Vorremmo ringraziare il National Institute on Aging (K99 / R00 AG055683 a JMR), il George and Anne Ryan Institute for Neuroscience (EP, GC, JMR), il College of Pharmacy dell'Università del Rhode Island (EP, GC, JMR) e Konung Gustaf V: s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse (JMR). Ringraziamo la dottoranda Rebecca Senft, in formazione con la professoressa Susan Dymecki, Dipartimento di Genetica, Harvard Medical School, per averci introdotto al metodo free-floating. Alcune immagini utilizzate nella Figura 1 sono state ottenute da fonti "libere di usare, condividere o modificare, anche commercialmente": tubo di topo e microcentrifuga (Pixabay), cervello di topo (Jonas Töle, Wikimedia Commons), criostato e sezione cervello di topo (DataBase Center for Life Science, Wikimedia Commons), contenitore di vetro (OpenClipart, FreeSvg.org) e microscopio (Theresa Knott, Open Clip Art Library).

1. Preparazione tissutale per criosezione
<ol><li>Incorporare tessuti fissi in uno stampo di incorporamento appropriato (vedi Tabella dei materiali) per creare un blocco di campioni utilizzando una matrice di campioni appropriata (vedi Tabella dei materiali) e congelare su ghiaccio secco. Conservare i blocchi di campioni a -80 °C fino al momento della sezione. NOTA: I tessuti fissi sono tipicamente preparati perfondendo roditori maschi o femmine adulti (di circa 2,5 – 30 mesi) (topo o ratto)34, in conformità con il permesso etico disponibile, con un fissativo appropriato (ad esempio formalina al 10%), seguito da tessuti post-fissaggio nello stesso fissativo per 12 ore a 4 °C, lavando i tessuti tre volte con 1x PBS, e mettendo i tessuti nel 15% e poi nel 30% di saccarosio in 1x PBS per una notte o fino a quando i tessuti affondano35. I ricercatori possono cercare di adattare questo protocollo generale alle diverse fasi di sviluppo.</li>
</ol>2. Criosezione
<ol><li>Quando sono pronti per la sezione, acclimatare i campioni nel criostato per almeno 1-2 ore prima del sezionamento per prevenire la frantumazione del tessuto.</li>
	<li>Utilizzando un criostato, tagliare il tessuto in sezioni (20-50 μm) e raccogliere in inserti da 6 o 12 pozzetti (vedi Tabella dei materiali) riempiti con 1x soluzione PBS. NOTA: A seconda dello spessore della sezione, della quantità di tessuto da raccogliere e del numero di inserti del pozzo utilizzati, ogni pozzetto conterrà un numero variabile di sezioni che vanno da circa 10 a 40 fette per pozzo. Ad esempio, se un intero cervello è sezionato a 40 μm, circa 18-24 sezioni saranno raccolte in ciascun pozzetto utilizzando inserti a 12 pozzetti. Inoltre, le sezioni da 20 μm possono essere piuttosto difficili da gestire, quindi si consiglia di 40 μm per la colorazione di massa (vedi Discussione).</li>
</ol>3. Memorizzazione delle sezioni
<ol><li>Una volta raccolte, lavare le sezioni con 1x PBS appena preparato per 5 minuti. Ripeti 3 volte.</li>
	<li>Trasferire le sezioni in provette da microcentrifuga da 2 mL riempite con 1-1,5 mL di soluzione di stoccaggio (per 250 mL, mescolare 70 g di saccarosio, 75 mL di glicole etilenico e portare a volume con tampone fosfato 0,1 M).</li>
	<li>Conservare a -80 °C fino al momento della colorazione.</li>
</ol>4. Giorno di colorazione I
<ol><li>Prelevare i campioni dal congelatore ed equilibrarli a temperatura ambiente (RT) per 10 - 20 minuti.</li>
	<li>Versare le sezioni in un inserto pozzetto in una piastra a 6 pozzetti per separare la soluzione di stoccaggio dalle sezioni.</li>
	<li>Spostare l'inserto del pozzetto in un altro pozzetto contenente circa 6 ml di 1x TBS. Lavare 3 volte con 1x TBS per 5 minuti ciascuno su uno shaker orbitale usando bassa velocità a RT.</li>
	<li>Durante il lavaggio delle sezioni, preparare 7 ml (per campione) di una soluzione bloccante-permeabilizzante costituita da 1x TBS con Triton X-100 allo 0,3% e siero normale al 3% (ad es. siero di cavallo normale). Bloccare le sezioni per 30 minuti a RT sullo shaker orbitale, utilizzando la bassa velocità. NOTA: Il blocco con i sieri impedisce il legame non specifico degli anticorpi ai tessuti o ai recettori Fc non specifici – si raccomanda un siero corrispondente alla specie dell'anticorpo secondario, ma se non disponibile, può essere utilizzato qualsiasi siero normale di una specie diversa dall'animale ospite dell'anticorpo primario. Il detergente Triton X-100 consente una migliore penetrazione degli anticorpi permeabilizzando il tessuto.</li>
