Vorremmo ringraziare il National Institute on Aging (K99 / R00 AG055683 a JMR), il George and Anne Ryan Institute for Neuroscience (EP, GC, JMR), il College of Pharmacy dell'Università del Rhode Island (EP, GC, JMR) e Konung Gustaf V: s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse (JMR). Ringraziamo la dottoranda Rebecca Senft, in formazione con la professoressa Susan Dymecki, Dipartimento di Genetica, Harvard Medical School, per averci introdotto al metodo free-floating. Alcune immagini utilizzate nella Figura 1 sono state ottenute da fonti "libere di usare, condividere o modificare, anche commercialmente": tubo di topo e microcentrifuga (Pixabay), cervello di topo (Jonas Töle, Wikimedia Commons), criostato e sezione cervello di topo (DataBase Center for Life Science, Wikimedia Commons), contenitore di vetro (OpenClipart, FreeSvg.org) e microscopio (Theresa Knott, Open Clip Art Library).

1. Preparazione tissutale per criosezione
<ol><li>Incorporare tessuti fissi in uno stampo di incorporamento appropriato (vedi Tabella dei materiali) per creare un blocco di campioni utilizzando una matrice di campioni appropriata (vedi Tabella dei materiali) e congelare su ghiaccio secco. Conservare i blocchi di campioni a -80 °C fino al momento della sezione. NOTA: I tessuti fissi sono tipicamente preparati perfondendo roditori maschi o femmine adulti (di circa 2,5 – 30 mesi) (topo o ratto)34, in conformità con il permesso etico disponibile, con un fissativo appropriato (ad esempio formalina al 10%), seguito da tessuti post-fissaggio nello stesso fissativo per 12 ore a 4 °C, lavando i tessuti tre volte con 1x PBS, e mettendo i tessuti nel 15% e poi nel 30% di saccarosio in 1x PBS per una notte o fino a quando i tessuti affondano35. I ricercatori possono cercare di adattare questo protocollo generale alle diverse fasi di sviluppo.</li>
</ol>2. Criosezione
<ol><li>Quando sono pronti per la sezione, acclimatare i campioni nel criostato per almeno 1-2 ore prima del sezionamento per prevenire la frantumazione del tessuto.</li>
	<li>Utilizzando un criostato, tagliare il tessuto in sezioni (20-50 μm) e raccogliere in inserti da 6 o 12 pozzetti (vedi Tabella dei materiali) riempiti con 1x soluzione PBS. NOTA: A seconda dello spessore della sezione, della quantità di tessuto da raccogliere e del numero di inserti del pozzo utilizzati, ogni pozzetto conterrà un numero variabile di sezioni che vanno da circa 10 a 40 fette per pozzo. Ad esempio, se un intero cervello è sezionato a 40 μm, circa 18-24 sezioni saranno raccolte in ciascun pozzetto utilizzando inserti a 12 pozzetti. Inoltre, le sezioni da 20 μm possono essere piuttosto difficili da gestire, quindi si consiglia di 40 μm per la colorazione di massa (vedi Discussione).</li>
</ol>3. Memorizzazione delle sezioni
<ol><li>Una volta raccolte, lavare le sezioni con 1x PBS appena preparato per 5 minuti. Ripeti 3 volte.</li>
	<li>Trasferire le sezioni in provette da microcentrifuga da 2 mL riempite con 1-1,5 mL di soluzione di stoccaggio (per 250 mL, mescolare 70 g di saccarosio, 75 mL di glicole etilenico e portare a volume con tampone fosfato 0,1 M).</li>
	<li>Conservare a -80 °C fino al momento della colorazione.</li>
</ol>4. Giorno di colorazione I
<ol><li>Prelevare i campioni dal congelatore ed equilibrarli a temperatura ambiente (RT) per 10 - 20 minuti.</li>
	<li>Versare le sezioni in un inserto pozzetto in una piastra a 6 pozzetti per separare la soluzione di stoccaggio dalle sezioni.</li>
	<li>Spostare l'inserto del pozzetto in un altro pozzetto contenente circa 6 ml di 1x TBS. Lavare 3 volte con 1x TBS per 5 minuti ciascuno su uno shaker orbitale usando bassa velocità a RT.</li>
	<li>Durante il lavaggio delle sezioni, preparare 7 ml (per campione) di una soluzione bloccante-permeabilizzante costituita da 1x TBS con Triton X-100 allo 0,3% e siero normale al 3% (ad es. siero di cavallo normale). Bloccare le sezioni per 30 minuti a RT sullo shaker orbitale, utilizzando la bassa velocità. NOTA: Il blocco con i sieri impedisce il legame non specifico degli anticorpi ai tessuti o ai recettori Fc non specifici – si raccomanda un siero corrispondente alla specie dell'anticorpo secondario, ma se non disponibile, può essere utilizzato qualsiasi siero normale di una specie diversa dall'animale ospite dell'anticorpo primario. Il detergente Triton X-100 consente una migliore penetrazione degli anticorpi permeabilizzando il tessuto.</li>
