Nous tenons à remercier le National Institute on Aging (K99/R00 AG055683 à JMR), le George and Anne Ryan Institute for Neuroscience (EP, GC, JMR), le College of Pharmacy de l’Université de Rhode Island (EP, GC, JMR) et Konung Gustaf V:s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse (JMR). Nous remercions la doctorante Rebecca Senft, en formation avec le professeur Susan Dymecki, Département de génétique, Harvard Medical School, de nous avoir présenté la méthode de flottaison libre. Certaines images utilisées dans la figure 1 ont été obtenues à partir de sources « libres d’utilisation, de partage ou de modification, même commerciales » : tube de souris et microcentrifugeuse (Pixabay), cerveau de souris (Jonas Töle, Wikimedia Commons), section cryostat et cerveau de souris (DataBase Center for Life Science, Wikimedia Commons), récipient en verre (OpenClipart, FreeSvg.org) et microscope (Theresa Knott, Open Clip Art Library).

1. Préparation tissulaire pour la cryosectionnement
<ol><li>Incorporer les tissus fixes dans un moule d’encastrement approprié (voir le tableau des matériaux) pour créer un bloc d’échantillon à l’aide d’une matrice d’échantillons appropriée (voir le tableau des matériaux) et congeler sur de la glace sèche. Conserver les blocs d’échantillons à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être sectionnés. NOTE: Les tissus fixes sont généralement préparés par des rongeurs adultes (environ 2,5 à 30 mois) mâles ou femelles (souris ou rat)34, conformément au permis éthique disponible, avec un fixateur approprié (par exemple 10% de formol), suivi de post-fixation dans le même fixateur pendant 12 h à 4 °C, en lavant les mouchoirs trois fois avec 1x PBS, et placer les tissus dans 15% puis 30% de saccharose dans 1x PBS pour la nuit ou jusqu’à ce que les tissus coulent35. Les chercheurs peuvent essayer d’adapter ce protocole général à différents stades de développement.</li>
</ol>2. Cryosectionnement
<ol><li>Lorsque vous êtes prêt à sectionner, acclimater les échantillons dans le cryostat pendant au moins 1 à 2 heures avant la section, afin d’éviter l’éclatement des tissus.</li>
	<li>À l’aide d’un cryostat, couper le tissu en sections (20-50 μm) et recueillir dans des inserts de 6 ou 12 puits (voir le tableau des matériaux) remplis de 1x solution de PBS. REMARQUE : Selon l’épaisseur de la section, la quantité de tissu à recueillir et le nombre d’inserts de puits utilisés, chaque puits contiendra un nombre variable de sections allant d’environ 10 à 40 tranches pour le puits. Par exemple, si un cerveau entier est sectionné à 40 μm, environ 18 à 24 sections seront collectées dans chaque puits à l’aide d’inserts de 12 puits. De plus, les sections de 20 μm peuvent être quelque peu difficiles à manipuler, c’est pourquoi 40 μm sont recommandés pour la coloration en vrac (voir Discussion).</li>
</ol>3. Stockage des sections
<ol><li>Une fois recueillies, laver les sections avec 1x PBS fraîchement préparé pendant 5 min. Répétez 3 fois.</li>
	<li>Transférer les sections dans des tubes microcentrifugés de 2 mL remplis de 1 à 1,5 mL de solution de stockage (pour 250 mL, mélanger 70 g de saccharose, 75 mL d’éthylène glycol et porter au volume avec un tampon phosphate de 0,1 M).</li>
	<li>Conserver à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à être taché.</li>
</ol>4. Jour de coloration I
<ol><li>Retirer les échantillons du congélateur et équilibrer à température ambiante (TR) pendant 10 à 20 min.</li>
	<li>Verser les sections dans un insert de puits dans une plaque à 6 puits pour séparer la solution de stockage des sections.</li>
	<li>Déplacer l’insert de puits vers un autre puits contenant environ 6 mL de 1x TBS. Laver 3 fois avec 1x TBS pendant 5 minutes chacun sur un agitateur orbital en utilisant basse vitesse à RT.</li>
	<li>Pendant le lavage des sections, préparer 7 mL (par échantillon) d’une solution bloquante-perméabilisante composée de 1 TBS avec 0,3 % de Triton X-100 et 3 % de sérum normal (p. ex. sérum normal pour cheval). Bloquer les sections pendant 30 min à RT sur agitateur orbital, en utilisant basse vitesse. REMARQUE: Le blocage avec des sérums empêche la liaison non spécifique d’anticorps aux tissus ou aux récepteurs Fc non spécifiques – un sérum correspondant à l’espèce de l’anticorps secondaire est recommandé, mais s’il n’est pas disponible, tout sérum normal d’une espèce différente de l’animal hôte d’anticorps primaire peut être utilisé. Le détergent Triton X-100 permet une meilleure pénétration des anticorps en perméabilisant le tissu.</li>