	<li>Preparare 1 mL per campione di soluzione anticorpale primaria costituita da anticorpi primari selezionati (diluiti in modo appropriato) in 1x TBS con Triton X-100 allo 0,3% e siero normale all'1% (vedere la nota del punto 4.4). Trasferire le sezioni dal pozzetto inserite in una provetta da microcentrifuga da 2 mL contenente una soluzione anticorpale primaria per legarsi all'antigene o agli antigeni di interesse. NOTA: Possono essere utilizzati più anticorpi primari (generati in diverse specie ospiti).</li>
	<li>Posizionare una provetta da microcentrifuga da 2 mL con sezioni su un miscelatore rotante a bassa velocità (ad esempio, velocità 7 rpm) e incubare per una notte per 12-16 ore a 4 °C.</li>
</ol>5. Colorazione Giorno II
<ol><li>Il giorno seguente, versare le sezioni in un inserto pozzetto in una piastra a 6 pozzetti per separare le sezioni dalla soluzione anticorpale primaria. NOTA: La soluzione anticorpale può essere raccolta e riutilizzata; Aggiungere 0,02% (p/v) di azoturo di sodio per inibire la crescita microbica.</li>
	<li>Lavare le sezioni 3 volte con 1x TBS a RT (30 s per i primi 2 lavaggi e 10 minuti per il lavaggio finale).</li>
	<li>Preparare 1 mL per campione di soluzione anticorpale secondaria costituita da un anticorpo secondario appropriato (diluito di conseguenza) in 1x TBS con Triton X-100 allo 0,3% e siero normale all'1% (soluzione di schermatura dalla luce). NOTA: La marcatura indiretta con un anticorpo secondario coniugato amplifica il segnale e consente la visualizzazione colorimetrica o fluorescente del bersaglio proteico.</li>
	<li>Trasferire le sezioni in una provetta da microcentrifuga da 2 mL contenente una soluzione anticorpale secondaria. Incubare per 2 ore a RT su agitatore orbitale a bassa velocità (soluzione di schermatura dalla luce).</li>
	<li>Versare le sezioni in un inserto pozzetto in una piastra a 6 pozzetti per separare le sezioni dalla soluzione anticorpale secondaria.</li>
	<li>Continuando a schermare i campioni dalla luce, lavare 2 volte con 1x TBS per 30 s a RT. Quindi lavare per 15 minuti in 1x TBS, aggiungere DAPI (1-0,1 μg / ml) se lo si desidera.</li>
</ol>6. Montaggio
<ol><li>Versare le sezioni in una camera istologica rettangolare di vetro riempita per tre quarti con 1x TBS.</li>
	<li>Immergere un vetrino in 1x TBS e utilizzare un pennello fine per convincere le sezioni verso la diapositiva.</li>
	<li>Picchiettare delicatamente le sezioni sulla diapositiva, assicurandosi che non ci siano rughe o pieghe.</li>
	<li>Ripetere l'operazione fino a quando tutte le sezioni sono montate sulle diapositive. NOTA: Quando un intero cervello, ad esempio, è sezionato a 40 μm, raccolto in 12 pozzetti si inserisce con un'aliquota contenente 18-24 sezioni; Le sezioni sono in genere montate su 1-2 diapositive, ma è possibile montare anche meno sezioni per diapositiva a seconda delle preferenze del ricercatore.</li>
</ol>7. Scivolamento di copertura
<ol><li>Dopo che le sezioni sono state asciugate sui vetrini, circa 10-15 minuti a RT o fino a quando le sezioni appaiono opache (ricordarsi di schermare i vetrini dalla luce), applicare un mezzo di montaggio acquoso appropriato (indurimento o non indurimento). L'antisbiadimento è preferibile se si utilizza un anticorpo secondario coniugato fluorescente. NOTA: la qualità della fluorescenza può essere inferiore quando si utilizza un mezzo di montaggio di indurimento, ma le guide dovrebbero durare più a lungo.</li>
	<li>Usando una pinzetta, posiziona un coprislip sopra il mezzo. Coprire con carta da filtro e premere con decisione per rimuovere il mezzo di montaggio in eccesso. NOTA: Se si utilizza un supporto non indurente, dipingere i bordi della slitta coperta con smalto trasparente per sigillare.</li>
	<li>Sezioni di immagini utilizzando un microscopio appropriato. Conservare in una scatola scura a 4 °C. NOTA: Le sezioni possono essere visualizzate utilizzando una varietà di microscopi, come la scansione laser confocale e la fluorescenza a campo largo invertita o verticale, ad ingrandimenti (ad esempio, 10x, 20x, 40x) in base alle esigenze del ricercatore.</li>
</ol>