	<li>Preparare 1 mL per campione di soluzione anticorpale primaria costituita da anticorpi primari selezionati (diluiti in modo appropriato) in 1x TBS con Triton X-100 allo 0,3% e siero normale all'1% (vedere la nota del punto 4.4). Trasferire le sezioni dal pozzetto inserite in una provetta da microcentrifuga da 2 mL contenente una soluzione anticorpale primaria per legarsi all'antigene o agli antigeni di interesse. NOTA: Possono essere utilizzati più anticorpi primari (generati in diverse specie ospiti).</li>
	<li>Posizionare una provetta da microcentrifuga da 2 mL con sezioni su un miscelatore rotante a bassa velocità (ad esempio, velocità 7 rpm) e incubare per una notte per 12-16 ore a 4 °C.</li>
</ol>5. Colorazione Giorno II
<ol><li>Il giorno seguente, versare le sezioni in un inserto pozzetto in una piastra a 6 pozzetti per separare le sezioni dalla soluzione anticorpale primaria. NOTA: La soluzione anticorpale può essere raccolta e riutilizzata; Aggiungere 0,02% (p/v) di azoturo di sodio per inibire la crescita microbica.</li>
	<li>Lavare le sezioni 3 volte con 1x TBS a RT (30 s per i primi 2 lavaggi e 10 minuti per il lavaggio finale).</li>
	<li>Preparare 1 mL per campione di soluzione anticorpale secondaria costituita da un anticorpo secondario appropriato (diluito di conseguenza) in 1x TBS con Triton X-100 allo 0,3% e siero normale all'1% (soluzione di schermatura dalla luce). NOTA: La marcatura indiretta con un anticorpo secondario coniugato amplifica il segnale e consente la visualizzazione colorimetrica o fluorescente del bersaglio proteico.</li>
	<li>Trasferire le sezioni in una provetta da microcentrifuga da 2 mL contenente una soluzione anticorpale secondaria. Incubare per 2 ore a RT su agitatore orbitale a bassa velocità (soluzione di schermatura dalla luce).</li>
	<li>Versare le sezioni in un inserto pozzetto in una piastra a 6 pozzetti per separare le sezioni dalla soluzione anticorpale secondaria.</li>
	<li>Continuando a schermare i campioni dalla luce, lavare 2 volte con 1x TBS per 30 s a RT. Quindi lavare per 15 minuti in 1x TBS, aggiungere DAPI (1-0,1 μg / ml) se lo si desidera.</li>
</ol>6. Montaggio
<ol><li>Versare le sezioni in una camera istologica rettangolare di vetro riempita per tre quarti con 1x TBS.</li>
	<li>Immergere un vetrino in 1x TBS e utilizzare un pennello fine per convincere le sezioni verso la diapositiva.</li>
	<li>Picchiettare delicatamente le sezioni sulla diapositiva, assicurandosi che non ci siano rughe o pieghe.</li>
	<li>Ripetere l'operazione fino a quando tutte le sezioni sono montate sulle diapositive. NOTA: Quando un intero cervello, ad esempio, è sezionato a 40 μm, raccolto in 12 pozzetti si inserisce con un'aliquota contenente 18-24 sezioni; Le sezioni sono in genere montate su 1-2 diapositive, ma è possibile montare anche meno sezioni per diapositiva a seconda delle preferenze del ricercatore.</li>
</ol>7. Scivolamento di copertura
<ol><li>Dopo che le sezioni sono state asciugate sui vetrini, circa 10-15 minuti a RT o fino a quando le sezioni appaiono opache (ricordarsi di schermare i vetrini dalla luce), applicare un mezzo di montaggio acquoso appropriato (indurimento o non indurimento). L'antisbiadimento è preferibile se si utilizza un anticorpo secondario coniugato fluorescente. NOTA: la qualità della fluorescenza può essere inferiore quando si utilizza un mezzo di montaggio di indurimento, ma le guide dovrebbero durare più a lungo.</li>
	<li>Usando una pinzetta, posiziona un coprislip sopra il mezzo. Coprire con carta da filtro e premere con decisione per rimuovere il mezzo di montaggio in eccesso. NOTA: Se si utilizza un supporto non indurente, dipingere i bordi della slitta coperta con smalto trasparente per sigillare.</li>
	<li>Sezioni di immagini utilizzando un microscopio appropriato. Conservare in una scatola scura a 4 °C. NOTA: Le sezioni possono essere visualizzate utilizzando una varietà di microscopi, come la scansione laser confocale e la fluorescenza a campo largo invertita o verticale, ad ingrandimenti (ad esempio, 10x, 20x, 40x) in base alle esigenze del ricercatore.</li>
</ol>