	<li>Préparer 1 mL par échantillon de solution d’anticorps primaires composée d’anticorps primaires sélectionnés (dilués de manière appropriée) dans 1x TBS avec 0,3% de Triton X-100 et 1% de sérum normal (voir étape 4.4 Note). Transférer les sections de l’insert de puits dans un tube microcentrifuge de 2 mL contenant une solution d’anticorps primaires pour se lier au(x) antigène(s) d’intérêt. REMARQUE : Plusieurs anticorps primaires peuvent être utilisés (générés chez différentes espèces hôtes).</li>
	<li>Placer un tube microcentrifuge de 2 mL avec des sections sur un mélangeur rotatif à basse vitesse (p. ex., vitesse 7 tr/min) et incuber pendant une nuit pendant 12 à 16 h à 4 °C.</li>
</ol>5. Jour II de la coloration
<ol><li>Le lendemain, verser des sections dans un insert de puits dans une plaque à 6 puits pour séparer les sections de la solution d’anticorps primaires. NOTE: La solution d’anticorps peut être recueillie et réutilisée; Ajouter 0,02 % (p/v) d’azoture de sodium pour inhiber la croissance microbienne.</li>
	<li>Lavez les sections 3 fois avec 1x TBS à TA (30 s pour les 2 premiers lavages et 10 min pour le lavage final).</li>
	<li>Préparer 1 mL par échantillon de solution d’anticorps secondaires composée d’anticorps secondaires appropriés (dilués en conséquence) dans 1x TBS avec 0,3% de Triton X-100 et 1% de sérum normal (solution protectrice de la lumière). REMARQUE : Le marquage indirect avec un anticorps secondaire conjugué amplifie le signal et permet une visualisation colorimétrique ou fluorescente de la protéine cible.</li>
	<li>Transvaser les sections dans un tube microcentrifuge de 2 mL contenant une solution d’anticorps secondaire. Incuber pendant 2 h à RT sur agitateur orbital à basse vitesse (solution de protection de la lumière).</li>
	<li>Verser les sections dans un insert de puits dans une plaque à 6 puits pour séparer les sections de la solution d’anticorps secondaire.</li>
	<li>En continuant à protéger les échantillons de la lumière, laver 2 fois avec 1x TBS pendant 30 s à TA. Ensuite, laver pendant 15 min dans 1x TBS, ajouter DAPI (1-0,1 μg/ml) si désiré.</li>
</ol>6. Montage
<ol><li>Versez des sections dans une chambre histologique rectangulaire en verre remplie aux trois quarts de 1x TBS.</li>
	<li>Immergez une lame de verre dans le TBS 1x et utilisez un pinceau fin pour amadouer les sections vers la glissière.</li>
	<li>Tapotez doucement les sections sur la lame, en vous assurant qu’il n’y a pas de rides ou de plis.</li>
	<li>Répétez l’opération jusqu’à ce que toutes les sections soient montées sur la ou les diapositives. REMARQUE : Lorsqu’un cerveau entier, par exemple, est sectionné à 40 μm, recueilli dans des inserts de 12 puits avec une partie aliquote contenant 18 à 24 sections; Les tranches sont généralement montées sur 1-2 lames, mais moins de sections peuvent également être montées par diapositive selon les préférences du chercheur.</li>
</ol>7. Glissade de couverture
<ol><li>Après le séchage des sections sur la ou les lames, environ 10 à 15 minutes à TA ou jusqu’à ce que les sections semblent opaques (n’oubliez pas de protéger les lames de la lumière), appliquez un support de montage aqueux approprié (durcissement ou non). L’antidécoloration est préférable si vous utilisez un anticorps secondaire conjugué fluorescent. REMARQUE: La qualité de fluorescence peut être inférieure lors de l’utilisation d’un support de montage durcisseur, mais les lames doivent durer plus longtemps.</li>
	<li>À l’aide d’une pince à épiler, placez une housse sur le support. Couvrir avec du papier filtre et appuyer fermement pour enlever l’excès de support de montage. REMARQUE: Si vous utilisez un support non durcissant, peignez les bords de la lame couverclée avec du vernis à ongles transparent pour sceller.</li>
	<li>Coupes d’images à l’aide d’un microscope approprié. Conserver dans une boîte à diapositive sombre à 4 °C. REMARQUE : Les coupes peuvent être imagées à l’aide de divers microscopes, tels que la fluorescence confocale et à grand champ à balayage laser inversée ou verticale, à des grossissements (p. ex., 10x, 20x, 40x) en fonction des besoins du chercheur.</li>
</ol>