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</ol>

Nulla da rivelare

L'immunoistochimica (IHC) è una tecnica versatile che è diventata cruciale nell'identificazione dell'espressione e della localizzazione delle proteine all'interno delle sezioni tissutali. Questo test viene utilizzato in tutta la comunità scientifica per comprendere ulteriormente le caratteristiche del tessuto attraverso le fasi della normale funzione fino agli stati di malattia. IHC è impiegato in una varietà di campi dalla diagnosi clinica di malattie come il cancro alle scoperte iniziali nella ricerca preclinica<s...

L'immunocolorazione è una pratica di ricerca popolare iniziata 130 anni fa con la scoperta degli anticorpi sierici nel 1890 da parte di Von Behring1. Durante i primi anni del 20° secolo, i coloranti furono attaccati agli antigeni e successivamente agli anticorpi come un modo per quantificare e visualizzare le reazioni1, e nel 1941 Albert Coons sviluppò le prime etichette di anticorpi fluorescenti, una scoperta che rivoluzionò la microscopia ottica 2,3. Il termine "immunocolorazione" comprende molte tecniche che sono state sviluppate utilizzando questo principio, tra cui Western blot, citometria a flusso, ELISA, immunocitochimica e immunoistochimica 3,4. Western blot rileva la presenza di proteine specifiche da estratti tissutali o cellulari5. Le proteine vengono separate per dimensione utilizzando l'elettroforesi su gel, trasferite su una membrana e sondate utilizzando anticorpi. Questa tecnica indica la presenza di proteine e quanta proteina è presente; Tuttavia, non rivela alcuna informazione sulla localizzazione della proteina all'interno di cellule o tessuti. Un altro metodo, l'immunocitochimica (ICC), etichetta le proteine all'interno delle cellule, tipicamente cellule coltivate in vitro. ICC mostra sia l'espressione proteica che la localizzazione all'interno dei compartimenti cellulari6. Per rilevare e visualizzare una proteina specifica a livello tissutale, viene utilizzata l'immunoistochimica (IHC).
IHC è un metodo che i ricercatori utilizzano per colpire antigeni specifici all'interno del tessuto, sfruttando le proprietà chimiche del sistema immunitario 7,8. Generando anticorpi primari e secondari specifici legati a un enzima o a un colorante fluorescente, gli antigeni di interesse possono essere marcati e rivelati nella maggior parte dei tessuti (come esaminato in Mepham e Britten)9. Il termine "immunoistochimica" di per sé non specifica il metodo di etichettatura utilizzato per rivelare l'antigene di interesse; pertanto, questa terminologia è spesso combinata con la tecnica di rilevamento per delineare chiaramente il metodo di etichettatura: immunoistochimica cromogenica (CIH) per indicare quando l'anticorpo secondario è coniugato a un enzima, come la perossidasi; o IHC fluorescente per indicare quando l'anticorpo secondario è coniugato a un fluoroforo, come l'isotiocianato di fluoresceina (FITC) o la tetrametilrodamina (TRITC). La selettività dell'IHC consente a medici e ricercatori di visualizzare l'espressione e la distribuzione delle proteine in tutti i tessuti, attraverso vari stati di salute e malattia10. Nel regno clinico, IHC è comunemente usato per diagnosticare il cancro, così come per determinare le differenze in vari tipi di cancro. IHC è stato utilizzato anche per confermare diversi tipi di infezioni microbiche all'interno del corpo, come l'epatite B o C11. Nella ricerca biomedica, l'IHC è spesso usato per mappare l'espressione proteica nei tessuti ed è importante nell'identificare le proteine anormali osservate negli stati patologici. Ad esempio, la neurodegenerazione è spesso accompagnata dall'accumulo di proteine anormali nel cervello, come placche αβ e grovigli neurofibrillari nella malattia di Alzheimer. I modelli animali sono spesso sviluppati per imitare questi stati patologici, e IHC è un metodo che i ricercatori usano per localizzare e quantificare le proteine di interesse10,12,13. A sua volta, possiamo saperne di più sulle cause di queste malattie e sulle complicazioni che sorgono con loro.
Ci sono molti passaggi coinvolti nell'esecuzione di IHC. In primo luogo, il tessuto di interesse viene raccolto e preparato per la colorazione. Probabilmente la maggior parte dei ricercatori prepara campioni di tessuto fissi, con la perfusione del fissativo attraverso il sistema circolatorio che è ottimale in quanto conserva la morfologia14,15. Può essere utilizzata anche la post-fissazione di campioni di tessuto, ma può produrre risultati non ideali16. I fissativi reticolanti, come la formaldeide, agiscono creando legami chimici tra le proteine nel tessuto17. Il tessuto fisso viene quindi tagliato in strati o sezioni molto sottili usando un microtomo, con molti ricercatori che preferiscono raccogliere sezioni congelate usando un criostato. Da lì il tessuto viene raccolto e montato direttamente su un vetrino da microscopio (metodo montato su vetrino) o sospeso in una soluzione (metodo free-floating), come la soluzione salina tamponata fosfato (PBS)18. Il metodo di raccolta utilizzato è predeterminato in base alle esigenze del ricercatore, con ciascuno di questi due metodi che presenta i propri vantaggi e svantaggi.
