Nos gustaría reconocer al Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (K99 / R00 AG055683 a JMR), el Instituto George y Anne Ryan de Neurociencia (EP, GC, JMR), la Facultad de Farmacia de la Universidad de Rhode Island (EP, GC, JMR) y Konung Gustaf V: s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse (JMR). Agradecemos a la estudiante de doctorado Rebecca Senft, que se formó con la profesora Susan Dymecki, del Departamento de Genética de la Escuela de Medicina de Harvard, por presentarnos el método de flotación libre. Algunas imágenes utilizadas en la Figura 1 se obtuvieron de fuentes "gratuitas de usar, compartir o modificar, incluso comercialmente": tubo de ratón y microcentrífuga (Pixabay), cerebro de ratón (Jonas Töle, Wikimedia Commons), sección de criostato y cerebro de ratón (DataBase Center for Life Science, Wikimedia Commons), recipiente de vidrio (OpenClipart, FreeSvg.org) y microscopio (Theresa Knott, Open Clip Art Library).

1. Preparación del tejido para criosección
<ol><li>Incruste tejidos fijos en un molde de incrustación apropiado (consulte la Tabla de materiales) para crear un bloque de muestra utilizando una matriz de muestra apropiada (consulte la Tabla de materiales) y congele en hielo seco. Almacene los bloques de muestras a -80 °C hasta que estén listos para seccionar. NOTA: Los tejidos fijos se preparan típicamente perfundiendo roedores machos o hembras adultos (aprox. 2,5 – 30 meses de edad) (ratón o rata)34, de acuerdo con el permiso ético disponible, con un fijador apropiado (por ejemplo, formalina al 10%), seguido de pañuelos posfijación en el mismo fijador durante 12 h a 4 °C, lavando los tejidos tres veces con 1x PBS, y colocar los tejidos en 15% y luego 30% de sacarosa en 1x PBS durante la noche o hasta que los tejidos se hundan35. Los investigadores pueden tratar de adaptar este protocolo general a diferentes etapas de desarrollo.</li>
</ol>2. Criosección
<ol><li>Cuando esté listo para seccionar, aclimatar las muestras en el criostato durante al menos 1-2 h antes de la sección para evitar la rotura del tejido.</li>
	<li>Usando un criostato, corte el tejido en secciones (20-50 μm) y recoja en insertos de 6 o 12 pocillos (consulte la Tabla de materiales) llenos con 1x solución de PBS. NOTA: Dependiendo del grosor de la sección, la cantidad de tejido que se recolectará y el número de insertos de pozo utilizados, cada pocillo contendrá un número variable de secciones que abarcan aproximadamente 10 a 40 rebanadas para el pozo. Por ejemplo, si se secciona un cerebro entero a 40 μm, se recolectarán aproximadamente 18-24 secciones en cada pocillo utilizando insertos de 12 pocillos. Además, las secciones de 20 μm pueden ser algo difíciles de manejar, por lo que se recomienda 40 μm para la tinción a granel (ver Discusión).</li>
</ol>3. Almacenamiento de secciones
<ol><li>Una vez recogidos, lavar las secciones con 1x PBS recién preparado durante 5 min. Repita 3 veces.</li>
	<li>Transfiera las secciones en tubos de microcentrífuga de 2 ml llenos de 1-1.5 ml de solución de almacenamiento (para 250 ml, mezcle 70 g de sacarosa, 75 ml de etilenglicol y lleve al volumen con tampón fosfato 0.1 M).</li>
	<li>Conservar a -80 °C hasta que esté listo para la tinción.</li>
</ol>4. Día de tinción I
<ol><li>Retire las muestras del congelador y equilibre a temperatura ambiente (RT) durante 10 - 20 min.</li>
	<li>Vierta las secciones en un inserto de pozo en una placa de 6 pocillos para separar la solución de almacenamiento de las secciones.</li>
	<li>Mueva el inserto del pozo a otro pocillo que contenga aproximadamente 6 ml de 1x TBS. Lave 3 veces con 1x TBS durante 5 minutos cada una en un agitador orbital usando baja velocidad a RT.</li>
	<li>Mientras se lavan las secciones, prepare 7 ml (por muestra) de una solución de obstrucción-permeabilización que consista en 1x TBS con 0,3% de Triton X-100 y 3% de suero normal (por ejemplo, suero de caballo normal). Bloquee secciones durante 30 min a RT en agitador orbital, usando baja velocidad. NOTA: El bloqueo con sueros evita la unión no específica de anticuerpos a tejidos o receptores Fc no específicos: se recomienda un suero que coincida con la especie del anticuerpo secundario, pero si no está disponible, se puede usar cualquier suero normal de una especie diferente del animal huésped de anticuerpos primario. El detergente Triton X-100 permite una mejor penetración de anticuerpos al permeabilizar el tejido.</li>