<ol>
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Rien à divulguer

L’immunohistochimie (IHC) est une technique polyvalente qui est devenue cruciale dans l’identification de l’expression et de la localisation des protéines dans les sections de tissus. Ce test est utilisé dans toute la communauté scientifique pour mieux comprendre les caractéristiques des tissus à travers les stades de la fonction normale jusqu’aux états pathologiques. IHC est employé dans une variété de domaines allant du diagnostic clinique de maladies telles que le cancer aux découvertes initiales dan...

L’immunomarquage est une pratique de recherche populaire qui a commencé il y a 130 ans avec la découverte des anticorps sériques en 1890 par Von Behring1. Au début du 20esiècle, des colorants ont été attachés à des antigènes et plus tard à des anticorps afin de quantifier et de visualiser les réactions1, et en 1941 Albert Coons a développé les premiers marqueurs d’anticorps fluorescents, une découverte qui a révolutionné la microscopie optique 2,3. Le terme « immunomarquage » englobe de nombreuses techniques qui ont été développées en utilisant ce principe, y compris le transfert Western, la cytométrie en flux, l’ELISA, l’immunocytochimie et l’immunohistochimie 3,4. Le transfert Western détecte la présence de protéines spécifiques provenant d’extraits tissulaires ou cellulaires5. Les protéines sont séparées par taille à l’aide d’une électrophorèse sur gel, transférées sur une membrane et sondées à l’aide d’anticorps. Cette technique indique la présence de protéines et la quantité de protéines présentes; Cependant, il ne révèle aucune information sur la localisation de la protéine dans les cellules ou les tissus. Une autre méthode, l’immunocytochimie (ICC), marque les protéines dans les cellules, généralement des cellules cultivées in vitro. ICC montre à la fois l’expression et la localisation des protéines dans les compartiments cellulaires6. Pour détecter et visualiser une protéine spécifique au niveau tissulaire, l’immunohistochimie (IHC) est utilisée.
IHC est une méthode que les chercheurs utilisent pour cibler des antigènes spécifiques dans les tissus, en tirant parti des propriétés chimiques du système immunitaire 7,8. En générant des anticorps primaires et secondaires spécifiques liés à une enzyme ou à un colorant fluorescent, les antigènes d’intérêt peuvent être marqués et révélés dans la plupart des tissus (comme indiqué dans Mepham et Britten)9. Le terme « immunohistochimie » en lui-même ne précise pas la méthode de marquage utilisée pour révéler l’antigène d’intérêt; ainsi, cette terminologie est souvent combinée avec la technique de détection pour délimiter clairement la méthode de marquage : immunohistochimie chromogène (ICH) pour indiquer quand l’anticorps secondaire est conjugué à une enzyme, telle que la peroxydase ; ou IHC fluorescent pour indiquer quand l’anticorps secondaire est conjugué à un fluorophore, tel que l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ou la tétraméthylrhodamine (TRITC). La sélectivité de l’IHC permet aux cliniciens et aux chercheurs de visualiser l’expression et la distribution des protéines dans les tissus, à travers divers états de santé et de maladie10. Dans le domaine clinique, IHC est couramment utilisé pour diagnostiquer le cancer, ainsi que pour déterminer les différences dans divers types de cancer. IHC a également été utilisé pour confirmer différents types d’infections microbiennes dans le corps, telles que l’hépatite B ou C11. Dans la recherche biomédicale, l’IHC est souvent utilisé pour cartographier l’expression des protéines dans les tissus et est important pour identifier les protéines anormales observées dans les états pathologiques. Par exemple, la neurodégénérescence s’accompagne souvent d’une accumulation de protéines anormales dans le cerveau, telles que des plaques Αβ et des enchevêtrements neurofibrillaires dans la maladie d’Alzheimer. Des modèles animaux sont souvent développés pour imiter ces états pathologiques, et IHC est une méthode que les chercheurs utilisent pour localiser et quantifier les protéines d’intérêt10,12,13. À notre tour, nous pouvons en apprendre davantage sur les causes de ces maladies et les complications qui en découlent.
