobei der Schwerpunkt auf Hirnschnitten liegt. Wir werden auch diskutieren, wie die Free-Floating-Technik leicht modifiziert werden kann, um den individuellen Bedürfnissen der Forscher gerecht zu werden und an andere Gewebe sowie andere histochemische Färbungen wie Hämatoxylin, Eosin und Kresylviolett anzupassen, solange die Gewebeproben richtig fixiert werden, typischerweise mit Paraformaldehyd oder Formalin.

Das Gesamtschema der Verwendung der Free-Floating-Methode zur Durchführung eines fluoreszierenden immunhistochemischen Assays ist in Abbildung 1 dargestellt. Ein repräsentatives Beispiel für eine fluoreszierende IHC unter Verwendung der Free-Floating-Methode im Gehirn von Mäusen, bei der die Expression des sauren Gliafibrillenproteins (GFAP) untersucht wird, ist in Abbildung 2 sowohl bei niedrigerer als auch bei höherer Vergrößerung dargestellt, um die Ge...

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Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections

Die Free-Floating-Technik ermöglicht es Forschern, histologisch basierte Färbungen einschließlich Immunhistochemie an festen Gewebeschnitten durchzuführen, um biologische Strukturen, Zelltypen sowie Proteinexpression und -lokalisation sichtbar zu machen. Dies ist eine effiziente und zuverlässige histochemische Technik, die für die Untersuchung einer Vielzahl von Geweben wie Gehirn, Herz und Leber nützlich sein kann.

Histologische Färbungen mit frei schwebenden Gewebeschnitten

Immunohistochemistry is a widely used technique to visualize specific tissue structures as well as protein expression and localization. Two alternative ...

histological-based-stainings-using-free-floating-tissue-sections

Research

JoVE Journal

Biology

17.6K Aufrufe.  University of Rhode Island. Die Free-Floating-Technik ermöglicht es Forschern, histologisch basierte Färbungen einschließlich Immunhistochemie an festen Gewebeschnitten durchzuführen, um biologische Strukturen, Zelltypen sowie Proteinexpression und -lokalisation sichtbar zu machen. Dies ist eine effiziente und zuverlässige histochemische Technik, die für die Untersuchung einer Vielzahl von Geweben wie Gehirn, Herz und Leber nützlich sein kann.

Serie: Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific antibodies. There are two methods: the direct and indirect method. In this experiment, we will only describe the use of indirect IHC staining. Indirect IHC staining utilizes highly specific primary and biotin-conjugated secondary antibodies. Primary antibodies are utilized to discretely identify proteins of interest by binding to a specific epitope, while secondary antibodies subtract for non-specific background staining and amplify signal by forming complexes to the primary antibody. Slides can either be generated from frozen sections, or paraffin embedded sections mounted on glass slides. In this protocol, we discuss the preparation of paraffin-embedded sections by dewaxing, hydration using an alcohol gradient, heat induced antigen retrieval, and blocking of endogenous peroxidase activity and non-specific binding sites. Some sections are then stained with antibodies specific for T cell marker CD8 and while others are stained for tyrosine hydroxylase. The slides are subsequently treated with appropriate secondary antibodies conjugated to biotin, then developed utilizing avidin-conjugated horseradish peroxidase (HRP) with Diaminiobenzidine (DAB) as substrate. Following development, the slides are counterstained for contrast, and mounted under coverslips with permount. After adequate drying, these slides are then ready for imaging.

Immunhistochemie: Paraffin Schnitte mit der Vectastain ABC Kit von Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Forschung

Biologie

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

Immunhistochemie auf Paraffinschnitten von Mouse Epidermis unter Verwendung von fluoreszierenden Antikörper

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is determined. Conventional preparation of tissues for PCR-ready DNA often take several hours to days, depending on the tissue sample. The genotype of the sample may thus be delayed for several days, which is not an option for many different types of experiments. Here we demonstrate the complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR Kit. First, we demonstrate the fifteen-minute extraction of DNA from the tissue sample. Then, we demonstrate the real time read-out of the PCR amplification of the sample, which allows for the identification of a positive sample as it is being amplified. Together, the rapid extraction and real-time readout allow for a prompt identification of genotype of a variety different types of tissues through the reliable method of PCR.

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma&#039;s Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

The complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, is done in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR kit.

Schnelle Genotypisierung von Maus Tissue Mit Sigma Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is ...

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Aktin Co-Sedimentation Assay; für die Analyse von Protein-Bindung an F-Aktin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Paraffin-Embedded-und Gefrierschnitte von Drosophila Adult Muskeln

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at different developmental stages. Epigenetic regulation contributes to a broad spectrum of biological processes, including cellular differentiation during embryonic development and homeostasis in adulthood. A critical strategy in epigenetic studies is to examine how various histone modifications and chromatin factors regulate gene expression. To address this, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) is used widely to obtain a snapshot of the association of particular factors with DNA in the cells of interest.
ChIP technique commonly uses cultured cells as starting material, which can be obtained in abundance and homogeneity to generate reproducible data. However, there are several caveats: First, the environment to grow cells in Petri dish is different from that in vivo, thus may not reflect the endogenous chromatin state of cells in a living organism. Second, not all types of cells can be cultured ex vivo. There are only a limited number of cell lines, from which people can obtain enough material for ChIP assay.
Here we describe a method to do ChIP experiment using Drosophila tissues. The starting material is dissected tissue from a living animal, thus can accurately reflect the endogenous chromatin state. The adaptability of this method with many different types of tissue will allow researchers to address a lot more biologically relevant questions regarding epigenetic regulation in vivo1, 2. Combining this method with high-throughput sequencing (ChIP-seq) will further allow researchers to obtain an epigenomic landscape.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recently high-throughput sequencing technology has greatly increased sensitivity of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment and prompted its application using purified cells or dissected tissue. Here we delineate a method to use ChIP technique with Drosophila tissue, which can address the endogenous chromatin state in a well-characterized biological system.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) mit Drosophila Gewebe