	<li>Preparar 1 ml por muestra de solución de anticuerpos primarios que consista en anticuerpos primarios seleccionados (diluidos adecuadamente) en 1x TBS con Triton X-100 al 0,3% y suero normal al 1% (ver Paso 4.4 Nota). Transfiera secciones del inserto de pozo a un tubo de microcentrífuga de 2 ml que contenga solución de anticuerpos primarios para unirse al antígeno (s) de interés. NOTA: Se pueden usar múltiples anticuerpos primarios (generados en diferentes especies hospedadoras).</li>
	<li>Colocar un tubo de microcentrífuga de 2 ml con secciones en un mezclador giratorio a baja velocidad (por ejemplo, velocidad de 7 rpm) e incubar durante la noche durante 12-16 h a 4 °C.</li>
</ol>5. Día de tinción II
<ol><li>Al día siguiente, vierta las secciones en un inserto de pozo en una placa de 6 pocillos para separar las secciones de la solución de anticuerpos primarios. NOTA: La solución de anticuerpos se puede recolectar y reutilizar; Agregue azida de sodio al 0,02% (p/v) para inhibir el crecimiento microbiano.</li>
	<li>Lave las secciones 3 veces con 1x TBS en RT (30 s para los primeros 2 lavados y 10 minutos para el lavado final).</li>
	<li>Preparar 1 ml por muestra de solución de anticuerpos secundarios que consista en anticuerpos secundarios apropiados (diluidos en consecuencia) en 1x TBS con Triton X-100 al 0,3% y suero normal al 1% (solución protectora contra la luz). NOTA: El marcado indirecto con un anticuerpo secundario conjugado amplifica la señal y permite la visualización colorimétrica o fluorescente de la proteína diana.</li>
	<li>Transfiera las secciones a un tubo de microcentrífuga de 2 ml que contenga una solución de anticuerpos secundaria. Incubar durante 2 h a RT en un agitador orbital a baja velocidad (solución de protección de la luz).</li>
	<li>Vierta las secciones en un inserto de pocillo en una placa de 6 pocillos para separar las secciones de la solución de anticuerpos secundaria.</li>
	<li>Continuando protegiendo las muestras de la luz, lave 2 veces con 1x TBS durante 30 s en RT. Luego lavar durante 15 minutos en 1x TBS, agregue DAPI (1-0.1 μg / ml) si lo desea.</li>
</ol>6. Montaje
<ol><li>Verter secciones en una cámara histológica rectangular de vidrio llena tres cuartos con 1x TBS.</li>
	<li>Sumerja una diapositiva de vidrio en el 1x TBS y use un pincel fino para convencer a las secciones hacia la diapositiva.</li>
	<li>Golpee suavemente las secciones en la diapositiva, asegurándose de que no haya arrugas ni pliegues.</li>
	<li>Repita hasta que todas las secciones estén montadas en la(s) diapositiva(s). NOTA: Cuando un cerebro entero, por ejemplo, se secciona a 40 μm, se recoge en insertos de 12 pocillos con una alícuota que contiene 18-24 secciones; Los sectores generalmente se montan en 1-2 diapositivas, pero también se pueden montar menos secciones por diapositiva según las preferencias del investigador.</li>
</ol>7. Cubreción
<ol><li>Después de que las secciones se sequen en la(s) diapositiva(s), aproximadamente 10-15 minutos en RT o hasta que las secciones se vean opacas (recuerde proteger las diapositivas de la luz), aplique un medio de montaje acuoso apropiado (endurecimiento o no endurecimiento). Se prefiere el antidecolorante si se utiliza un anticuerpo secundario conjugado fluorescente. NOTA: La calidad de fluorescencia puede ser menor cuando se utiliza un medio de montaje de endurecimiento, pero las guías deben durar más tiempo.</li>
	<li>Usando pinzas, coloque un cubreobjetos encima del medio. Cubra con papel de filtro y presione firmemente hacia abajo para eliminar el exceso de medio de montaje. NOTA: Si utiliza un soporte no endurecedor, pinte los bordes de la corredera deslizada con esmalte de uñas transparente para sellar.</li>
	<li>Secciones de imágenes usando un microscopio apropiado. Conservar en una caja deslizante oscura a 4 °C. NOTA: Las secciones se pueden obtener imágenes utilizando una variedad de microscopios, como el escaneo láser confocal y fluorescencia de campo amplio invertida o vertical, con aumentos (por ejemplo, 10x, 20x, 40x) según las necesidades del investigador.</li>
</ol>