L’exécution de l’IHC comporte de nombreuses étapes. Tout d’abord, le tissu d’intérêt est recueilli et préparé pour la coloration. On peut soutenir que la plupart des chercheurs préparent des échantillons de tissus fixes, la perfusion du fixateur via le système circulatoire étant optimale car elle préserve la morphologie14,15. La post-fixation d’échantillons de tissus peut également être utilisée, mais peut donner des résultats inférieurs à l’idéal16. Les fixateurs de réticulation, tels que le formaldéhyde, agissent en créant des liaisons chimiques entre les protéines du tissu17. Les tissus fixes sont ensuite découpés en couches ou sections très minces à l’aide d’un microtome, de nombreux chercheurs préférant collecter des sections congelées à l’aide d’un cryostat. De là, le tissu est recueilli et soit monté directement sur une lame de microscope (méthode montée sur lame), soit suspendu dans une solution (méthode flottante), telle qu’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)18. La méthode de collecte utilisée est prédéterminée en fonction des besoins du chercheur, chacune de ces deux méthodes présentant ses propres avantages et inconvénients.
La méthode montée sur lame est de loin la plus couramment utilisée, avec un avantage important étant que des sections très minces (10-14 μm) peuvent être préparées, ce qui est important, par exemple, pour étudier les interactions protéine-protéine. La manipulation de l’échantillon est également minimale, ce qui réduit les dommages potentiels à l’intégrité structurelle du tissu19. Les chercheurs utilisent souvent cette technique avec des tissus frais congelés (tissus immédiatement congelés à l’aide de glace sèche, d’isopentane, etc.), ce qui est très délicat par rapport aux tissus fixes et il faut prendre beaucoup de précautions pour empêcher la décongélation de l’échantillon. Un autre avantage de l’utilisation de sections montées sur glissière est que de grands volumes de solutions pour la coloration ne sont généralement pas nécessaires4. Ainsi, les chercheurs peuvent utiliser une plus petite quantité d’anticorps coûteux ou d’autres produits chimiques pour compléter la coloration. De plus, il est possible de monter des sections de plusieurs groupes expérimentaux différents sur la même diapositive, ce qui peut être avantageux, en particulier lors de l’acquisition d’images. D’autre part, l’utilisation de sections montées sur lame présente certains inconvénients, notamment le fait que la section de tissu est collée à la lame, limitant ainsi la pénétration des anticorps d’un côté de la section, ce qui limite l’épaisseur de la section et la représentation 3D du tissu. Il peut également arriver que pendant les lavages, les bords du tissu et des sections entières se détachent de la lame, rendant inutile toute l’expérience. De plus, l’IHC doit généralement être effectuée relativement rapidement lors de l’utilisation de l’approche montée sur lame pour éviter la dégradation de l’épitope de l’antigène 20,21 avec des lames non traitées généralement stockées à -20 ou -80 ° C, souvent glissées et stockées horizontalement ou dans des boîtes à lames, ce qui entraîne un encombrement de stockage relativement important. Enfin, la technique montée sur lame peut également prendre beaucoup de temps si les chercheurs doivent manipuler un grand nombre de lames pour traiter un grand nombre de sections de tissus.
En raison de certains de ces défis utilisant la méthode montée sur glissière, une modification appelée méthode flottante est devenue une alternative populaire. Cette technique est entrée dans la littérature dans les années 1960-70 22,23,24, gagnant en popularité dans les années 1980 25,26,27,28,29, et est maintenant une méthode bien établie qui consiste à effectuer la coloration sur les sections collectées en suspension plutôt que d’adhérer à une lame 12,30,31 . La méthode de flottaison libre n’est pas recommandée lorsque les coupes de tissu sont inférieures à 20 μm; Cependant, d’après notre expérience, c’est l’approche de choix lorsque des sections plus épaisses (40-50 μm) doivent être colorées. Un avantage