Il metodo montato su slitta è di gran lunga il più comunemente usato, con un importante vantaggio che possono essere preparate sezioni molto sottili (10-14 μm), il che è importante, ad esempio, per studiare le interazioni proteina-proteina. C'è anche una manipolazione minima del campione, che riduce i potenziali danni all'integrità strutturale del tessuto19. I ricercatori usano spesso questa tecnica con tessuto fresco congelato (tessuto che viene immediatamente congelato usando ghiaccio secco, isopentano, ecc.), che è molto delicato rispetto al tessuto fisso e deve essere presa molta attenzione per evitare lo scongelamento del campione. Un altro vantaggio dell'utilizzo di sezioni montate su scorrimento è che di solito non sono richiesti grandi volumi di soluzioni per la colorazione4. Pertanto, i ricercatori possono utilizzare una quantità minore di anticorpi costosi o altre sostanze chimiche per completare la macchia. Inoltre, è possibile montare sezioni di diversi gruppi sperimentali sulla stessa diapositiva, il che può essere vantaggioso, specialmente durante l'acquisizione delle immagini. D'altra parte, ci sono alcuni svantaggi nell'utilizzo di sezioni montate su slitta, in particolare che la sezione di tessuto è aderente al vetrino, limitando così la penetrazione degli anticorpi su un lato della sezione, che limita lo spessore della sezione e la rappresentazione 3D del tessuto. Può anche accadere che durante i lavaggi, i bordi del tessuto e intere sezioni possano staccarsi dal vetrino, rendendo inutile l'intero esperimento. Inoltre, l'IHC di solito deve essere eseguita in tempi relativamente brevi quando si utilizza l'approccio montato su vetrino per evitare la degradazione dell'epitopo dell'antigene 20,21 con vetrini non trasformati tipicamente conservati a -20 o -80 °C, spesso coperti e conservati orizzontalmente o in scatole di scorrimento, con conseguente ingombro di stoccaggio relativamente grande. Infine, la tecnica di montaggio su slitta può anche richiedere molto tempo se i ricercatori devono gestire un gran numero di vetrini per elaborare un gran numero di sezioni di tessuto.
A causa di alcune di queste sfide utilizzando il metodo montato su slitta, una modifica chiamata metodo free-floating è diventata un'alternativa popolare. Questa tecnica è entrata in letteratura negli anni 1960-70 22,23,24, guadagnando popolarità negli anni 1980 25,26,27,28,29, ed è ora un metodo consolidato che prevede l'esecuzione della macchia sulle sezioni raccolte in sospensione piuttosto che aderire a una diapositiva 12,30,31 . Il metodo free-floating non è raccomandato quando le sezioni di tessuto sono inferiori a 20 μm; Tuttavia, nella nostra esperienza è l'approccio di scelta quando le sezioni più spesse (40-50 μm) devono essere colorate. Un chiaro vantaggio è che gli anticorpi possono penetrare sezioni fluttuanti da tutte le angolazioni e generare meno colorazione dello sfondo grazie a un lavaggio più efficace, il tutto con conseguente migliore segnalazione durante l'imaging. Inoltre, le sezioni vengono montate sui vetrini dopo la lavorazione, eliminando così la possibilità di distacco del tessuto e diminuendo il tempo di occupazione del criostato. Il metodo free-floating può anche essere molto meno laborioso, specialmente per studi biomedici su larga scala. Ad esempio, è possibile colorare molte sezioni (18-40) dello stesso campione insieme nello stesso pozzetto, risparmiando tempo nell'esecuzione sia del lavaggio che delle fasi di incubazione degli anticorpi. Inoltre, poiché un numero maggiore (12-16) di sezioni può essere montato per diapositiva utilizzando questo approccio, è spesso più conveniente e veloce per il ricercatore visualizzare e visualizzare le sezioni. In particolare, durante il montaggio di fette di tessuto sui vetrini, le sezioni possono essere attaccate e staccate fino ad ottenere l'orientamento desiderato. I ricercatori usano spesso anche concentrazioni leggermente inferiori di anticorpi usando il metodo del flottante e, poiché le incubazioni vengono eseguite in provette da microcentrifuga, gli anticorpi possono essere facilmente raccolti e conservati con azoturo di sodio per il riutilizzo (vedi Passo 5.1). Un altro vantaggio è che le sezioni possono essere conservate direttamente a -80 °C in piccole provette di microcentrifuga con soluzione crioprotettiva32, riducendo così al minimo lo spazio di stoccaggio e massimizzando la longevità dei campioni33. Uno svantaggio dell'utilizzo di questa tecnica è che le sezioni vengono gestite molto e quindi sono suscettibili di danneggiarsi. Questo, tuttavia, può essere mitigato utilizzando basse velocità di scuotimento e rotazione, nonché formando adeguatamente i ricercatori su come trasferire i campioni e montare le sezioni sui vetrini.
Nel loro insieme, IHC è uno strumento consolidato ed essenziale per visualizzare e localizzare l'espressione proteica sia nel campo della ricerca clinica che biomedica. L'IHC fluttuante è un metodo efficiente, flessibile ed economico, specialmente quando si eseguono studi istologici su larga scala. Qui, presentiamo un protocollo IHC fluorescente affidabile per la comunità scientifica che può essere adattato di conseguenza per IHC cromogenico e altre colorazioni come l'ematossilina e l'eosina o la colorazione viola cresilico.

