Ulusal Yaşlanma Enstitüsü'ne (K99/R00 AG055683'ten JMR'ye), George ve Anne Ryan Sinirbilim Enstitüsü'ne (EP, GC, JMR), Rhode Island Üniversitesi Eczacılık Fakültesi'ne (EP, GC, JMR) ve Konung Gustaf V:s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse'ye (JMR) teşekkür ederiz. Harvard Tıp Fakültesi Genetik Bölümü Profesörü Susan Dymecki ile eğitim alan doktora öğrencisi Rebecca Senft'e, bizi serbest yüzen yöntemle tanıştırdığı için teşekkür ederiz. Şekil 1'de kullanılan bazı görüntüler "kullanımı ücretsiz, paylaşması veya değiştirmesi, hatta ticari olarak bile ücretsiz" kaynaklardan elde edilmiştir: fare ve mikrosantrifüj tüpü (Pixabay), fare beyni (Jonas Töle, Wikimedia Commons), kriyostat ve fare beyni bölümü (DataBase Yaşam Bilimleri Merkezi, Wikimedia Commons), cam kap (OpenClipart, FreeSvg.org) ve mikroskop (Theresa Knott, Open Clip Art Library).

1. Kriyoseksiyon için doku hazırlığı
<ol><li>Uygun bir numune matrisi kullanarak bir numune bloğu oluşturmak için sabit dokuları uygun bir gömme kalıbına gömün (bkz. Malzeme Tablosu) ve kuru buz üzerinde dondurun. Numune bloklarını kesitlenmeye hazır olana kadar -80 °C'de saklayın. NOT: Sabit dokular tipik olarak, yetişkin (yaklaşık 2,5 – 30 aylık) erkek veya dişi kemirgenlerin (fare veya sıçan)34, mevcut etik izne uygun olarak, uygun bir fiksatif (örneğin% 10 formalin) ile perfüze edilmesiyle, ardından 4 ° C'de 12 saat boyunca aynı fiksatif içinde sabitleme sonrası dokular, 1x PBS ile üç kez yıkanarak hazırlanır. ve dokuları% 15 ve% 30 oranında sakkaroz, gece boyunca veya dokular batana kadar 1x PBS'desakkaroz 35. Araştırmacılar bu genel protokolü farklı gelişim aşamalarına uyarlamaya çalışabilirler.</li>
</ol>2. Kriyoseksiyon
<ol><li>Kesitlemeye hazır olduğunda, dokunun parçalanmasını önlemek için kesitlemeden önce kriyostattaki numuneleri en az 1-2 saat iklimlendirin.</li>
	<li>Bir kriyostat kullanarak, dokuyu bölümlere ayırın (20-50 μm) ve 1x PBS çözeltisi ile doldurulmuş 6 veya 12 delikli eklerde toplayın (bkz. NOT: Kesit kalınlığına, ne kadar doku toplanacağına ve kullanılan kuyu eklerinin sayısına bağlı olarak, her kuyu kuyu için yaklaşık 10 ila 40 dilim arasında değişen sayıda kesit içerecektir. Örneğin, tüm beyin 40 μm'de kesitlenirse, 12 delikli ekler kullanılarak her bir kuyuda yaklaşık 18-24 bölüm toplanacaktır. Ayrıca, 20 μm kesitlerin kullanımı biraz zor olabilir, bu nedenle toplu boyama için 40 μm önerilir (bkz.</li>
</ol>3. Bölümlerin depolanması
<ol><li>Toplandıktan sonra, bölümleri taze hazırlanmış 1x PBS ile 5 dakika boyunca yıkayın. 3 kez tekrarlayın.</li>
	<li>Bölümleri 1-1.5 mL depolama çözeltisi ile doldurulmuş 2 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın (250 mL için, 70 g sakaroz, 75 mL etilen glikol karıştırın ve 0.1 M fosfat tamponu ile hacme getirin).</li>
	<li>Boyama için hazır olana kadar -80 ° C'de saklayın.</li>
</ol>4. Boyama Günü I
<ol><li>Numuneleri dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığında (RT) 10 - 20 dakika boyunca dengeleyin.</li>
	<li>Depolama solüsyonunu bölümlerden ayırmak için bölümleri 6 delikli bir plakadaki bir kuyu ucuna dökün.</li>
	<li>Kuyu ucunu yaklaşık 6 mL 1x TBS içeren başka bir kuyuya taşıyın. RT'de düşük hız kullanarak yörüngesel bir çalkalayıcıda her biri 5 dakika boyunca 1x TBS ile 3 kez yıkayın.</li>
	<li>Bölümler yıkanırken,% 0.3 Triton X-100 ve% 3 normal serum (örneğin, normal at serumu) ile 1x TBS'den oluşan bir bloke geçirgenlik çözeltisinden 7 mL (numune başına) hazırlayın. Düşük hız kullanarak yörüngesel çalkalayıcıda RT'de 30 dakika boyunca bölümleri engelleyin. NOT: Sera ile blokaj, antikorların dokuya veya spesifik olmayan Fc-reseptörlerine spesifik olmayan bağlanmasını önler – ikincil antikor türleriyle eşleşen bir serum önerilir, ancak mevcut değilse, birincil antikor konakçı hayvandan farklı bir türden herhangi bir normal serum kullanılabilir. Deterjan Triton X-100, dokuyu geçirgenleştirerek daha iyi antikor penetrasyonu sağlar.</li>