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Nulla da rivelare

L'immunoistochimica (IHC) è una tecnica versatile che è diventata cruciale nell'identificazione dell'espressione e della localizzazione delle proteine all'interno delle sezioni tissutali. Questo test viene utilizzato in tutta la comunità scientifica per comprendere ulteriormente le caratteristiche del tessuto attraverso le fasi della normale funzione fino agli stati di malattia. IHC è impiegato in una varietà di campi dalla diagnosi clinica di malattie come il cancro alle scoperte iniziali nella ricerca preclinica<s...

L'immunocolorazione è una pratica di ricerca popolare iniziata 130 anni fa con la scoperta degli anticorpi sierici nel 1890 da parte di Von Behring1. Durante i primi anni del 20° secolo, i coloranti furono attaccati agli antigeni e successivamente agli anticorpi come un modo per quantificare e visualizzare le reazioni1, e nel 1941 Albert Coons sviluppò le prime etichette di anticorpi fluorescenti, una scoperta che rivoluzionò la microscopia ottica 2,3. Il termine "immunocolorazione" comprende molte tecniche che sono state sviluppate utilizzando questo principio, tra cui Western blot, citometria a flusso, ELISA, immunocitochimica e immunoistochimica 3,4. Western blot rileva la presenza di proteine specifiche da estratti tissutali o cellulari5. Le proteine vengono separate per dimensione utilizzando l'elettroforesi su gel, trasferite su una membrana e sondate utilizzando anticorpi. Questa tecnica indica la presenza di proteine e quanta proteina è presente; Tuttavia, non rivela alcuna informazione sulla localizzazione della proteina all'interno di cellule o tessuti. Un altro metodo, l'immunocitochimica (ICC), etichetta le proteine all'interno delle cellule, tipicamente cellule coltivate in vitro. ICC mostra sia l'espressione proteica che la localizzazione all'interno dei compartimenti cellulari6. Per rilevare e visualizzare una proteina specifica a livello tissutale, viene utilizzata l'immunoistochimica (IHC).
IHC è un metodo che i ricercatori utilizzano per colpire antigeni specifici all'interno del tessuto, sfruttando le proprietà chimiche del sistema immunitario 7,8. Generando anticorpi primari e secondari specifici legati a un enzima o a un colorante fluorescente, gli antigeni di interesse possono essere marcati e rivelati nella maggior parte dei tessuti (come esaminato in Mepham e Britten)9. Il termine "immunoistochimica" di per sé non specifica il metodo di etichettatura utilizzato per rivelare l'antigene di interesse; pertanto, questa terminologia è spesso combinata con la tecnica di rilevamento per delineare chiaramente il metodo di etichettatura: immunoistochimica cromogenica (CIH) per indicare quando l'anticorpo secondario è coniugato a un enzima, come la perossidasi; o IHC fluorescente per indicare quando l'anticorpo secondario è coniugato a un fluoroforo, come l'isotiocianato di fluoresceina (FITC) o la tetrametilrodamina (TRITC). La selettività dell'IHC consente a medici e ricercatori di visualizzare l'espressione e la distribuzione delle proteine in tutti i tessuti, attraverso vari stati di salute e malattia10. Nel regno clinico, IHC è comunemente usato per diagnosticare il cancro, così come per determinare le differenze in vari tipi di cancro. IHC è stato utilizzato anche per confermare diversi tipi di infezioni microbiche all'interno del corpo, come l'epatite B o C11. Nella ricerca biomedica, l'IHC è spesso usato per mappare l'espressione proteica nei tessuti ed è importante nell'identificare le proteine anormali osservate negli stati patologici. Ad esempio, la neurodegenerazione è spesso accompagnata dall'accumulo di proteine anormali nel cervello, come placche αβ e grovigli neurofibrillari nella malattia di Alzheimer. I modelli animali sono spesso sviluppati per imitare questi stati patologici, e IHC è un metodo che i ricercatori usano per localizzare e quantificare le proteine di interesse10,12,13. A sua volta, possiamo saperne di più sulle cause di queste malattie e sulle complicazioni che sorgono con loro.