<table><tbody><tr><td>12-well plates</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Clear nail polish</td><td>User preference</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Embedding molds</td><td>Thermo Scientific</td><td>1841</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol</td><td>User preference</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Formalin solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF98-4</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum, heat inactivated</td><td>Gibco</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide boxes</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>71370</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>User preference</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td>User preference</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Rectangular Coverslips</td><td>VWR</td><td>48393-081</td><td>24 x 50 mm</td></tr><tr><td>Rectangular staining dish</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>70312</td><td></td></tr><tr><td>Round artist paintbrush #2</td><td>Princeton Select Series</td><td>3750R</td><td>Brand not important</td></tr><tr><td>Secondary antibody</td><td>User preference</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Specimen matrix for embedding</td><td>OCT Tissue-Tek, Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Stain tray &amp;ndash; slide staining system</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>71396-B</td><td>Use dark lid</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>User preference</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Micro Slides</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td>User preference</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield antifade mounting medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Non-hardening</td></tr><tr><td>Well inserts for 12-well plates</td><td>Corning Netwells</td><td>3477</td><td></td></tr><tr><td>Well inserts for 6-well plates</td><td>Corning Netwells</td><td>3479</td><td></td></tr><tr><td>Whatman filter paper</td><td>Millapore-Sigma</td><td>WHA1440042</td><td></td></tr></tbody></table>

histological-based stainings using free-floating tissue sections

L'immunoistochimica è una tecnica ampiamente utilizzata per visualizzare specifiche strutture tissutali, nonché l'espressione e la localizzazione delle proteine. Due approcci alternativi sono ampiamente utilizzati per gestire le sezioni di tessuto durante la procedura di colorazione, un approccio consiste nel montare le sezioni direttamente su vetrini, mentre un secondo approccio, il free-floating, consente di mantenere e colorare le sezioni fisse mentre sono sospese in soluzione. Sebbene gli approcci montati su scorrimento e fluttuanti possano produrre risultati simili, la tecnica free-floating consente una migliore penetrazione degli anticorpi e quindi dovrebbe essere il metodo di scelta quando sezioni più spesse devono essere utilizzate per la ricostruzione 3D dei tessuti, ad esempio quando l'obiettivo dell'esperimento è ottenere informazioni sulle proiezioni dendritiche e assonali nelle regioni del cervello. Inoltre, poiché le sezioni sono mantenute in soluzione, una singola aliquota può facilmente ospitare da 30 a 40 sezioni, la cui gestione è meno laboriosa, in particolare negli studi biomedici su larga scala. Qui, illustriamo come applicare il metodo free-floating alla colorazione immunoistochimica fluorescente, con particolare attenzione alle sezioni cerebrali. Discuteremo anche di come la tecnica del flottante libero possa essere facilmente modificata per soddisfare le esigenze individuali dei ricercatori e adattata ad altri tessuti, nonché ad altre colorazioni a base istochimica, come l'ematossilina e l'eosina e il violetto cresilico, purché i campioni di tessuto siano correttamente fissati, tipicamente con paraformaldeide o formalina.