distinct est que les anticorps peuvent pénétrer les sections flottantes sous tous les angles et générer moins de coloration de fond en raison d’un lavage plus efficace, ce qui entraîne une meilleure signalisation lors de l’imagerie. De plus, les sections sont montées sur les lames après le traitement, éliminant ainsi la possibilité de détachement des tissus et réduisant le temps d’occupation du cryostat. La méthode de flottaison libre peut également être beaucoup moins exigeante en main-d’œuvre, en particulier pour les études biomédicales à grande échelle. Par exemple, il est possible de colorer plusieurs sections (18-40) du même échantillon dans le même puits, ce qui permet de gagner du temps dans les étapes de lavage et d’incubation des anticorps. De plus, étant donné qu’un plus grand nombre (12-16) de sections peuvent être montées par diapositive en utilisant cette approche, il est souvent plus pratique et plus rapide pour le chercheur de visualiser et d’imager les sections. Notamment, lors du montage des tranches de tissu sur les lames, les sections peuvent être attachées et détachées jusqu’à ce que l’orientation souhaitée soit obtenue. Les chercheurs utilisent aussi souvent des concentrations légèrement inférieures d’anticorps en utilisant la méthode de flottaison libre, et comme les incubations sont effectuées dans des tubes de microcentrifugation, les anticorps peuvent être facilement recueillis et conservés avec de l’azoture de sodium pour la réutilisation (voir l’étape 5.1). Un autre avantage est que les sections peuvent être directement stockées à -80 °C dans de petits tubes microcentrifugés avec une solution cryoprotectrice32, minimisant ainsi l’espace de stockage et maximisant la longévité des échantillons33. Un inconvénient de l’utilisation de cette technique est que les sections sont beaucoup manipulées et sont donc susceptibles d’être endommagées. Cependant, cela peut être atténué en utilisant de faibles vitesses d’agitation et de rotation ainsi qu’en formant correctement les chercheurs à transférer les échantillons et à monter les sections sur les lames.
Pris ensemble, IHC est un outil établi et essentiel pour visualiser et localiser l’expression des protéines dans les domaines de la recherche clinique et biomédicale. L’IHC flottant est une méthode efficace, flexible et économique, en particulier lors de la réalisation d’études histologiques à grande échelle. Ici, nous présentons un protocole IHC fluorescent flottant fiable pour la communauté scientifique qui peut être adapté en conséquence pour l’IHC chromogène et d’autres colorations telles que l’hématoxyline et l’éosine ou la coloration au violet de crésyle.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding molds</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF98-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum, heat inactivated</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide boxes</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>71370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-081</td>
			<td>24 x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular staining dish</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>70312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round artist paintbrush #2</td>
			<td>Princeton Select Series</td>
			<td>3750R</td>
			<td>Brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen matrix for embedding</td>
			<td>OCT Tissue-Tek, Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stain tray &#8211; slide staining system</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>71396-B</td>
			<td>Use dark lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Micro Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield antifade mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Non-hardening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well inserts for 12-well plates</td>
			<td>Corning Netwells</td>
			<td>3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well inserts for 6-well plates</td>
			<td>Corning Netwells</td>
			<td>3479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>WHA1440042</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