	<li>% 0.3 Triton X-100 ve% 1 normal serum ile 1x TBS'de seçilmiş birincil antikordan (uygun şekilde seyreltilmiş) oluşan primer antikor çözeltisi örneği başına 1 mL hazırlayın (bakınız Adım 4.4 Not). Kuyu girişinden kesitleri, ilgilenilen antijen (ler) e bağlanmak için birincil antikor çözeltisi içeren 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. NOT: Birden fazla primer antikor kullanılabilir (farklı konakçı türlerde üretilir).</li>
	<li>Düşük hız (örneğin, 7 rpm hız) kullanan döner bir karıştırıcı üzerine kesitli 2 mL mikrosantrifüj tüpü yerleştirin ve 4 ° C'de 12-16 saat boyunca gece boyunca inkübe edin.</li>
</ol>5. Boyama Günü II
<ol><li>Ertesi gün, bölümleri birincil antikor çözeltisinden ayırmak için bölümleri 6 delikli bir plakadaki bir kuyu içine dökün. NOT: Antikor çözeltisi toplanabilir ve tekrar kullanılabilir; mikrobiyal büyümeyi inhibe etmek için% 0.02 (w / v) sodyum azid ekleyin.</li>
	<li>RT'de 1x TBS ile bölümleri 3 kez yıkayın (ilk 2 yıkama için 30 s ve son yıkama için 10 dakika).</li>
	<li>% 0.3 Triton X-100 ve% 1 normal serum (ışıktan kalkan çözeltisi) ile 1x TBS'de uygun sekonder antikordan (buna göre seyreltilmiş) oluşan ikincil antikor çözeltisi örneği başına 1 mL hazırlayın. NOT: Konjuge sekonder antikor ile dolaylı etiketleme, sinyali yükseltir ve protein hedefinin kolorimetrik veya floresan görselleştirmesine izin verir.</li>
	<li>Kesitleri ikincil antikor çözeltisi içeren 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Düşük hız kullanarak yörüngesel çalkalayıcıda RT'de 2 saat boyunca inkübe edin (ışıktan kalkan çözeltisi).</li>
	<li>Bölümleri ikincil antikor çözeltisinden ayırmak için bölümleri 6 delikli bir plakadaki bir kuyu içine dökün.</li>
	<li>Numuneleri ışıktan korumaya devam ederek, RT'de 30 s için 1x TBS ile 2 kez yıkayın. Daha sonra 1x TBS'de 15 dakika yıkayın, isterseniz DAPI (1-0.1 μg / ml) ekleyin.</li>
</ol>6. Montaj
<ol><li>Bölümleri bir bardağa dökün, dikdörtgen histolojik oda dörtte üçünü 1x TBS ile doldurun.</li>
	<li>Bir cam slaytı 1x TBS'ye batırın ve bölümleri slayda doğru koaksiyel hale getirmek için ince bir boya fırçası kullanın.</li>
	<li>Bölümlere slaytın üzerine hafifçe dokunarak kırışıklık veya kıvrım olmadığından emin olun.</li>
	<li>Tüm bölümler slayt(lar)a monte edilene kadar bu işlemi tekrarlayın. NOT: Örneğin, tüm bir beyin 40 μm'de kesitlendiğinde, 18-24 bölüm içeren bir aliquot ile 12 kuyucuklu eklerde toplandığında; dilimler tipik olarak 1-2 slayta monte edilir, ancak araştırmacının tercihine bağlı olarak slayt başına daha az bölüm de monte edilebilir.</li>
</ol>7. Kapak kaydırma
<ol><li>Kesitler slayt(lar)ın üzerine kurutulduktan sonra, RT'de yaklaşık 10-15 dakika veya kesitler opak görünene kadar (slaytları ışıktan korumayı unutmayın), uygun bir sulu montaj ortamı uygulayın (sertleştirme veya sertleştirmeyen). Antifading, floresan konjuge sekonder antikor kullanılıyorsa tercih edilir. NOT: Sertleştirme montaj ortamı kullanılırken floresan kalitesi daha düşük olabilir, ancak kızaklar daha uzun süre dayanmalıdır.</li>
	<li>Cımbız kullanarak, ortamın üstüne bir kapak parçası yerleştirin. Kapağı filtre kağıdıyla örtün ve fazla montaj ortamını çıkarmak için sıkıca bastırın. NOT: Sertleşmeyen bir montaj parçası kullanıyorsanız, kapağın kaydırılmış sürgüsünün kenarlarını sızdırmaz hale getirmek için şeffaf oje ile boyayın.</li>
	<li>Uygun bir mikroskop kullanarak görüntü bölümleri. 4 °C'de karanlık bir slayt kutusunda saklayın. NOT: Bölümler, lazer tarama konfokal ve ters veya dik geniş alan floresansı gibi çeşitli mikroskoplar kullanılarak, araştırmacının ihtiyaçlarına göre büyütmelerde (örneğin, 10x, 20x, 40x) görüntülenebilir.</li>
</ol>