Ci sono molti passaggi coinvolti nell'esecuzione di IHC. In primo luogo, il tessuto di interesse viene raccolto e preparato per la colorazione. Probabilmente la maggior parte dei ricercatori prepara campioni di tessuto fissi, con la perfusione del fissativo attraverso il sistema circolatorio che è ottimale in quanto conserva la morfologia14,15. Può essere utilizzata anche la post-fissazione di campioni di tessuto, ma può produrre risultati non ideali16. I fissativi reticolanti, come la formaldeide, agiscono creando legami chimici tra le proteine nel tessuto17. Il tessuto fisso viene quindi tagliato in strati o sezioni molto sottili usando un microtomo, con molti ricercatori che preferiscono raccogliere sezioni congelate usando un criostato. Da lì il tessuto viene raccolto e montato direttamente su un vetrino da microscopio (metodo montato su vetrino) o sospeso in una soluzione (metodo free-floating), come la soluzione salina tamponata fosfato (PBS)18. Il metodo di raccolta utilizzato è predeterminato in base alle esigenze del ricercatore, con ciascuno di questi due metodi che presenta i propri vantaggi e svantaggi.
Il metodo montato su slitta è di gran lunga il più comunemente usato, con un importante vantaggio che possono essere preparate sezioni molto sottili (10-14 μm), il che è importante, ad esempio, per studiare le interazioni proteina-proteina. C'è anche una manipolazione minima del campione, che riduce i potenziali danni all'integrità strutturale del tessuto19. I ricercatori usano spesso questa tecnica con tessuto fresco congelato (tessuto che viene immediatamente congelato usando ghiaccio secco, isopentano, ecc.), che è molto delicato rispetto al tessuto fisso e deve essere presa molta attenzione per evitare lo scongelamento del campione. Un altro vantaggio dell'utilizzo di sezioni montate su scorrimento è che di solito non sono richiesti grandi volumi di soluzioni per la colorazione4. Pertanto, i ricercatori possono utilizzare una quantità minore di anticorpi costosi o altre sostanze chimiche per completare la macchia. Inoltre, è possibile montare sezioni di diversi gruppi sperimentali sulla stessa diapositiva, il che può essere vantaggioso, specialmente durante l'acquisizione delle immagini. D'altra parte, ci sono alcuni svantaggi nell'utilizzo di sezioni montate su slitta, in particolare che la sezione di tessuto è aderente al vetrino, limitando così la penetrazione degli anticorpi su un lato della sezione, che limita lo spessore della sezione e la rappresentazione 3D del tessuto. Può anche accadere che durante i lavaggi, i bordi del tessuto e intere sezioni possano staccarsi dal vetrino, rendendo inutile l'intero esperimento. Inoltre, l'IHC di solito deve essere eseguita in tempi relativamente brevi quando si utilizza l'approccio montato su vetrino per evitare la degradazione dell'epitopo dell'antigene 20,21 con vetrini non trasformati tipicamente conservati a -20 o -80 °C, spesso coperti e conservati orizzontalmente o in scatole di scorrimento, con conseguente ingombro di stoccaggio relativamente grande. Infine, la tecnica di montaggio su slitta può anche richiedere molto tempo se i ricercatori devono gestire un gran numero di vetrini per elaborare un gran numero di sezioni di tessuto.
A causa di alcune di queste sfide utilizzando il metodo montato su slitta, una modifica chiamata metodo free-floating è diventata un'alternativa popolare. Questa tecnica è entrata in letteratura negli anni 1960-70 22,23,24, guadagnando popolarità negli anni 1980 25,26,27,28,29, ed è ora un metodo consolidato che prevede l'esecuzione della macchia sulle sezioni raccolte in sospensione piuttosto che aderire a una diapositiva 12,30,31 . Il metodo free-floating non è raccomandato quando le sezioni di tessuto sono inferiori a 20 μm; Tuttavia, nella nostra esperienza è l'approccio di scelta quando le sezioni più spesse (40-50 μm) devono essere colorate. Un chiaro vantaggio è che gli anticorpi