histological-based stainings using free-floating tissue sections

L’immunohistochimie est une technique largement utilisée pour visualiser des structures tissulaires spécifiques ainsi que l’expression et la localisation des protéines. Deux approches alternatives sont largement utilisées pour manipuler les sections de tissu pendant la procédure de coloration, une approche consiste à monter les sections directement sur des lames de verre, tandis qu’une seconde approche, la flottante, permet de maintenir et de colorer les sections fixes en suspension. Bien que les approches montées sur glissière et flottantes puissent donner des résultats similaires, la technique de flottaison libre permet une meilleure pénétration des anticorps et devrait donc être la méthode de choix lorsque des sections plus épaisses doivent être utilisées pour la reconstruction 3D des tissus, par exemple lorsque l’objectif de l’expérience est d’obtenir des informations sur les projections dendritiques et axonales dans les régions du cerveau. De plus, comme les sections sont maintenues en solution, une seule partie aliquote peut facilement accueillir 30 à 40 sections, dont la manipulation est moins laborieuse, notamment dans les études biomédicales à grande échelle. Ici, nous illustrons comment appliquer la méthode de flottaison libre à la coloration immunohistochimique fluorescente, en mettant l’accent sur les sections du cerveau. Nous discuterons également de la façon dont la technique de flottaison libre peut facilement être modifiée pour répondre aux besoins individuels des chercheurs et adaptée à d’autres tissus ainsi qu’à d’autres colorations histochimiques, telles que l’hématoxyline, l’éosine et le violet de crésyle, à condition que les échantillons de tissus soient correctement fixés, généralement avec du paraformaldéhyde ou du formol.

Le schéma général de l’utilisation de la méthode flottante pour effectuer un test immunohistochimique fluorescent est illustré à la figure 1. Un exemple représentatif d’IHC fluorescente utilisant la méthode de flottaison libre dans le cerveau de souris examinant l’expression de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) est présenté à la figure 2 à un grossissement inférieur et supérieur pour illustrer la qualité globale de la coloration. ...

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Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections

La technique de flottaison libre permet aux chercheurs d’effectuer des colorations histologiques, y compris l’immunohistochimie, sur des coupes de tissus fixes afin de visualiser les structures biologiques, le type cellulaire et l’expression et la localisation des protéines. Il s’agit d’une technique histochimique efficace et fiable qui peut être utile pour étudier une multitude de tissus, tels que le cerveau, le cœur et le foie.

Colorations histologiques utilisant des sections de tissus flottant librement

Immunohistochemistry is a widely used technique to visualize specific tissue structures as well as protein expression and localization. Two alternative ...

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Research

JoVE Journal

Biology

17.7K vues.  University of Rhode Island. La technique de flottaison libre permet aux chercheurs d’effectuer des colorations histologiques, y compris l’immunohistochimie, sur des coupes de tissus fixes afin de visualiser les structures biologiques, le type cellulaire et l’expression et la localisation des protéines. Il s’agit d’une technique histochimique efficace et fiable qui peut être utile pour étudier une multitude de tissus, tels que le cerveau, le cœur et le foie.

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Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific antibodies. There are two methods: the direct and indirect method. In this experiment, we will only describe the use of indirect IHC staining. Indirect IHC staining utilizes highly specific primary and biotin-conjugated secondary antibodies. Primary antibodies are utilized to discretely identify proteins of interest by binding to a specific epitope, while secondary antibodies subtract for non-specific background staining and amplify signal by forming complexes to the primary antibody. Slides can either be generated from frozen sections, or paraffin embedded sections mounted on glass slides. In this protocol, we discuss the preparation of paraffin-embedded sections by dewaxing, hydration using an alcohol gradient, heat induced antigen retrieval, and blocking of endogenous peroxidase activity and non-specific binding sites. Some sections are then stained with antibodies specific for T cell marker CD8 and while others are stained for tyrosine hydroxylase. The slides are subsequently treated with appropriate secondary antibodies conjugated to biotin, then developed utilizing avidin-conjugated horseradish peroxidase (HRP) with Diaminiobenzidine (DAB) as substrate. Following development, the slides are counterstained for contrast, and mounted under coverslips with permount. After adequate drying, these slides are then ready for imaging.