<ol><li>Childs, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathobiology+of+Human+Disease.+Part+IV%3A+Techniques+in+Experimental+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pathobiology of Human Disease. Part IV: Techniques in Experimental Pathology.</a> Journal of Experimental Medicine. 381923, 3775-3796 (2014).</li>
<li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+Properties+of+an+Antibody+Containing+a+Fluorescent+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group.</a> Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li>
<li>Goldman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies%3A+indispensable+tools+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Antibodies: indispensable tools for biomedical research.</a> Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 593-595 (2000).</li>
<li>Taylor, S. N. Using Antibodies: A Laboratory Manual. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTaylor%2C+SN+%22The+Quarterly+Review+of+Biology%22">The Quarterly Review of Biology</a>. Harlow, E. D., Lane, D. 74 (3), 374(1999).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+NationalAcademy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the NationalAcademy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Hermersdörfer, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermersd%C3%B6rfer%2C+H+%22Immunocytochemistry.+A+Practical+Approach%22">Immunocytochemistry. A Practical Approach</a>. Beesley, J. E. 38 (3), IRL Press at Oxford University Press. Oxford, New York, Tokyo. 348-348 (1994).</li>
<li>Schacht, V., Kern, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basics+of+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Basics of Immunohistochemistry.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).</li>
<li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+Review+of+Cytology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cytology%22%5BJournal%5D)">International Review of Cytology.</a> International Review of Cytology. 5, 1-23 (1956).</li>
<li>Mepham, B. L., Britten, K. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunostaining+Methods+for+Frozen+and+Paraffin+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphoproliferative+Diseases%22%5BJournal%5D)">Immunostaining Methods for Frozen and Paraffin Sections.</a> Lymphoproliferative Diseases. , 187-211 (1990).</li>
<li>Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+%26+Bioallied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Applications of immunohistochemistry.</a> Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4, Suppl 2 307-309 (2012).</li>
<li>Li, A., Yang, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+Molecular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods in Molecular Biology.</a> Methods in Molecular Biology. 2108, Clifton, N.J. 43-55 (2020).</li>
<li>Hökfelt, T., Fuxe, K., Goldstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+Immunohistochemistry+to+Studies+on+Monoamine+Cell+Systems+with+Special+Reference+To+Nervous+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Applications of Immunohistochemistry to Studies on Monoamine Cell Systems with Special Reference To Nervous Tissues.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 254, 407-432 (1975).</li>
<li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+transcriptomic+and+anatomic+atlas+of+mouse+dorsal+raphe+Pet1+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A single-cell transcriptomic and anatomic atlas of mouse dorsal raphe Pet1 neurons.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Koenig, H., Groat, R. A., Windle, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Physiological+Approach+to+Perfusion-Flxation+of+Tissues+with+Formalin%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">A Physiological Approach to Perfusion-Flxation of Tissues with Formalin.</a> Stain Technology. 20 (1), 13-22 (1945).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fixatives+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. 588, Clifton, N.J. 55-61 (2010).</li>
<li>van der Loos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+focus+on+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">A focus on fixation.</a> Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 141-154 (2007).</li>
<li>Canene-Adams, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry.</a> Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).</li>
<li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+on+freely+floating+fixed+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry on freely floating fixed tissue sections.</a> Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).</li>
<li>Sundquist, S. J., Nisenbaum, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Fos%3A+rapid+protocols+for+single-+and+double-labeling+c-Fos+immunohistochemistry+in+fresh+frozen+brain+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast Fos: rapid protocols for single- and double-labeling c-Fos immunohistochemistry in fresh frozen brain sections.</a> Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 9-20 (2005).</li>
<li>Bertheau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+of+immunohistochemical+reactivity+on+stored+paraffin+slides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Variability of immunohistochemical reactivity on stored paraffin slides.</a> Journal of Clinical Pathology. 51 (5), 370-374 (1998).</li>
<li>Blind, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenicity+testing+by+immunohistochemistry+after+tissue+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+ofClinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Antigenicity testing by immunohistochemistry after tissue oxidation.</a> Journal ofClinical Pathology. 61 (1), 79-83 (2007).</li>