possono penetrare sezioni fluttuanti da tutte le angolazioni e generare meno colorazione dello sfondo grazie a un lavaggio più efficace, il tutto con conseguente migliore segnalazione durante l'imaging. Inoltre, le sezioni vengono montate sui vetrini dopo la lavorazione, eliminando così la possibilità di distacco del tessuto e diminuendo il tempo di occupazione del criostato. Il metodo free-floating può anche essere molto meno laborioso, specialmente per studi biomedici su larga scala. Ad esempio, è possibile colorare molte sezioni (18-40) dello stesso campione insieme nello stesso pozzetto, risparmiando tempo nell'esecuzione sia del lavaggio che delle fasi di incubazione degli anticorpi. Inoltre, poiché un numero maggiore (12-16) di sezioni può essere montato per diapositiva utilizzando questo approccio, è spesso più conveniente e veloce per il ricercatore visualizzare e visualizzare le sezioni. In particolare, durante il montaggio di fette di tessuto sui vetrini, le sezioni possono essere attaccate e staccate fino ad ottenere l'orientamento desiderato. I ricercatori usano spesso anche concentrazioni leggermente inferiori di anticorpi usando il metodo del flottante e, poiché le incubazioni vengono eseguite in provette da microcentrifuga, gli anticorpi possono essere facilmente raccolti e conservati con azoturo di sodio per il riutilizzo (vedi Passo 5.1). Un altro vantaggio è che le sezioni possono essere conservate direttamente a -80 °C in piccole provette di microcentrifuga con soluzione crioprotettiva32, riducendo così al minimo lo spazio di stoccaggio e massimizzando la longevità dei campioni33. Uno svantaggio dell'utilizzo di questa tecnica è che le sezioni vengono gestite molto e quindi sono suscettibili di danneggiarsi. Questo, tuttavia, può essere mitigato utilizzando basse velocità di scuotimento e rotazione, nonché formando adeguatamente i ricercatori su come trasferire i campioni e montare le sezioni sui vetrini.
Nel loro insieme, IHC è uno strumento consolidato ed essenziale per visualizzare e localizzare l'espressione proteica sia nel campo della ricerca clinica che biomedica. L'IHC fluttuante è un metodo efficiente, flessibile ed economico, specialmente quando si eseguono studi istologici su larga scala. Qui, presentiamo un protocollo IHC fluorescente affidabile per la comunità scientifica che può essere adattato di conseguenza per IHC cromogenico e altre colorazioni come l'ematossilina e l'eosina o la colorazione viola cresilico.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding molds</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF98-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum, heat inactivated</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide boxes</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>71370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-081</td>
			<td>24 x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular staining dish</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>70312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round artist paintbrush #2</td>
			<td>Princeton Select Series</td>
			<td>3750R</td>
			<td>Brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen matrix for embedding</td>
			<td>OCT Tissue-Tek, Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stain tray &#8211; slide staining system</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>71396-B</td>
			<td>Use dark lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Micro Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield antifade mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Non-hardening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well inserts for 12-well plates</td>
			<td>Corning Netwells</td>
			<td>3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well inserts for 6-well plates</td>
			<td>Corning Netwells</td>
			<td>3479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>WHA1440042</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