Lo schema generale dell'utilizzo del metodo free-floating per eseguire un test immunoistochimico fluorescente è illustrato nella Figura 1. Un esempio rappresentativo di IHC fluorescente che utilizza il metodo del fluttuante nel cervello di topo che esamina l'espressione della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) è mostrato nella Figura 2 sia a ingrandimento inferiore che superiore per illustrare la qualità complessiva della colorazione. Questo approccio è...

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Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections

La tecnica free-floating consente ai ricercatori di eseguire colorazioni istologiche, compresa l'immunoistochimica su sezioni di tessuto fisse per visualizzare le strutture biologiche, il tipo di cellula e l'espressione e la localizzazione delle proteine. Questa è una tecnica istochimica efficiente e affidabile che può essere utile per studiare una moltitudine di tessuti, come cervello, cuore e fegato.

Colorazioni istologiche con sezioni di tessuto fluttuanti

Immunohistochemistry is a widely used technique to visualize specific tissue structures as well as protein expression and localization. Two alternative ...

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Research

JoVE Journal

Biology

18.6K Views.  University of Rhode Island. La tecnica free-floating consente ai ricercatori di eseguire colorazioni istologiche, compresa l'immunoistochimica su sezioni di tessuto fisse per visualizzare le strutture biologiche, il tipo di cellula e l'espressione e la localizzazione delle proteine. Questa è una tecnica istochimica efficiente e affidabile che può essere utile per studiare una moltitudine di tessuti, come cervello, cuore e fegato.

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Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

With the recent development of retinal prostheses, it is important to develop reliable techniques for assessing the safety of these devices in preclinical studies. However, the standard fixation, preparation, and automated histology procedures are not ideal. Here we describe new procedures for evaluating the health of the retina directly adjacent to an implant. Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. Previous methods have not been able to spatially localize the ocular tissue adjacent to individual electrodes within the array. In addition, standard histological processing often results in gross artifactual detachment of the retinal layers when assessing implanted eyes. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by implantation and stimulation of an implanted electrode array. Therefore, we developed a method for identifying and localizing the ocular tissue adjacent to implanted electrodes using a (color-coded) dye marking scheme, and we modified an eye fixation technique to minimize artifactual retinal detachment. This method also rendered the sclera translucent, enabling localization of individual electrodes and specific parts of an implant. Finally, we used a matched control to increase the power of the histopathological assessments. In summary, this method enables reliable and efficient discrimination and assessment of the retinal cytoarchitecture in an implanted eye.

Techniques for visualizing retinal cytoarchitecture directly adjacent to individual electrodes within a retinal stimulator.

Tecniche di lavorazione occhi impiantati con una protesi retinica per analisi istopatologica localizzato

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

Ricerca

Medicina

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brain tissue, using markers for microglia and neuronal elements as an example. Specifically, this paper is a step-by-step protocol for fluorescent visualization of microglia and neurons via immunohistochemistry for Iba1 and Pan-neuronal, respectively. Fluorescence double-labeling is particularly useful for the localization of multiple proteins within the same sample, providing the opportunity to accurately observe interactions between cell types, receptors, ligands, and/or the extracellular matrix in relation to one another as well as protein co-localization within a single cell. Unlike other visualization techniques, fluorescence immunohistochemistry staining intensity may decrease in the weeks to months following staining, unless appropriate precautions are taken. Despite this limitation, in many applications fluorescence double-labeling is preferred over alternatives such as 3,3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) or alkaline phosphatase (AP), as fluorescence is more time efficient and allows for more precise differentiation between two or more markers. The discussion includes troubleshooting tips and advice to promote success.