<li>Desmet, V. J., Krstulović, B., Damme, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+study+of+rat+liver+in+alpha-naphthyl+isothiocyanate+%28ANIT%29+induced+cholestasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis.</a> The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).</li>
<li>Bulmer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Histochemistry+of+Ovarian+Macrophages+in+the+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The Histochemistry of Ovarian Macrophages in the Rat.</a> Journal of Anatomy. 98, 313-319 (1964).</li>
<li>Lönnerholm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+Demonstration+of+Carbonic+Anhydrase+Activity+in+the+Human+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Histochemical Demonstration of Carbonic Anhydrase Activity in the Human Kidney.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 88 (4), 455-468 (1973).</li>
<li>Ronnekleiv, O. K., Naylor, B. R., Bond, C. T., Adelman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Immunohistochemistry+for+Gonadotropin-Releasing+Hormone+%28GnRH%29+and+Pro-GnRH%2C+and+in+Situ+Hybridization+for+GnRH+Messenger+Ribonucleic+Acid+in+Rat+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Combined Immunohistochemistry for Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) and Pro-GnRH, and in Situ Hybridization for GnRH Messenger Ribonucleic Acid in Rat Brain.</a> Molecular Endocrinology. 3 (2), 363-371 (1989).</li>
<li>Nadelhaft, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sessile+drop+method+for+immunohistochemical+processing+of+unmounted+sections+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">The sessile drop method for immunohistochemical processing of unmounted sections of nervous tissue.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (12), 1344-1346 (1984).</li>
<li>Wainer, B. H., Rye, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+horseradish+peroxidase+tracing+combined+with+localization+of+choline+acetyltransferase+immunoreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Retrograde horseradish peroxidase tracing combined with localization of choline acetyltransferase immunoreactivity.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (4), 439-443 (1984).</li>
<li>Piekut, D. T., Casey, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+immunoreagents+in+Vibratome-sectioned+brain%3A+a+light+and+electron+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Penetration of immunoreagents in Vibratome-sectioned brain: a light and electron microscopic study.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 31 (5), 669-674 (1983).</li>
<li>Cowan, R. L., Wilson, C. J., Emson, P. C., Heizmann, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvalbumin-containing+gabaergic+interneurons+in+the+rat+neostriatum%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Parvalbumin-containing gabaergic interneurons in the rat neostriatum.</a> The Journal of Comparative Neurology. 302 (2), 197-205 (1990).</li>
<li>Kjell, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+Imatinib+Treatment+for+Acute+Spinal+Cord+Injury%3A+Functional+Recovery+and+Serum+Biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Delayed Imatinib Treatment for Acute Spinal Cord Injury: Functional Recovery and Serum Biomarkers.</a> Journal of Neurotrauma. 32 (21), 1645-1657 (2015).</li>
<li>Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+mitochondrial+transport+and+Parkin-independent+degeneration+of+respiratory+chain-deficient+dopamine+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12937-12942 (2011).</li>
<li>Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cryoprotectant+to+maintain+long-term+peptide+immunoreactivity+and+tissue+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology.</a> Peptides. 7 (1), 155-159 (1986).</li>
<li>Estrada, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Long-Term+Cryostorage+of+Brain+Tissue+Sections+for+Quantitative+Histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Long-Term Cryostorage of Brain Tissue Sections for Quantitative Histochemistry.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (3), 153-171 (2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+preparation+of+cryosections+for+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrastructure+Research%22%5BJournal%5D)">On the preparation of cryosections for immunocytochemistry.</a> Journal of Ultrastructure Research. 89 (1), 65-78 (1984).</li>
<li>Capelozzi, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Papel+da+imuno-histoqu%C3%ADmica+no+diagn%C3%B3stico+do+c%C3%A2ncer+de+pulm%C3%A3o%5BTitle%5D)+AND+%22Jornal+Brasileiro+de+Pneumologia%22%5BJournal%5D)">Papel da imuno-histoquímica no diagnóstico do câncer de pulmão.</a> Jornal Brasileiro de Pneumologia. 35 (4), 375-382 (2009).</li>
<li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurry%2C+RW+%22Immunocytochemistry%22">Immunocytochemistry</a>. , 65-77 (2009).</li>
<li>Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+combining+RNAscope+in+situ+hybridization+with+immunohistochemistry+in+thick+free-floating+brain+sections+and+primary+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures.</a> PloS one. 10 (3), 0120120(2015).</li>
<li>Warr, W. B., de Olmos, J. S., Heimer, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWarr%2C+WB+%22Neuroanatomical+Tract-Tracing+Methods%22">Neuroanatomical Tract-Tracing Methods</a>. , Springer. 207-262 (1981).</li>
<li>Alvarez-Buylla, A., Ling, C. Y., Kirn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cresyl+violet%3A+A+red+fluorescent+Nissl+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Cresyl violet: A red fluorescent Nissl stain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 33 (23), 129-133 (1990).</li>
</ol>