histological-based stainings using free-floating tissue sections

L'immunoistochimica è una tecnica ampiamente utilizzata per visualizzare specifiche strutture tissutali, nonché l'espressione e la localizzazione delle proteine. Due approcci alternativi sono ampiamente utilizzati per gestire le sezioni di tessuto durante la procedura di colorazione, un approccio consiste nel montare le sezioni direttamente su vetrini, mentre un secondo approccio, il free-floating, consente di mantenere e colorare le sezioni fisse mentre sono sospese in soluzione. Sebbene gli approcci montati su scorrimento e fluttuanti possano produrre risultati simili, la tecnica free-floating consente una migliore penetrazione degli anticorpi e quindi dovrebbe essere il metodo di scelta quando sezioni più spesse devono essere utilizzate per la ricostruzione 3D dei tessuti, ad esempio quando l'obiettivo dell'esperimento è ottenere informazioni sulle proiezioni dendritiche e assonali nelle regioni del cervello. Inoltre, poiché le sezioni sono mantenute in soluzione, una singola aliquota può facilmente ospitare da 30 a 40 sezioni, la cui gestione è meno laboriosa, in particolare negli studi biomedici su larga scala. Qui, illustriamo come applicare il metodo free-floating alla colorazione immunoistochimica fluorescente, con particolare attenzione alle sezioni cerebrali. Discuteremo anche di come la tecnica del flottante libero possa essere facilmente modificata per soddisfare le esigenze individuali dei ricercatori e adattata ad altri tessuti, nonché ad altre colorazioni a base istochimica, come l'ematossilina e l'eosina e il violetto cresilico, purché i campioni di tessuto siano correttamente fissati, tipicamente con paraformaldeide o formalina.

Lo schema generale dell'utilizzo del metodo free-floating per eseguire un test immunoistochimico fluorescente è illustrato nella Figura 1. Un esempio rappresentativo di IHC fluorescente che utilizza il metodo del fluttuante nel cervello di topo che esamina l'espressione della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) è mostrato nella Figura 2 sia a ingrandimento inferiore che superiore per illustrare la qualità complessiva della colorazione. Questo approccio è...

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Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections

La tecnica free-floating consente ai ricercatori di eseguire colorazioni istologiche, compresa l'immunoistochimica su sezioni di tessuto fisse per visualizzare le strutture biologiche, il tipo di cellula e l'espressione e la localizzazione delle proteine. Questa è una tecnica istochimica efficiente e affidabile che può essere utile per studiare una moltitudine di tessuti, come cervello, cuore e fegato.

Colorazioni istologiche con sezioni di tessuto fluttuanti

Immunohistochemistry is a widely used technique to visualize specific tissue structures as well as protein expression and localization. Two alternative ...

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Research

JoVE Journal

Biology

17.7K Views.  University of Rhode Island. La tecnica free-floating consente ai ricercatori di eseguire colorazioni istologiche, compresa l'immunoistochimica su sezioni di tessuto fisse per visualizzare le strutture biologiche, il tipo di cellula e l'espressione e la localizzazione delle proteine. Questa è una tecnica istochimica efficiente e affidabile che può essere utile per studiare una moltitudine di tessuti, come cervello, cuore e fegato.

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Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific antibodies. There are two methods: the direct and indirect method. In this experiment, we will only describe the use of indirect IHC staining. Indirect IHC staining utilizes highly specific primary and biotin-conjugated secondary antibodies. Primary antibodies are utilized to discretely identify proteins of interest by binding to a specific epitope, while secondary antibodies subtract for non-specific background staining and amplify signal by forming complexes to the primary antibody. Slides can either be generated from frozen sections, or paraffin embedded sections mounted on glass slides. In this protocol, we discuss the preparation of paraffin-embedded sections by dewaxing, hydration using an alcohol gradient, heat induced antigen retrieval, and blocking of endogenous peroxidase activity and non-specific binding sites. Some sections are then stained with antibodies specific for T cell marker CD8 and while others are stained for tyrosine hydroxylase. The slides are subsequently treated with appropriate secondary antibodies conjugated to biotin, then developed utilizing avidin-conjugated horseradish peroxidase (HRP) with Diaminiobenzidine (DAB) as substrate. Following development, the slides are counterstained for contrast, and mounted under coverslips with permount. After adequate drying, these slides are then ready for imaging.