<ol>
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Nada que revelar

La inmunohistoquímica (IHC) es una técnica versátil que se ha vuelto crucial para identificar la expresión y localización de proteínas dentro de las secciones de tejido. Este ensayo se utiliza en toda la comunidad científica para comprender mejor las características del tejido a través de las etapas de la función normal a los estados de enfermedad. La IHQ se emplea en una variedad de campos, desde el diagnóstico clínico de enfermedades como el cáncer hasta los descubrimientos iniciales en la investigación p...

La inmunotinción es una práctica de investigación popular que comenzó hace 130 años con el descubrimiento de los anticuerpos séricos en 1890 por Von Behring1. A principios delsiglo XX, los colorantes se unieron a antígenos y más tarde a anticuerpos como una forma de cuantificar y visualizar reacciones1, y en 1941 Albert Coons desarrolló las primeras etiquetas de anticuerpos fluorescentes, un descubrimiento que revolucionó la microscopía de luz 2,3. El término "inmunotinción" abarca muchas técnicas que han sido desarrolladas utilizando este principio, incluyendo Western blot, citometría de flujo, ELISA, inmunocitoquímica e inmunohistoquímica 3,4. Western blot detecta la presencia de proteínas específicas de extractos de tejidos o células5. Las proteínas se separan por tamaño mediante electroforesis en gel, se transfieren a una membrana y se sondean con anticuerpos. Esta técnica indica la presencia de proteína y cuánta proteína está presente; Sin embargo, no revela ninguna información sobre la localización de la proteína dentro de las células o tejidos. Otro método, la inmunocitoquímica (ICC), marca proteínas dentro de las células, típicamente células cultivadas in vitro. ICC muestra tanto la expresión de proteínas como la localización dentro de los compartimentos celulares6. Para detectar y visualizar una proteína específica a nivel tisular, se utiliza la inmunohistoquímica (IHC).
La IHQ es un método que los investigadores utilizan para atacar antígenos específicos dentro del tejido, aprovechando las propiedades químicas del sistema inmune 7,8. Al generar anticuerpos primarios y secundarios específicos vinculados a una enzima o a un colorante fluorescente, los antígenos de interés pueden ser marcados y revelados en la mayoría de los tejidos (como se revisó en Mepham y Britten)9. El término "inmunohistoquímica" por sí mismo no especifica el método de etiquetado que se utiliza para revelar el antígeno de interés; por lo tanto, esta terminología a menudo se combina con la técnica de detección para delinear claramente el método de etiquetado: inmunohistoquímica cromogénica (CIH) para indicar cuándo el anticuerpo secundario se conjuga con una enzima, como la peroxidasa; o IHQ fluorescente para indicar cuándo el anticuerpo secundario se conjuga con un fluoróforo, como el isotiocianato de fluoresceína (FITC) o la tetrametilrodamina (TRITC). La selectividad de IHQ permite a los médicos e investigadores visualizar la expresión y distribución de proteínas a través de los tejidos, a través de varios estados de salud y enfermedad10. En el ámbito clínico, la IHQ se usa comúnmente para diagnosticar el cáncer, así como para determinar las diferencias en varios tipos de cáncer. IHQ también se ha utilizado para confirmar diferentes tipos de infecciones microbianas dentro del cuerpo, como la hepatitis B o C11. En la investigación biomédica, la IHQ se utiliza a menudo para mapear la expresión de proteínas en los tejidos y es importante para identificar proteínas anormales observadas en estados de enfermedad. Por ejemplo, la neurodegeneración a menudo se acompaña de la acumulación de proteínas anormales en el cerebro, como placas Αβ y ovillos neurofibrilares en la enfermedad de Alzheimer. Los modelos animales a menudo se desarrollan para imitar estos estados patológicos, y la IHQ es un método que los investigadores utilizan para localizar y cuantificar las proteínas de interés10,12,13. A su vez, podemos aprender más sobre las causas de estas enfermedades y las complicaciones que surgen con ellas.