Açıklanacak bir şey yok

İmmünohistokimya (IHC), doku kesitlerinde protein ekspresyonunu ve lokalizasyonunu tanımlamada çok önemli hale gelen çok yönlü bir tekniktir. Bu tahlil, normal fonksiyon aşamalarından hastalık durumlarına kadar dokunun özelliklerini daha iyi anlamak için bilimsel topluluk genelinde kullanılır. IHC, kanser gibi hastalıkların klinik teşhisinden klinik öncesi araştırmalardaki ilk keşiflere kadar çeşitli alanlarda kullanılmaktadır10,36....

İmmünoboyama, 130 yıl önce 1890 yılında Von Behring1 tarafından serum antikorlarının keşfi ile başlayan popüler bir araştırma uygulamasıdır. 20. yüzyılın başlarında, boyalar reaksiyonları ölçmenin ve görselleştirmenin bir yolu olarak antijenlere ve daha sonra antikorlara bağlandı1 ve 1941'de Albert Coons, ışık mikroskobu 2,3'te devrim yaratan bir keşif olan ilk floresan antikor etiketlerini geliştirdi. "İmmünoboyama" terimi, Western blot, flow cytometry, ELISA, immünositokimya ve immünohistokimya 3,4 dahil olmak üzere bu prensip kullanılarak geliştirilen birçok tekniği kapsar. Western blot, doku veya hücre ekstraktlarından spesifik proteinlerin varlığını tespit eder5. Proteinler jel elektroforezi kullanılarak boyuta göre ayrılır, bir zara aktarılır ve antikorlar kullanılarak incelenir. Bu teknik, proteinin varlığını ve ne kadar protein bulunduğunu gösterir; Bununla birlikte, proteinin hücreler veya dokular içindeki lokalizasyonu hakkında herhangi bir bilgi ortaya koymaz. Başka bir yöntem olan immünositokimya (ICC), hücrelerdeki proteinleri, tipik olarak in vitro olarak yetiştirilen hücreleri etiketler. ICC, hücresel bölmelerde hem protein ekspresyonunu hem de lokalizasyonu gösterir6. Doku düzeyinde spesifik bir proteini tespit etmek ve görselleştirmek için immünohistokimya (IHC) kullanılır.
IHC, araştırmacıların bağışıklık sisteminin kimyasal özelliklerinden yararlanarak doku içindeki spesifik antijenleri hedeflemek için kullandıkları bir yöntemdir 7,8. Bir enzime veya floresan boyaya bağlı spesifik birincil ve ikincil antikorlar üretilerek, ilgilenilen antijenler çoğu dokuda etiketlenebilir ve ortaya çıkarılabilir (Mepham ve Britten'de gözden geçirildiği gibi)9. "İmmünohistokimya" terimi tek başına, ilgilenilen antijeni ortaya çıkarmak için kullanılan etiketleme yöntemini belirtmez; Bu nedenle, bu terminoloji genellikle etiketleme yöntemini açıkça tanımlamak için tespit tekniği ile birleştirilir: ikincil antikorun peroksidaz gibi bir enzime ne zaman konjuge olduğunu belirtmek için kromojenik immünohistokimya (CIH); veya ikincil antikorun floresein izotiyosiyanat (FITC) veya tetrametilrodamin (TRITC) gibi bir florofora konjuge olduğunu belirtmek için floresan IHC. IHC'nin seçiciliği, klinisyenlerin ve araştırmacıların dokular boyunca, çeşitli sağlık ve hastalık durumlarında protein ekspresyonunu ve dağılımını görselleştirmelerini sağlar10. Klinik alanda, IHC yaygın olarak kanseri teşhis etmek ve çeşitli kanser türlerindeki farklılıkları belirlemek için kullanılır. IHC ayrıca Hepatit B veya C11 gibi vücuttaki farklı mikrobiyal enfeksiyon türlerini doğrulamak için de kullanılmıştır. Biyomedikal araştırmalarda, IHC genellikle dokulardaki protein ekspresyonunu haritalamak için kullanılır ve hastalık durumlarında görülen anormal proteinleri tanımlamada önemlidir. Örneğin, nörodejenerasyona genellikle Alzheimer hastalığında Αβ plakları ve nörofibriler yumaklar gibi beyinde anormal proteinlerin birikmesi eşlik eder. Hayvan modelleri genellikle bu patolojik durumları taklit etmek için geliştirilir ve IHC, araştırmacıların ilgilendikleri proteinleri bulmak ve ölçmek için kullandıkları bir yöntemdir10,12,13. Buna karşılık, bu hastalıkların nedenleri ve onlarla ortaya çıkan komplikasyonlar hakkında daha fazla bilgi edinebiliriz.
IHC'nin gerçekleştirilmesinde birçok adım vardır. İlk olarak, ilgilenilen doku toplanır ve boyama için hazırlanır. Muhtemelen çoğu araştırmacı sabit doku örnekleri hazırlar, fiksatifin dolaşım sistemi yoluyla perfüzyonu, morfolojiyi koruduğu için optimal 14,15'tir. Doku örneklerinin fiksasyonu sonrası da kullanılabilir, ancak ideal sonuçlardan daha az sonuç verebilir16. Formaldehit gibi çapraz bağlanan fiksatörler, dokudaki proteinler arasında kimyasal bağlar oluşturarak hareket eder17. Sabit doku daha sonra bir mikrotom kullanılarak çok ince tabakalara veya bölümlere dilimlenir, birçok araştırmacı bir kriyostat kullanarak dondurulmuş bölümleri toplamayı tercih eder. Buradan doku toplanır ve ya doğrudan bir mikroskop slaydına (slayta monte edilmiş yöntem) monte edilir ya da fosfat tamponlu salin (PBS) 18 gibi bir çözelti içinde askıya alınır (serbest yüzen yöntem). Kullanılan toplama yöntemi, araştırmacının ihtiyaçlarına göre önceden belirlenir ve bu iki yöntemin her biri kendi avantaj ve dezavantajlarını sunar.
Kızağa monte edilen yöntem açık ara en yaygın kullanılanıdır, önemli bir yararı çok ince kesitlerin (10-14 μm) hazırlanabilmesidir, bu da örneğin protein-protein etkileşimlerini araştırmak için önemlidir. Ayrıca, numunenin minimum düzeyde işlenmesi vardır, bu da dokunun yapısal bütünlüğüne potansiyel hasarı azaltır19. Araştırmacılar genellikle bu tekniği sabit dokuya kıyasla çok hassas olan taze dondurulmuş doku (kuru buz, isopentan vb. kullanılarak hemen dondurulan doku) ile kullanırlar ve numunenin çözülmesini önlemek için çok özen gösterilmesi gerekir. Kızağa monte edilmiş bölümlerin kullanılmasının bir diğer avantajı, boyama için büyük hacimli çözeltilerin genellikle gerekli olmamasıdır4. Böylece, araştırmacılar lekeyi tamamlamak için daha az miktarda pahalı antikor veya diğer kimyasalları kullanabilirler. Ek olarak, birkaç farklı deney grubundan bölümleri aynı slayta monte etmek mümkündür, bu da özellikle görüntü yakalama sırasında avantajlı olabilir. Öte yandan, slayda monte edilmiş bölümlerin kullanılmasının bazı dezavantajları vardır, özellikle doku bölümünün slayda yapıştırılması, böylece bölümün bir tarafına antikor penetrasyonunu kısıtlaması, bu da kesit kalınlığını ve dokunun 3D gösterimini sınırlar. Ayrıca, yıkama sırasında, dokunun kenarlarının ve tüm bölümlerin slayttan ayrılabileceği ve tüm deneyi işe yaramaz hale getirebileceği de olabilir. Dahası, tipik olarak -20 veya -80 ° C'de saklanan, genellikle örtülmüş ve yatay olarak veya slayt kutularında saklanan işlenmemiş slaytlarla antijen epitop 20,21'in bozulmasını önlemek için slayta monte edilmiş yaklaşım kullanıldığında IHC genellikle nispeten hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir, bu da nispeten büyük bir depolama ayak izi ile sonuçlanır. Son olarak, slayta monte tekniği, araştırmacıların çok sayıda doku bölümünü işlemek için çok sayıda slaytı ele almaları gerekiyorsa da zaman alıcı olabilir.