Immunoistochimica: sezioni di paraffina Utilizzando il Vectastain ABC Kit Labs Vector

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Ricerca

Biologia

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

Immunoistochimica su sezioni di paraffina di epidermide mouse utilizzando anticorpi fluorescenti

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is determined. Conventional preparation of tissues for PCR-ready DNA often take several hours to days, depending on the tissue sample. The genotype of the sample may thus be delayed for several days, which is not an option for many different types of experiments. Here we demonstrate the complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR Kit. First, we demonstrate the fifteen-minute extraction of DNA from the tissue sample. Then, we demonstrate the real time read-out of the PCR amplification of the sample, which allows for the identification of a positive sample as it is being amplified. Together, the rapid extraction and real-time readout allow for a prompt identification of genotype of a variety different types of tissues through the reliable method of PCR.

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma&#039;s Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

The complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, is done in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR kit.

Genotipizzazione rapida del tessuto mouse utilizzando Sigma Extract-N-Amp PCR Tissue Kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is ...

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Actina Co-sedimentazione di analisi, per l&#39;Analisi del Binding Protein a F-Actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Sezioni incluse in paraffina e surgelati di Drosophila Adulti Muscoli

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at different developmental stages. Epigenetic regulation contributes to a broad spectrum of biological processes, including cellular differentiation during embryonic development and homeostasis in adulthood. A critical strategy in epigenetic studies is to examine how various histone modifications and chromatin factors regulate gene expression. To address this, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) is used widely to obtain a snapshot of the association of particular factors with DNA in the cells of interest.
ChIP technique commonly uses cultured cells as starting material, which can be obtained in abundance and homogeneity to generate reproducible data. However, there are several caveats: First, the environment to grow cells in Petri dish is different from that in vivo, thus may not reflect the endogenous chromatin state of cells in a living organism. Second, not all types of cells can be cultured ex vivo. There are only a limited number of cell lines, from which people can obtain enough material for ChIP assay.
Here we describe a method to do ChIP experiment using Drosophila tissues. The starting material is dissected tissue from a living animal, thus can accurately reflect the endogenous chromatin state. The adaptability of this method with many different types of tissue will allow researchers to address a lot more biologically relevant questions regarding epigenetic regulation in vivo1, 2. Combining this method with high-throughput sequencing (ChIP-seq) will further allow researchers to obtain an epigenomic landscape.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recently high-throughput sequencing technology has greatly increased sensitivity of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment and prompted its application using purified cells or dissected tissue. Here we delineate a method to use ChIP technique with Drosophila tissue, which can address the endogenous chromatin state in a well-characterized biological system.

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) con Drosophila Tessuto

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

Un rapido protocollo automatizzato per Fibra muscolare Analisi Popolazione nel ratto muscolari sezioni trasversali utilizzando una catena pesante della miosina immunoistochimica

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

Use of Anti-phospho-girdin Antibodies to Visualize Intestinal Tuft Cells in Free-Floating Mouse Jejunum Cryosections

The actin binding protein girdin is a cytosolic protein that is required for actin remodeling to trigger cell migration in various tissues. Girdin is phosphorylated by both receptor and non-receptor tyrosine kinases at tyrosine 1798. Omori et al. developed site- and phosphorylation status-specific antibodies against human girdin at tyrosine-1798 (pY1798), which specifically bind to phosphorylated tyrosine-1798, but not to unphosphorylated tyrosine-1798. pY1798 antibodies have been used to specifically label tuft cells (TCs) that are present in mammalian gastrointestinal tissues, but the function of these cells is unclear. This protocol allows the robust visualization of TCs in the jejunum using pY1798 antibodies and immunofluorescence. To ensure successful and simple TC visualization, this protocol includes two histological techniques: production of free-floating cryosections from gelatin-filled jejunum tissue, and low-temperature antigen retrieval at 50 &#176;C for 3 h. Filling the jejunum with gelatin maintains the shape of free-floating sections throughout the staining procedure, whereas low-temperature antigen retrieval ensures robust signals from TCs. Successful use of this protocol results in pY1798 staining of TCs distributed from villus tip to crypt. Stained TCs have a spool-shaped soma and fluorescent signals condense at the lumenal tip, which corresponds to the protruding &#39;tuft.&#39;&#160;Phalloidin staining colocalized with pY1798-positive TCs at the thickened brush border, and corresponds to a rootlet mass extending from the TC tuft. This protocol could be used to examine TCs in human biopsy samples collected with gastrointestinal endoscopes. Furthermore, TCs were recently reported to accumulate following parasite infection in mice, suggesting that this protocol could have applications for diagnosis of parasite infections in the human gut.