Hay muchos pasos involucrados en la realización de IHC. Primero, el tejido de interés se recolecta y se prepara para la tinción. Podría decirse que la mayoría de los investigadores preparan muestras de tejido fijas, siendo óptima la perfusión del fijador a través del sistema circulatorio ya que preserva la morfología14,15. También se puede utilizar la fijación posterior de muestras de tejido, pero puede producir resultados inferiores a los ideales16. Los fijadores de reticulación, como el formaldehído, actúan creando enlaces químicos entre las proteínas en el tejido17. Luego, el tejido fijo se corta en capas o secciones muy delgadas con un micrótomo, y muchos investigadores prefieren recolectar secciones congeladas con un criostato. A partir de ahí, el tejido se recoge y se monta directamente en un portaobjetos de microscopio (método montado en portaobjetos) o se suspende en una solución (método de flotación libre), como la solución salina tamponada con fosfato (PBS)18. El método de recolección utilizado está predeterminado en función de las necesidades del investigador, y cada uno de estos dos métodos presenta sus propias ventajas y desventajas.
El método montado en portaobjetos es, con mucho, el más utilizado, con un beneficio importante que es que se pueden preparar secciones muy delgadas (10-14 μm), lo cual es importante, por ejemplo, para investigar las interacciones proteína-proteína. También hay un manejo mínimo de la muestra, lo que disminuye el daño potencial a la integridad estructural del tejido19. Los investigadores a menudo usan esta técnica con tejido fresco congelado (tejido que se congela inmediatamente con hielo seco, isopentano, etc.), que es muy delicado en comparación con el tejido fijo y se debe tener mucho cuidado para evitar la descongelación de la muestra. Otra ventaja del uso de secciones montadas en guías es que generalmente no se requieren grandes volúmenes de soluciones para teñir4. Por lo tanto, los investigadores pueden usar una cantidad menor de anticuerpos costosos u otros productos químicos para completar la mancha. Además, es posible montar secciones de varios grupos experimentales diferentes en la misma diapositiva, lo que puede ser ventajoso, especialmente durante la adquisición de imágenes. Por otro lado, hay algunas desventajas de usar secciones montadas en portaobjetos, sobre todo que la sección de tejido se adhiere al portaobjetos, lo que restringe la penetración de anticuerpos a un lado de la sección, lo que limita el grosor de la sección y la representación 3D del tejido. También puede suceder que durante los lavados, los bordes del tejido y secciones enteras se desprendan del portaobjetos, haciendo inútil todo el experimento. Además, la IHQ generalmente debe realizarse con relativa rapidez cuando se utiliza el enfoque montado en portaobjetos para evitar la degradación del epítopo del antígeno 20,21 con portaobjetos sin procesar almacenados típicamente a -20 o -80 °C, a menudo cubiertos y almacenados horizontalmente o en cajas portaobjetos, lo que resulta en una huella de almacenamiento relativamente grande. Por último, la técnica montada en portaobjetos también puede llevar mucho tiempo si los investigadores deben manejar un gran número de portaobjetos para procesar un gran número de secciones de tejido.
Debido a algunos de estos desafíos utilizando el método montado en deslizamiento, una modificación llamada método de flotación libre se ha convertido en una alternativa popular. Esta técnica entró en la literatura en los años 1960-70 22,23,24, ganando popularidad en la década de 1980 25,26,27,28,29, y ahora es un método bien establecido que consiste en realizar la tinción en las secciones recogidas en suspensión en lugar de adherirse a una diapositiva 12,30,31 . No se recomienda el método de flotación libre cuando las secciones de tejido son inferiores a 20 μm; Sin embargo, en nuestra experiencia, es el enfoque de elección cuando se van a teñir secciones más gruesas (40-50 μm). Un beneficio distintivo es que los anticuerpos pueden penetrar secciones flotantes desde todos los ángulos y generar menos tinción de fondo debido a