Slayta monte edilmiş yöntemi kullanan bu zorlukların bazıları nedeniyle, serbest yüzen yöntem adı verilen bir değişiklik popüler bir alternatif haline gelmiştir. Bu teknik 1960-70'lerde literatüre girdi 22,23,24, 1980'lerde popülerlik kazandı 25,26,27,28,29 ve şimdi 12,30,31 numaralı slayta yapışmak yerine süspansiyonda toplanan bölümlerdeki lekeyi gerçekleştirmeyi içeren köklü bir yöntemdir. . Doku kesitleri 20 μm'den az olduğunda serbest yüzen yöntem önerilmez; Bununla birlikte, deneyimlerimize göre, daha kalın (40-50 μm) kesitlerin boyanması gerektiğinde tercih edilen yaklaşımdır. Belirgin bir yararı, antikorların serbest yüzen bölümlere tüm açılardan nüfuz edebilmesi ve daha etkili yıkama nedeniyle daha az arka plan lekelenmesi üretebilmesidir, bu da görüntüleme sırasında daha iyi sinyal vermeyle sonuçlanır. Ek olarak, bölümler işlemden sonra slaytlara monte edilir, böylece doku dekolmanı olasılığını ortadan kaldırır ve kriyostatı işgal eden süreyi azaltır. Serbest yüzen yöntem, özellikle büyük ölçekli biyomedikal çalışmalar için çok daha az emek yoğun olabilir. Örneğin, aynı numuneden birçok (18-40) bölümün aynı kuyuda bir araya getirilmesi mümkündür, bu da hem yıkama hem de antikor inkübasyon adımlarının gerçekleştirilmesinde zaman kazandırır. Ayrıca, bu yaklaşım kullanılarak slayt başına daha fazla sayıda (12-16) bölüm monte edilebildiğinden, araştırmacının bölümleri görüntülemesi ve görüntülemesi genellikle daha uygun ve daha hızlıdır. Özellikle, doku dilimlerinin slaytlara montajı sırasında, istenen yön elde edilene kadar bölümler takılabilir ve ayrılabilir. Araştırmacılar ayrıca serbest yüzen yöntemi kullanarak genellikle biraz daha düşük antikor konsantrasyonları kullanırlar ve inkübasyonlar mikrosantrifüj tüplerinde gerçekleştirildiğinden, antikorlar yeniden kullanım için sodyum azid ile kolayca toplanabilir ve korunabilir (bakınız Adım 5.1). Diğer bir avantaj, kesitlerin kriyoprotektan çözeltisi32 ile küçük mikrosantrifüj tüplerinde -80 ° C'de doğrudan saklanabilmesidir, böylece depolama alanını en aza indirir ve numunelerin ömrünü en üst düzeye çıkarır33. Bu tekniği kullanmanın bir dezavantajı, bölümlerin çok fazla ele alınması ve bu nedenle hasara yatkın olmasıdır. Bununla birlikte, bu, düşük sallanma ve dönme hızları kullanılarak ve ayrıca araştırmacıları numunelerin nasıl aktarılacağı ve bölümlerin slaytlara nasıl monte edileceği konusunda uygun şekilde eğiterek hafifletilebilir.
Birlikte ele alındığında, IHC hem klinik hem de biyomedikal araştırma alanlarında protein ekspresyonunu görselleştirmek ve lokalize etmek için yerleşik, gerekli bir araçtır. Serbest yüzen IHC, özellikle büyük ölçekli histolojik çalışmalar gerçekleştirirken verimli, esnek ve ekonomik bir yöntemdir. Burada, bilimsel topluluk için kromojenik IHC ve hematoksilin ve eozin veya cresyl violet boyama gibi diğer boyamalar için uygun şekilde uyarlanabilen güvenilir bir serbest yüzen floresan IHC protokolü sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>12-well plates</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Clear nail polish</td><td>User preference</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Embedding molds</td><td>Thermo Scientific</td><td>1841</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol</td><td>User preference</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Formalin solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF98-4</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum, heat inactivated</td><td>Gibco</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide boxes</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>71370</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>User preference</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibody</td><td>User preference</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Rectangular Coverslips</td><td>VWR</td><td>48393-081</td><td>24 x 50 mm</td></tr><tr><td>Rectangular staining dish</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>70312</td><td></td></tr><tr><td>Round artist paintbrush #2</td><td>Princeton Select Series</td><td>3750R</td><td>Brand not important</td></tr><tr><td>Secondary antibody</td><td>User preference</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Specimen matrix for embedding</td><td>OCT Tissue-Tek, Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Stain tray &amp;ndash; slide staining system</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>71396-B</td><td>Use dark lid</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>User preference</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Micro Slides</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td>User preference</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield antifade mounting medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Non-hardening</td></tr><tr><td>Well inserts for 12-well plates</td><td>Corning Netwells</td><td>3477</td><td></td></tr><tr><td>Well inserts for 6-well plates</td><td>Corning Netwells</td><td>3479</td><td></td></tr><tr><td>Whatman filter paper</td><td>Millapore-Sigma</td><td>WHA1440042</td><td></td></tr></tbody></table>