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

Primer per immunoistochimica su Cryosectioned Rat tessuto cerebrale: Esempio colorazione per Microglia e neuroni

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Neuroscienze

Highly-Multiplexed Tissue Imaging with Raman Dyes

Visualizing a vast scope of specific biomarkers in tissues plays a vital role in exploring the intricate organizations of complex biological systems. Hence, highly multiplexed imaging technologies have been increasingly appreciated. Here, we describe an emerging platform of highly-multiplexed vibrational imaging of specific proteins with comparable sensitivity to standard immunofluorescence via electronic pre-resonance stimulated Raman scattering (epr-SRS) imaging of rainbow-like Raman dyes. This method circumvents the limit of spectrally-resolvable channels in conventional immunofluorescence and provides a one-shot optical approach to interrogate multiple markers in tissues with subcellular resolution. It is generally compatible with standard tissue preparations, including paraformaldehyde-fixed tissues, frozen tissues, and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) human tissues. We envisage this platform will provide a more comprehensive picture of protein interactions of biological specimens, particularly for thick intact tissues. This protocol provides the workflow from antibody preparation to tissue sample staining, to SRS microscope assembly, to epr-SRS tissue imaging.

Electronic pre-resonance stimulated Raman scattering (epr-SRS) imaging of rainbow-like Raman dyes is a new platform for highly multiplexed epitope-based protein imaging. Here, we present a practical guide including antibody preparation, tissue sample staining, SRS microscope assembly, and epr-SRS tissue imaging.

Imaging tissutale altamente multiplexato con coloranti Raman

Visualizing a vast scope of specific biomarkers in tissues plays a vital role in exploring the intricate organizations of complex biological systems. ...

Bioingegneria

A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample that can provide information about antigen coexpression and spatial distribution of the markers. However, a lack of suitable antibodies for formalin-fixed tissues may restrict the nature of markers that can be detected. In addition, the staining method is time-consuming. Here we describe a rapid method to perform multispectral fluorescence imaging on frozen tissues. The method includes the fluorophore combinations used, detailed steps for the staining of mouse and human frozen tissues, and the scanning, acquisition, and analysis procedures. For staining analysis, a commercially available semiautomated multispectral fluorescence imaging system is used. Through this method, up to six different markers were stained and detected in a single frozen tissue section. The machine learning analysis software can phenotype cells that can be used for quantitative analysis. The method described here for frozen tissues is useful for the detection of markers that cannot be detected in FFPE tissues or for which antibodies are not available for FFPE tissues.

We describe a rapid staining method to perform multispectral imaging on frozen tissues.

Un metodo rapido per l'imaging della fluorescenza multispettrale delle sezioni dei tessuti congelati

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample ...

Immunologia e infezioni

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of slice cultures in neuroscience, studies using adult nervous tissue to prepare such cultures are still scarce, particularly those from human subjects. The use of adult human tissue to prepare slice cultures is particularly attractive to enhance the understanding of human neuropathologies, as they hold unique properties typical of the mature human brain lacking in slices produced from rodent (usually neonatal) nervous tissue. This protocol describes how to use brain tissue collected from living human donors submitted to resective brain surgery to prepare short-term, free-floating slice cultures. Procedures to maintain and perform biochemical and cell biology assays using these cultures are also presented. Representative results demonstrate that the typical human cortical lamination is preserved in slices after 4 days in vitro (DIV4), with expected presence of the main neural cell types. Moreover, slices at DIV4 undergo robust cell death when challenged with a toxic stimulus (H2O2), indicating the potential of this model to serve as a platform in cell death assays. This method, a simpler and cost-effective alternative to the widely used protocol using membrane inserts, is mainly recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases. Finally, although the protocol is devoted to using cortical tissue collected from patients submitted to surgical treatment of pharmacoresistant temporal lobe epilepsy, it is argued that tissue collected from other brain regions/conditions should also be considered as sources to produce similar free-floating slice cultures.

A protocol to prepare free-floating slice cultures from adult human brain is presented. The protocol is a variation of the widely used slice culture method using membrane inserts. It is simple, cost-effective, and recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases.

A breve termine, le colture di fette libere dal cervello umano adulto

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the regulation of energy metabolism and other neurobiological processes. However, the quality, reliability, and reproducibility of brain histology results may vary among laboratories. For each staining experiment, it is necessary to optimize the key procedures based on differences in species, tissues, targeted proteins, and the working conditions of the reagents. This paper demonstrates a reliable workflow in detail, including intra-aortic perfusion, brain sectioning, free-floating immunostaining, tissue mounting, and imaging, which can be followed easily by researchers in this field.
Also discussed are how to modify these procedures to satisfy the individual needs of researchers. To illustrate the reliability and efficiency of this protocol, perineuronal nets were stained with biotin-labeled Wisteria florbunda agglutinin (WFA) and arginine vasopressin (AVP) with an anti-AVP antibody in the mouse brain. Finally, the critical details for the entire procedure have been addressed, and the advantages of this protocol compared to those of other protocols. Taken together, this paper presents an optimized protocol for free-floating immunostaining of mouse brain tissue. Following this protocol makes this process easier for both junior and senior scientists to improve the quality, reliability, and reproducibility of immunostaining studies.