un lavado más efectivo, todo lo que resulta en una mejor señalización al obtener imágenes. Además, las secciones se montan en los portaobjetos después del procesamiento, eliminando así la posibilidad de desprendimiento de tejido y disminuyendo el tiempo que ocupa el criostato. El método de flotación libre también puede ser mucho menos intensivo en mano de obra, especialmente para estudios biomédicos a gran escala. Por ejemplo, es posible teñir muchas secciones (18-40) de la misma muestra juntas en el mismo pocillo, lo que ahorra tiempo al realizar los pasos de lavado e incubación de anticuerpos. Además, dado que se puede montar un número mayor (12-16) de secciones por diapositiva utilizando este enfoque, a menudo es más conveniente y más rápido para el investigador ver e imaginar secciones. En particular, durante el montaje de rodajas de tejido en los portaobjetos, las secciones se pueden unir y separar hasta obtener la orientación deseada. Los investigadores también suelen utilizar concentraciones ligeramente más bajas de anticuerpos utilizando el método de flotación libre, y dado que las incubaciones se realizan en tubos de microcentrífuga, los anticuerpos se pueden recolectar y conservar fácilmente con azida de sodio para su reutilización (véase el Paso 5.1). Otra ventaja es que las secciones pueden almacenarse directamente a -80 °C en pequeños tubos de microcentrífuga con solución crioprotectora32, minimizando así el espacio de almacenamiento y maximizando la longevidad de las muestras33. Una desventaja de usar esta técnica es que las secciones se manejan mucho y, por lo tanto, son propensas a dañarse. Esto, sin embargo, se puede mitigar mediante el uso de bajas velocidades de agitación y rotación, así como la capacitación adecuada de los investigadores sobre cómo transferir las muestras y montar las secciones en las diapositivas.
En conjunto, IHQ es una herramienta establecida y esencial para visualizar y localizar la expresión de proteínas en los campos de investigación clínica y biomédica. La IHQ de flotación libre es un método eficiente, flexible y económico, especialmente cuando se realizan estudios histológicos a gran escala. Aquí, presentamos un protocolo confiable de IHQ fluorescente de flotación libre para la comunidad científica que se puede adaptar en consecuencia para IHC cromogénica y otras tinciones como hematoxilina y eosina o tinción de violeta de cresil.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding molds</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF98-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum, heat inactivated</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide boxes</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>71370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48393-081</td>
			<td>24 x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular staining dish</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>70312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round artist paintbrush #2</td>
			<td>Princeton Select Series</td>
			<td>3750R</td>
			<td>Brand not important</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen matrix for embedding</td>
			<td>OCT Tissue-Tek, Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stain tray &#8211; slide staining system</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>71396-B</td>
			<td>Use dark lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Micro Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS</td>
			<td>User preference</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield antifade mounting medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Non-hardening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well inserts for 12-well plates</td>
			<td>Corning Netwells</td>
			<td>3477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Well inserts for 6-well plates</td>
			<td>Corning Netwells</td>
			<td>3479</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman filter paper</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>WHA1440042</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