histological-based stainings using free-floating tissue sections

İmmünohistokimya, spesifik doku yapılarının yanı sıra protein ekspresyonu ve lokalizasyonunu görselleştirmek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Boyama prosedürü sırasında doku kesitlerini işlemek için iki alternatif yaklaşım yaygın olarak kullanılmaktadır, bir yaklaşım bölümleri doğrudan cam slaytlara monte etmekten oluşurken, ikinci bir yaklaşım olan serbest yüzen, çözelti içinde askıya alınırken sabit bölümlerin korunmasına ve boyanmasına izin verir. Slayta monte edilmiş ve serbest yüzen yaklaşımlar benzer sonuçlar verebilse de, serbest yüzen teknik daha iyi antikor penetrasyonuna izin verir ve bu nedenle dokuların 3D rekonstrüksiyonu için daha kalın bölümler kullanılacaksa, örneğin deneyin odak noktası beyin bölgelerindeki dendritik ve aksonal projeksiyonlar hakkında bilgi edinmek olduğunda tercih edilen yöntem olmalıdır. Ek olarak, bölümler çözelti içinde tutulduğundan, tek bir aliquot, özellikle büyük ölçekli biyomedikal çalışmalarda, kullanımı daha az zahmetli olan 30 ila 40 bölümü kolayca barındırabilir. Burada, serbest yüzen yöntemin floresan immünohistokimya boyamasına nasıl uygulanacağını ve beyin bölümlerine odaklanılacağını gösteriyoruz. Ayrıca, serbest yüzen tekniğin, araştırmacıların bireysel ihtiyaçlarına uyacak şekilde nasıl kolayca değiştirilebileceğini ve doku örnekleri tipik olarak paraformaldehit veya formalin ile düzgün bir şekilde sabitlendiği sürece, hematoksilin ve eozin ve cresyl violet gibi diğer histokimyasal bazlı boyamaların yanı sıra diğer dokulara nasıl uyarlanabileceğini de tartışacağız.

Bir floresan immünohistokimyasal tahlil gerçekleştirmek için serbest yüzen yöntemin kullanılmasının genel şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Glial fibriler asidik protein (GFAP) ekspresyonunu inceleyen fare beyninde serbest yüzen yöntemi kullanan floresan IHC'nin temsili örneği, boyamanın genel kalitesini göstermek için Şekil 2'de hem daha düşük hem de daha yüksek büyütmede gösterilmiştir. Bu yaklaşım, Şekil 3...

Watch this Scientific Journal Video about Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections at JoVE.com

Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections

Serbest yüzen teknik, araştırmacıların biyolojik yapıları, hücre tipini ve protein ekspresyonunu ve lokalizasyonunu görselleştirmek için sabit doku kesitlerinde immünohistokimya da dahil olmak üzere histolojik tabanlı boyamalar yapmalarını sağlar. Bu, beyin, kalp ve karaciğer gibi çok sayıda dokuyu araştırmak için yararlı olabilecek etkili ve güvenilir bir histokimyasal tekniktir.

Serbest Yüzen Doku Kesitleri Kullanılarak Histolojik Tabanlı Boyamalar

Immunohistochemistry is a widely used technique to visualize specific tissue structures as well as protein expression and localization. Two alternative ...

histological-based-stainings-using-free-floating-tissue-sections

Research

JoVE Journal

Biology

18.5K Görüntüleme.  University of Rhode Island. Serbest yüzen teknik, araştırmacıların biyolojik yapıları, hücre tipini ve protein ekspresyonunu ve lokalizasyonunu görselleştirmek için sabit doku kesitlerinde immünohistokimya da dahil olmak üzere histolojik tabanlı boyamalar yapmalarını sağlar. Bu, beyin, kalp ve karaciğer gibi çok sayıda dokuyu araştırmak için yararlı olabilecek etkili ve güvenilir bir histokimyasal tekniktir.

Video: Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

With the recent development of retinal prostheses, it is important to develop reliable techniques for assessing the safety of these devices in preclinical studies. However, the standard fixation, preparation, and automated histology procedures are not ideal. Here we describe new procedures for evaluating the health of the retina directly adjacent to an implant. Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. Previous methods have not been able to spatially localize the ocular tissue adjacent to individual electrodes within the array. In addition, standard histological processing often results in gross artifactual detachment of the retinal layers when assessing implanted eyes. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by implantation and stimulation of an implanted electrode array. Therefore, we developed a method for identifying and localizing the ocular tissue adjacent to implanted electrodes using a (color-coded) dye marking scheme, and we modified an eye fixation technique to minimize artifactual retinal detachment. This method also rendered the sclera translucent, enabling localization of individual electrodes and specific parts of an implant. Finally, we used a matched control to increase the power of the histopathological assessments. In summary, this method enables reliable and efficient discrimination and assessment of the retinal cytoarchitecture in an implanted eye.

Techniques for visualizing retinal cytoarchitecture directly adjacent to individual electrodes within a retinal stimulator.

Lokalize histopatolojik analizi için bir Retina Protez ile implant İşleme Gözler Teknikleri

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

Tıp

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brain tissue, using markers for microglia and neuronal elements as an example. Specifically, this paper is a step-by-step protocol for fluorescent visualization of microglia and neurons via immunohistochemistry for Iba1 and Pan-neuronal, respectively. Fluorescence double-labeling is particularly useful for the localization of multiple proteins within the same sample, providing the opportunity to accurately observe interactions between cell types, receptors, ligands, and/or the extracellular matrix in relation to one another as well as protein co-localization within a single cell. Unlike other visualization techniques, fluorescence immunohistochemistry staining intensity may decrease in the weeks to months following staining, unless appropriate precautions are taken. Despite this limitation, in many applications fluorescence double-labeling is preferred over alternatives such as 3,3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) or alkaline phosphatase (AP), as fluorescence is more time efficient and allows for more precise differentiation between two or more markers. The discussion includes troubleshooting tips and advice to promote success.