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

Ein schnelles automatisiertes Protokoll zur Muskelfaser Populationsanalyse in Rattenmuskelquerschnitte Mit Myosin Heavy Chain Immunhistochemie

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

Use of Anti-phospho-girdin Antibodies to Visualize Intestinal Tuft Cells in Free-Floating Mouse Jejunum Cryosections

The actin binding protein girdin is a cytosolic protein that is required for actin remodeling to trigger cell migration in various tissues. Girdin is phosphorylated by both receptor and non-receptor tyrosine kinases at tyrosine 1798. Omori et al. developed site- and phosphorylation status-specific antibodies against human girdin at tyrosine-1798 (pY1798), which specifically bind to phosphorylated tyrosine-1798, but not to unphosphorylated tyrosine-1798. pY1798 antibodies have been used to specifically label tuft cells (TCs) that are present in mammalian gastrointestinal tissues, but the function of these cells is unclear. This protocol allows the robust visualization of TCs in the jejunum using pY1798 antibodies and immunofluorescence. To ensure successful and simple TC visualization, this protocol includes two histological techniques: production of free-floating cryosections from gelatin-filled jejunum tissue, and low-temperature antigen retrieval at 50 &#176;C for 3 h. Filling the jejunum with gelatin maintains the shape of free-floating sections throughout the staining procedure, whereas low-temperature antigen retrieval ensures robust signals from TCs. Successful use of this protocol results in pY1798 staining of TCs distributed from villus tip to crypt. Stained TCs have a spool-shaped soma and fluorescent signals condense at the lumenal tip, which corresponds to the protruding &#39;tuft.&#39;&#160;Phalloidin staining colocalized with pY1798-positive TCs at the thickened brush border, and corresponds to a rootlet mass extending from the TC tuft. This protocol could be used to examine TCs in human biopsy samples collected with gastrointestinal endoscopes. Furthermore, TCs were recently reported to accumulate following parasite infection in mice, suggesting that this protocol could have applications for diagnosis of parasite infections in the human gut.

Kuga et al. discovered that phosphorylation-status specific antibodies against the actin binding protein girdin phosphorylated at tyrosine 1798 (pY1798) can be used to label tuft cells (TCs). This protocol allows robust visualization of TCs using immunofluorescent staining of free-floating jejunum cryosections with pY1798 antibodies.

Verwendung von Anti-Phospho-girdin Antikörper gegen Darm Büschel Zellen frei schwebenden Maus Jejunum Cryosections visualisieren

The actin binding protein girdin is a cytosolic protein that is required for actin remodeling to trigger cell migration in various tissues. Girdin is ...

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a mixed cell population in a structured architecture that impacts function, and human islets are widely variable in cell type composition. Current frequently used methods to study cultured islets include molecular studies performed on whole islets, lumping disparate islet cell types together, or microscopy or molecular studies on dispersed islet cells, disrupting islet architecture. For in vivo islet studies, paraffin-embedded pancreas sectioning is a powerful technique to assess cell-specific outcomes in the native pancreatic environment. Studying post-culture islets by paraffin sectioning would offer several advantages: detection of multiple outcomes on the same islets (potentially even the exact-same islets, using serial sections), cell-type-specific measurements, and maintaining native islet cell-cell and cell-substratum interactions both during experimental exposure and for analysis. However, existing techniques for embedding isolated islets post-culture are inefficient, time consuming, prone to loss of material, and generally produce sections with inadequate islet numbers to be useful for quantifying outcomes. Clinical pathology laboratory cell block preparation facilities are inaccessible and impractical for basic research laboratories. We have developed an improved, simplified bench-top method that generates sections with robust yield and distribution of islets. Fixed islets are resuspended in warm histological agarose gel and pipetted into a flat disc on a standard glass slide, such that the islets are distributed in a plane. After standard dehydration and embedding, multiple (10+) 4 - 5 &#181;m sections can be cut from the same islet block. Using this method, histological&#160;and immunofluorescent analyses can be performed on mouse, rat, and human islets. This is an effective, inexpensive, time-saving approach to assess cell-type-specific, intact-architecture outcomes from cultured islets.

Ex vivo pancreatic islet studies are important for diabetes research. Existing techniques to study cultured islets in their native 3-dimensional architecture are time consuming, inefficient, and infrequently used. This work describes a new, simple, and efficient method for generating high-quality paraffin sections of whole cultured islets.

Pancreatic Islet Einbettung für Paraffin Abschnitte

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical applications. Isolating primary melanocytes from skin tissues by the conventional method usually takes about 3 to 4 weeks to passage sufficiently. More importantly, the tissues used are usually newborn foreskins and it is still a challenge to efficiently isolate primary melanocytes from adult tissues. We recently developed a new isolation method for melanocytes that adds Y-27632, a Rho kinase inhibitor, to the initial culture medium for 48 h. Compared with the conventional protocol, this new method dramatically increases the yield of melanocytes and shortens the time required to isolate melanocytes from foreskin tissues. We now describe this new method in more detail using adult epidermis to efficiently culture primary melanocytes. Importantly, we show that melanocytes obtained from adult tissues prepared by this new method can function normally. This new protocol will significantly benefit studies of pigmentation defects and melanomas using primary melanocytes prepared from easily accessed adult skin tissues.

This paper reports that the addition of Y-27632 to TIVA medium can significantly increase the yield of melanocytes from adult skin tissues.