histological-based stainings using free-floating tissue sections

La inmunohistoquímica es una técnica ampliamente utilizada para visualizar estructuras tisulares específicas, así como la expresión y localización de proteínas. Dos enfoques alternativos son ampliamente utilizados para manejar las secciones de tejido durante el procedimiento de tinción, un enfoque consiste en montar las secciones directamente en portaobjetos de vidrio, mientras que un segundo enfoque, el de flotación libre, permite mantener y teñir secciones fijas mientras están suspendidas en solución. Aunque los enfoques montados en diapositivas y flotantes libres pueden producir resultados similares, la técnica de flotación libre permite una mejor penetración de anticuerpos y, por lo tanto, debe ser el método de elección cuando se van a utilizar secciones más gruesas para la reconstrucción 3D de los tejidos, por ejemplo, cuando el enfoque del experimento es obtener información sobre proyecciones dendríticas y axonales en regiones cerebrales. Además, dado que las secciones se mantienen en solución, una sola alícuota puede acomodar fácilmente de 30 a 40 secciones, cuyo manejo es menos laborioso, particularmente en estudios biomédicos a gran escala. Aquí, ilustramos cómo aplicar el método de flotación libre a la tinción inmunohistoquímica fluorescente, con un enfoque principal en las secciones del cerebro. También discutiremos cómo la técnica de flotación libre puede modificarse fácilmente para adaptarse a las necesidades individuales de los investigadores y adaptarse a otros tejidos, así como a otras tinciones basadas en histoquímica, como hematoxilina y eosina y violeta de cresil, siempre que las muestras de tejido se fijen correctamente, generalmente con paraformaldehído o formalina.

El esquema general del uso del método de flotación libre para realizar un ensayo inmunohistoquímico fluorescente se ilustra en la Figura 1. En la Figura 2 se muestra un ejemplo representativo de IHQ fluorescente utilizando el método de flotación libre en cerebro de ratón que examina la expresión de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) con un aumento menor y más alto para ilustrar la calidad general de la tinción. Este enfoque también es apropiado ...

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Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections

La técnica de flotación libre permite a los investigadores realizar tinciones histológicas, incluida la inmunohistoquímica en secciones de tejido fijo para visualizar estructuras biológicas, tipo de célula y expresión y localización de proteínas. Esta es una técnica histoquímica eficiente y confiable que puede ser útil para investigar una multitud de tejidos, como el cerebro, el corazón y el hígado.

Tinciones histológicas con secciones de tejido flotante libre

Immunohistochemistry is a widely used technique to visualize specific tissue structures as well as protein expression and localization. Two alternative ...

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Research

JoVE Journal

Biology

17.7K vistas.  University of Rhode Island. La técnica de flotación libre permite a los investigadores realizar tinciones histológicas, incluida la inmunohistoquímica en secciones de tejido fijo para visualizar estructuras biológicas, tipo de célula y expresión y localización de proteínas. Esta es una técnica histoquímica eficiente y confiable que puede ser útil para investigar una multitud de tejidos, como el cerebro, el corazón y el hígado.

Video: Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific antibodies. There are two methods: the direct and indirect method. In this experiment, we will only describe the use of indirect IHC staining. Indirect IHC staining utilizes highly specific primary and biotin-conjugated secondary antibodies. Primary antibodies are utilized to discretely identify proteins of interest by binding to a specific epitope, while secondary antibodies subtract for non-specific background staining and amplify signal by forming complexes to the primary antibody. Slides can either be generated from frozen sections, or paraffin embedded sections mounted on glass slides. In this protocol, we discuss the preparation of paraffin-embedded sections by dewaxing, hydration using an alcohol gradient, heat induced antigen retrieval, and blocking of endogenous peroxidase activity and non-specific binding sites. Some sections are then stained with antibodies specific for T cell marker CD8 and while others are stained for tyrosine hydroxylase. The slides are subsequently treated with appropriate secondary antibodies conjugated to biotin, then developed utilizing avidin-conjugated horseradish peroxidase (HRP) with Diaminiobenzidine (DAB) as substrate. Following development, the slides are counterstained for contrast, and mounted under coverslips with permount. After adequate drying, these slides are then ready for imaging.