Kuga et al. discovered that phosphorylation-status specific antibodies against the actin binding protein girdin phosphorylated at tyrosine 1798 (pY1798) can be used to label tuft cells (TCs). This protocol allows robust visualization of TCs using immunofluorescent staining of free-floating jejunum cryosections with pY1798 antibodies.

Uso di anticorpi Anti-fosfo-girdin per visualizzare cellule intestinali ciuffo in Mouse digalleggiante digiuno Cryosections

The actin binding protein girdin is a cytosolic protein that is required for actin remodeling to trigger cell migration in various tissues. Girdin is ...

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a mixed cell population in a structured architecture that impacts function, and human islets are widely variable in cell type composition. Current frequently used methods to study cultured islets include molecular studies performed on whole islets, lumping disparate islet cell types together, or microscopy or molecular studies on dispersed islet cells, disrupting islet architecture. For in vivo islet studies, paraffin-embedded pancreas sectioning is a powerful technique to assess cell-specific outcomes in the native pancreatic environment. Studying post-culture islets by paraffin sectioning would offer several advantages: detection of multiple outcomes on the same islets (potentially even the exact-same islets, using serial sections), cell-type-specific measurements, and maintaining native islet cell-cell and cell-substratum interactions both during experimental exposure and for analysis. However, existing techniques for embedding isolated islets post-culture are inefficient, time consuming, prone to loss of material, and generally produce sections with inadequate islet numbers to be useful for quantifying outcomes. Clinical pathology laboratory cell block preparation facilities are inaccessible and impractical for basic research laboratories. We have developed an improved, simplified bench-top method that generates sections with robust yield and distribution of islets. Fixed islets are resuspended in warm histological agarose gel and pipetted into a flat disc on a standard glass slide, such that the islets are distributed in a plane. After standard dehydration and embedding, multiple (10+) 4 - 5 &#181;m sections can be cut from the same islet block. Using this method, histological&#160;and immunofluorescent analyses can be performed on mouse, rat, and human islets. This is an effective, inexpensive, time-saving approach to assess cell-type-specific, intact-architecture outcomes from cultured islets.

Ex vivo pancreatic islet studies are important for diabetes research. Existing techniques to study cultured islets in their native 3-dimensional architecture are time consuming, inefficient, and infrequently used. This work describes a new, simple, and efficient method for generating high-quality paraffin sections of whole cultured islets.

Isole pancreatiche incorporamento per sezioni di paraffina

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical applications. Isolating primary melanocytes from skin tissues by the conventional method usually takes about 3 to 4 weeks to passage sufficiently. More importantly, the tissues used are usually newborn foreskins and it is still a challenge to efficiently isolate primary melanocytes from adult tissues. We recently developed a new isolation method for melanocytes that adds Y-27632, a Rho kinase inhibitor, to the initial culture medium for 48 h. Compared with the conventional protocol, this new method dramatically increases the yield of melanocytes and shortens the time required to isolate melanocytes from foreskin tissues. We now describe this new method in more detail using adult epidermis to efficiently culture primary melanocytes. Importantly, we show that melanocytes obtained from adult tissues prepared by this new method can function normally. This new protocol will significantly benefit studies of pigmentation defects and melanomas using primary melanocytes prepared from easily accessed adult skin tissues.

This paper reports that the addition of Y-27632 to TIVA medium can significantly increase the yield of melanocytes from adult skin tissues.