This protocol describes an efficient and reproducible approach for mouse brain histological studies, including perfusion, brain sectioning, free-floating immunostaining, tissue mounting, and imaging.

Immunocolorazione fluttuante del cervello di topo

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and disease modeling, drug discovery, and regenerative medicine. To fully exploit these models, it is crucial to study them at cellular and subcellular levels. However, characterizing such in vitro 3D cell culture models can be technically challenging and requires specific expertise to perform effective analyses. Here, this paper provides detailed, robust, and complementary protocols to perform staining and subcellular resolution imaging of fixed in vitro 3D cell culture models ranging from 100 &#181;m to several millimeters. These protocols are applicable to a wide variety of organoids and spheroids that differ in their cell-of-origin, morphology, and culture conditions. From 3D structure harvesting to image analysis, these protocols can be completed within 4-5 days. Briefly, 3D structures are collected, fixed, and can then be processed either through paraffin-embedding and histological/immunohistochemical staining, or directly immunolabeled and prepared for optical clearing and 3D reconstruction (200 &#181;m depth) by confocal microscopy.

Here, we provide detailed, robust, and complementary protocols to perform staining and subcellular resolution imaging of fixed three-dimensional cell culture models ranging from 100 &#181;m to several millimeters, thus enabling the visualization of their morphology, cell-type composition, and interactions.

Colorazione e imaging ad alta risoluzione di modelli organoidi e sferoidi tridimensionali

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...

Biologia

Histological Staining of Neural Tissue

In order to examine the cellular, structural and molecular layout of tissues and organs, researchers use a method known as histological staining. In this technique, a tissue of interest is preserved using chemical fixatives and sectioned, or cut into very thin slices. A variety of staining techniques are then applied to provide contrast to the visually uniform sections. In the study of neuroanatomy, histological techniques are frequently applied to visualize and study nervous system tissue. This video focuses on histological staining techniques for neural tissue. An overview of common brain stains is provided, including those that specifically mark neuronal cell bodies, like Nissl stains, and those that selectively highlight myelinated axons, like the Luxol Fast blue stain. Immunohistological techniques, which take advantage of the specific interaction between antibodies and unique cellular proteins, are also discussed. Next, the preparation of brain samples for staining is described, including the basic steps for fixation, embedding, sectioning, and rehydration of the tissue. The presentation also provides a step-by-step procedure for immunohistological staining followed by a Nissl stain, in addition to practical applications of these techniques.

Brain Stains: Histological Staining of Neural Tissue

Colorazione istologica del tessuto neurale

In order to examine the cellular, structural and molecular layout of tissues and organs, researchers use a method known as histological staining. In this ...

Didattica

JoVE Science Education

Biologia avanzata

Histological Sample Preparation for Light Microscopy

Histology is the study of cells and tissues, which is typically aided by the use of a light microscope. The preparation of histological samples can vary greatly based on the inherent properties of the samples such as size and hardness as well as expected post-processing which includes planned staining techniques or other down-stream applications. As described in this video, specimen preparation typically begins with a fixation procedure to prevent degradation of the sample by naturally occurring enzymes that are released by the cells upon death. Once fixed, samples are placed into an embedding medium that is able to sufficiently support the sample. Most commonly this is paraffin wax, but other materials such as a glycerin based freezing medium and agars are also used to surround the sample during sectioning. Sectioning then takes place on a microtome or other cutting device that allows the user to shave the sample into thin slices ranging from a few microns to a few millimeters in thickness. Once cut, sections are mounted on a glass slide and stained to bring out specific features of the sample before being imaged on a microscope.

Histological Sample Prep for a Light Microscope

Preparazione del campione istologico per microscopia ottica

Histology is the study of cells and tissues, which is typically aided by the use of a light microscope.  The preparation of histological samples can vary ...

Biologia di base

Tecniche generali di laboratorio

Formalin-Fixed Paraffin Embedded (FFPE) Tissue Preservation: A Method for Studying Tissue Morphology

Source: Nagaraj A.S., et al., <a href="https://www.jove.com/v/58569/establishment-analysis-tumor-slice-explants-as-prerequisite-for">Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing.</a> J. Vis. Exp. (2018)
The following video describes how to preserve morphology of a tissue with formalin fixation and paraffin embedding.