Immunohistochimie: coupes en paraffine utilisant le kit de Vectastain ABC Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Recherche

Biologie

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

L&#39;immunohistochimie sur coupes en paraffine d&#39;épiderme de souris en utilisant des anticorps fluorescents

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is determined. Conventional preparation of tissues for PCR-ready DNA often take several hours to days, depending on the tissue sample. The genotype of the sample may thus be delayed for several days, which is not an option for many different types of experiments. Here we demonstrate the complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR Kit. First, we demonstrate the fifteen-minute extraction of DNA from the tissue sample. Then, we demonstrate the real time read-out of the PCR amplification of the sample, which allows for the identification of a positive sample as it is being amplified. Together, the rapid extraction and real-time readout allow for a prompt identification of genotype of a variety different types of tissues through the reliable method of PCR.

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma&#039;s Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

The complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, is done in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR kit.

Génotypage rapide des tissus de souris en utilisant Sigma Extract-N-Amp PCR Kit Tissu

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is ...

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Co-actine sédimentation Assay; pour l&#39;analyse des Binding Protein à F-actine

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Les articles inclus en paraffine et congelés de Drosophile</emMuscles adultes>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at different developmental stages. Epigenetic regulation contributes to a broad spectrum of biological processes, including cellular differentiation during embryonic development and homeostasis in adulthood. A critical strategy in epigenetic studies is to examine how various histone modifications and chromatin factors regulate gene expression. To address this, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) is used widely to obtain a snapshot of the association of particular factors with DNA in the cells of interest.
ChIP technique commonly uses cultured cells as starting material, which can be obtained in abundance and homogeneity to generate reproducible data. However, there are several caveats: First, the environment to grow cells in Petri dish is different from that in vivo, thus may not reflect the endogenous chromatin state of cells in a living organism. Second, not all types of cells can be cultured ex vivo. There are only a limited number of cell lines, from which people can obtain enough material for ChIP assay.
Here we describe a method to do ChIP experiment using Drosophila tissues. The starting material is dissected tissue from a living animal, thus can accurately reflect the endogenous chromatin state. The adaptability of this method with many different types of tissue will allow researchers to address a lot more biologically relevant questions regarding epigenetic regulation in vivo1, 2. Combining this method with high-throughput sequencing (ChIP-seq) will further allow researchers to obtain an epigenomic landscape.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recently high-throughput sequencing technology has greatly increased sensitivity of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment and prompted its application using purified cells or dissected tissue. Here we delineate a method to use ChIP technique with Drosophila tissue, which can address the endogenous chromatin state in a well-characterized biological system.

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) à l&#39;aide Drosophila Tissus

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

Un protocole automatisé pour l&#39;analyse rapide de la population de fibre musculaire chez le rat Muscle Sections Cross Utilisation myosine chaîne lourde immunohistochimie

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

Use of Anti-phospho-girdin Antibodies to Visualize Intestinal Tuft Cells in Free-Floating Mouse Jejunum Cryosections

The actin binding protein girdin is a cytosolic protein that is required for actin remodeling to trigger cell migration in various tissues. Girdin is phosphorylated by both receptor and non-receptor tyrosine kinases at tyrosine 1798. Omori et al. developed site- and phosphorylation status-specific antibodies against human girdin at tyrosine-1798 (pY1798), which specifically bind to phosphorylated tyrosine-1798, but not to unphosphorylated tyrosine-1798. pY1798 antibodies have been used to specifically label tuft cells (TCs) that are present in mammalian gastrointestinal tissues, but the function of these cells is unclear. This protocol allows the robust visualization of TCs in the jejunum using pY1798 antibodies and immunofluorescence. To ensure successful and simple TC visualization, this protocol includes two histological techniques: production of free-floating cryosections from gelatin-filled jejunum tissue, and low-temperature antigen retrieval at 50 &#176;C for 3 h. Filling the jejunum with gelatin maintains the shape of free-floating sections throughout the staining procedure, whereas low-temperature antigen retrieval ensures robust signals from TCs. Successful use of this protocol results in pY1798 staining of TCs distributed from villus tip to crypt. Stained TCs have a spool-shaped soma and fluorescent signals condense at the lumenal tip, which corresponds to the protruding &#39;tuft.&#39;&#160;Phalloidin staining colocalized with pY1798-positive TCs at the thickened brush border, and corresponds to a rootlet mass extending from the TC tuft. This protocol could be used to examine TCs in human biopsy samples collected with gastrointestinal endoscopes. Furthermore, TCs were recently reported to accumulate following parasite infection in mice, suggesting that this protocol could have applications for diagnosis of parasite infections in the human gut.