Inmunohistoquímica: las secciones de parafina utilizando la Vectastain ABC Kit de Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Investigación

Biología

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

Inmunohistoquímica en secciones de parafina de la epidermis del ratón Utilizando anticuerpos fluorescentes

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is determined. Conventional preparation of tissues for PCR-ready DNA often take several hours to days, depending on the tissue sample. The genotype of the sample may thus be delayed for several days, which is not an option for many different types of experiments. Here we demonstrate the complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR Kit. First, we demonstrate the fifteen-minute extraction of DNA from the tissue sample. Then, we demonstrate the real time read-out of the PCR amplification of the sample, which allows for the identification of a positive sample as it is being amplified. Together, the rapid extraction and real-time readout allow for a prompt identification of genotype of a variety different types of tissues through the reliable method of PCR.

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma&#039;s Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

The complete genotyping of a mouse tail sample, including tissue digestion and PCR readout, is done in one and a half hours using Sigma's SYBR Green Extract-N-Amp Tissue PCR kit.

Genotipificación rápida de tejido de ratón utilizando extracto-N-Amp tejido Sigma PCR Kit

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is ...

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Actina Co-sedimentación de ensayo, pues el análisis de proteína de unión a la F-actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Las secciones incluidas en parafina y congeladas de Drosophila Los músculos de Adultos

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at different developmental stages. Epigenetic regulation contributes to a broad spectrum of biological processes, including cellular differentiation during embryonic development and homeostasis in adulthood. A critical strategy in epigenetic studies is to examine how various histone modifications and chromatin factors regulate gene expression. To address this, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) is used widely to obtain a snapshot of the association of particular factors with DNA in the cells of interest.
ChIP technique commonly uses cultured cells as starting material, which can be obtained in abundance and homogeneity to generate reproducible data. However, there are several caveats: First, the environment to grow cells in Petri dish is different from that in vivo, thus may not reflect the endogenous chromatin state of cells in a living organism. Second, not all types of cells can be cultured ex vivo. There are only a limited number of cell lines, from which people can obtain enough material for ChIP assay.
Here we describe a method to do ChIP experiment using Drosophila tissues. The starting material is dissected tissue from a living animal, thus can accurately reflect the endogenous chromatin state. The adaptability of this method with many different types of tissue will allow researchers to address a lot more biologically relevant questions regarding epigenetic regulation in vivo1, 2. Combining this method with high-throughput sequencing (ChIP-seq) will further allow researchers to obtain an epigenomic landscape.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recently high-throughput sequencing technology has greatly increased sensitivity of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment and prompted its application using purified cells or dissected tissue. Here we delineate a method to use ChIP technique with Drosophila tissue, which can address the endogenous chromatin state in a well-characterized biological system.

Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP), utilizando Drosophila Tejido

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

Un Protocolo Automatizado Rápido de Fibra Análisis Población en músculo de rata Secciones representativas Uso de la cadena pesada de miosina inmunohistoquímica

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

Use of Anti-phospho-girdin Antibodies to Visualize Intestinal Tuft Cells in Free-Floating Mouse Jejunum Cryosections

The actin binding protein girdin is a cytosolic protein that is required for actin remodeling to trigger cell migration in various tissues. Girdin is phosphorylated by both receptor and non-receptor tyrosine kinases at tyrosine 1798. Omori et al. developed site- and phosphorylation status-specific antibodies against human girdin at tyrosine-1798 (pY1798), which specifically bind to phosphorylated tyrosine-1798, but not to unphosphorylated tyrosine-1798. pY1798 antibodies have been used to specifically label tuft cells (TCs) that are present in mammalian gastrointestinal tissues, but the function of these cells is unclear. This protocol allows the robust visualization of TCs in the jejunum using pY1798 antibodies and immunofluorescence. To ensure successful and simple TC visualization, this protocol includes two histological techniques: production of free-floating cryosections from gelatin-filled jejunum tissue, and low-temperature antigen retrieval at 50 &#176;C for 3 h. Filling the jejunum with gelatin maintains the shape of free-floating sections throughout the staining procedure, whereas low-temperature antigen retrieval ensures robust signals from TCs. Successful use of this protocol results in pY1798 staining of TCs distributed from villus tip to crypt. Stained TCs have a spool-shaped soma and fluorescent signals condense at the lumenal tip, which corresponds to the protruding &#39;tuft.&#39;&#160;Phalloidin staining colocalized with pY1798-positive TCs at the thickened brush border, and corresponds to a rootlet mass extending from the TC tuft. This protocol could be used to examine TCs in human biopsy samples collected with gastrointestinal endoscopes. Furthermore, TCs were recently reported to accumulate following parasite infection in mice, suggesting that this protocol could have applications for diagnosis of parasite infections in the human gut.

Kuga et al. discovered that phosphorylation-status specific antibodies against the actin binding protein girdin phosphorylated at tyrosine 1798 (pY1798) can be used to label tuft cells (TCs). This protocol allows robust visualization of TCs using immunofluorescent staining of free-floating jejunum cryosections with pY1798 antibodies.

Uso de anticuerpos Anti-phospho-girdin visualizar células de penacho Intestinal en Cryosections de yeyuno ratón flotante

The actin binding protein girdin is a cytosolic protein that is required for actin remodeling to trigger cell migration in various tissues. Girdin is ...

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a mixed cell population in a structured architecture that impacts function, and human islets are widely variable in cell type composition. Current frequently used methods to study cultured islets include molecular studies performed on whole islets, lumping disparate islet cell types together, or microscopy or molecular studies on dispersed islet cells, disrupting islet architecture. For in vivo islet studies, paraffin-embedded pancreas sectioning is a powerful technique to assess cell-specific outcomes in the native pancreatic environment. Studying post-culture islets by paraffin sectioning would offer several advantages: detection of multiple outcomes on the same islets (potentially even the exact-same islets, using serial sections), cell-type-specific measurements, and maintaining native islet cell-cell and cell-substratum interactions both during experimental exposure and for analysis. However, existing techniques for embedding isolated islets post-culture are inefficient, time consuming, prone to loss of material, and generally produce sections with inadequate islet numbers to be useful for quantifying outcomes. Clinical pathology laboratory cell block preparation facilities are inaccessible and impractical for basic research laboratories. We have developed an improved, simplified bench-top method that generates sections with robust yield and distribution of islets. Fixed islets are resuspended in warm histological agarose gel and pipetted into a flat disc on a standard glass slide, such that the islets are distributed in a plane. After standard dehydration and embedding, multiple (10+) 4 - 5 &#181;m sections can be cut from the same islet block. Using this method, histological&#160;and immunofluorescent analyses can be performed on mouse, rat, and human islets. This is an effective, inexpensive, time-saving approach to assess cell-type-specific, intact-architecture outcomes from cultured islets.

Ex vivo pancreatic islet studies are important for diabetes research. Existing techniques to study cultured islets in their native 3-dimensional architecture are time consuming, inefficient, and infrequently used. This work describes a new, simple, and efficient method for generating high-quality paraffin sections of whole cultured islets.

Islote pancreático inclusión de secciones de la parafina

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

Y-27632 Enriches the Yield of Human Melanocytes from Adult Skin Tissues

The isolation and culture of primary melanocytes from skin tissues is very important for biological research and has been widely used for clinical applications. Isolating primary melanocytes from skin tissues by the conventional method usually takes about 3 to 4 weeks to passage sufficiently. More importantly, the tissues used are usually newborn foreskins and it is still a challenge to efficiently isolate primary melanocytes from adult tissues. We recently developed a new isolation method for melanocytes that adds Y-27632, a Rho kinase inhibitor, to the initial culture medium for 48 h. Compared with the conventional protocol, this new method dramatically increases the yield of melanocytes and shortens the time required to isolate melanocytes from foreskin tissues. We now describe this new method in more detail using adult epidermis to efficiently culture primary melanocytes. Importantly, we show that melanocytes obtained from adult tissues prepared by this new method can function normally. This new protocol will significantly benefit studies of pigmentation defects and melanomas using primary melanocytes prepared from easily accessed adult skin tissues.

This paper reports that the addition of Y-27632 to TIVA medium can significantly increase the yield of melanocytes from adult skin tissues.

Speed

Subtitles

Tinciones histológicas con secciones de tejido flotante libre