Kuga et al. discovered that phosphorylation-status specific antibodies against the actin binding protein girdin phosphorylated at tyrosine 1798 (pY1798) can be used to label tuft cells (TCs). This protocol allows robust visualization of TCs using immunofluorescent staining of free-floating jejunum cryosections with pY1798 antibodies.

Utilisation des anticorps Anti-phospho-girdin pour visualiser la touffe Intestinal cellules de souris flottante jéjunum Cryosections

The actin binding protein girdin is a cytosolic protein that is required for actin remodeling to trigger cell migration in various tissues. Girdin is ...

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a mixed cell population in a structured architecture that impacts function, and human islets are widely variable in cell type composition. Current frequently used methods to study cultured islets include molecular studies performed on whole islets, lumping disparate islet cell types together, or microscopy or molecular studies on dispersed islet cells, disrupting islet architecture. For in vivo islet studies, paraffin-embedded pancreas sectioning is a powerful technique to assess cell-specific outcomes in the native pancreatic environment. Studying post-culture islets by paraffin sectioning would offer several advantages: detection of multiple outcomes on the same islets (potentially even the exact-same islets, using serial sections), cell-type-specific measurements, and maintaining native islet cell-cell and cell-substratum interactions both during experimental exposure and for analysis. However, existing techniques for embedding isolated islets post-culture are inefficient, time consuming, prone to loss of material, and generally produce sections with inadequate islet numbers to be useful for quantifying outcomes. Clinical pathology laboratory cell block preparation facilities are inaccessible and impractical for basic research laboratories. We have developed an improved, simplified bench-top method that generates sections with robust yield and distribution of islets. Fixed islets are resuspended in warm histological agarose gel and pipetted into a flat disc on a standard glass slide, such that the islets are distributed in a plane. After standard dehydration and embedding, multiple (10+) 4 - 5 &#181;m sections can be cut from the same islet block. Using this method, histological&#160;and immunofluorescent analyses can be performed on mouse, rat, and human islets. This is an effective, inexpensive, time-saving approach to assess cell-type-specific, intact-architecture outcomes from cultured islets.

Ex vivo pancreatic islet studies are important for diabetes research. Existing techniques to study cultured islets in their native 3-dimensional architecture are time consuming, inefficient, and infrequently used. This work describes a new, simple, and efficient method for generating high-quality paraffin sections of whole cultured islets.

Îlots pancréatiques, enrobage pour les Sections de paraffine

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical applications. Isolating primary melanocytes from skin tissues by the conventional method usually takes about 3 to 4 weeks to passage sufficiently. More importantly, the tissues used are usually newborn foreskins and it is still a challenge to efficiently isolate primary melanocytes from adult tissues. We recently developed a new isolation method for melanocytes that adds Y-27632, a Rho kinase inhibitor, to the initial culture medium for 48 h. Compared with the conventional protocol, this new method dramatically increases the yield of melanocytes and shortens the time required to isolate melanocytes from foreskin tissues. We now describe this new method in more detail using adult epidermis to efficiently culture primary melanocytes. Importantly, we show that melanocytes obtained from adult tissues prepared by this new method can function normally. This new protocol will significantly benefit studies of pigmentation defects and melanomas using primary melanocytes prepared from easily accessed adult skin tissues.

This paper reports that the addition of Y-27632 to TIVA medium can significantly increase the yield of melanocytes from adult skin tissues.