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

Mikroglia ve nöronlar için örnek Boyama: Cryosectioned Rat Beyin Dokusu Üzerine İmmünohistokimya için Astar

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Nörobilim

Highly-Multiplexed Tissue Imaging with Raman Dyes

Visualizing a vast scope of specific biomarkers in tissues plays a vital role in exploring the intricate organizations of complex biological systems. Hence, highly multiplexed imaging technologies have been increasingly appreciated. Here, we describe an emerging platform of highly-multiplexed vibrational imaging of specific proteins with comparable sensitivity to standard immunofluorescence via electronic pre-resonance stimulated Raman scattering (epr-SRS) imaging of rainbow-like Raman dyes. This method circumvents the limit of spectrally-resolvable channels in conventional immunofluorescence and provides a one-shot optical approach to interrogate multiple markers in tissues with subcellular resolution. It is generally compatible with standard tissue preparations, including paraformaldehyde-fixed tissues, frozen tissues, and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) human tissues. We envisage this platform will provide a more comprehensive picture of protein interactions of biological specimens, particularly for thick intact tissues. This protocol provides the workflow from antibody preparation to tissue sample staining, to SRS microscope assembly, to epr-SRS tissue imaging.

Electronic pre-resonance stimulated Raman scattering (epr-SRS) imaging of rainbow-like Raman dyes is a new platform for highly multiplexed epitope-based protein imaging. Here, we present a practical guide including antibody preparation, tissue sample staining, SRS microscope assembly, and epr-SRS tissue imaging.

Raman Boyaları ile Yüksek Oranda Çoklanmış Doku Görüntüleme

Visualizing a vast scope of specific biomarkers in tissues plays a vital role in exploring the intricate organizations of complex biological systems. ...

Biyomühendislik

A Rapid Method for Multispectral Fluorescence Imaging of Frozen Tissue Sections

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample that can provide information about antigen coexpression and spatial distribution of the markers. However, a lack of suitable antibodies for formalin-fixed tissues may restrict the nature of markers that can be detected. In addition, the staining method is time-consuming. Here we describe a rapid method to perform multispectral fluorescence imaging on frozen tissues. The method includes the fluorophore combinations used, detailed steps for the staining of mouse and human frozen tissues, and the scanning, acquisition, and analysis procedures. For staining analysis, a commercially available semiautomated multispectral fluorescence imaging system is used. Through this method, up to six different markers were stained and detected in a single frozen tissue section. The machine learning analysis software can phenotype cells that can be used for quantitative analysis. The method described here for frozen tissues is useful for the detection of markers that cannot be detected in FFPE tissues or for which antibodies are not available for FFPE tissues.

We describe a rapid staining method to perform multispectral imaging on frozen tissues.

Dondurulmuş Doku Kesitlerinin Multispektral Floresan Görüntülemesi için Hızlı Bir Yöntem

Multispectral fluorescence imaging on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues enables the detection of multiple markers in a single tissue sample ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of slice cultures in neuroscience, studies using adult nervous tissue to prepare such cultures are still scarce, particularly those from human subjects. The use of adult human tissue to prepare slice cultures is particularly attractive to enhance the understanding of human neuropathologies, as they hold unique properties typical of the mature human brain lacking in slices produced from rodent (usually neonatal) nervous tissue. This protocol describes how to use brain tissue collected from living human donors submitted to resective brain surgery to prepare short-term, free-floating slice cultures. Procedures to maintain and perform biochemical and cell biology assays using these cultures are also presented. Representative results demonstrate that the typical human cortical lamination is preserved in slices after 4 days in vitro (DIV4), with expected presence of the main neural cell types. Moreover, slices at DIV4 undergo robust cell death when challenged with a toxic stimulus (H2O2), indicating the potential of this model to serve as a platform in cell death assays. This method, a simpler and cost-effective alternative to the widely used protocol using membrane inserts, is mainly recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases. Finally, although the protocol is devoted to using cortical tissue collected from patients submitted to surgical treatment of pharmacoresistant temporal lobe epilepsy, it is argued that tissue collected from other brain regions/conditions should also be considered as sources to produce similar free-floating slice cultures.

A protocol to prepare free-floating slice cultures from adult human brain is presented. The protocol is a variation of the widely used slice culture method using membrane inserts. It is simple, cost-effective, and recommended for running short-term assays aimed to unravel mechanisms of neurodegeneration behind age-associated brain diseases.

Yetişkin İnsan Beyninden Kısa Süreli Serbest Kayan Dilim Kültürleri

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the regulation of energy metabolism and other neurobiological processes. However, the quality, reliability, and reproducibility of brain histology results may vary among laboratories. For each staining experiment, it is necessary to optimize the key procedures based on differences in species, tissues, targeted proteins, and the working conditions of the reagents. This paper demonstrates a reliable workflow in detail, including intra-aortic perfusion, brain sectioning, free-floating immunostaining, tissue mounting, and imaging, which can be followed easily by researchers in this field.
Also discussed are how to modify these procedures to satisfy the individual needs of researchers. To illustrate the reliability and efficiency of this protocol, perineuronal nets were stained with biotin-labeled Wisteria florbunda agglutinin (WFA) and arginine vasopressin (AVP) with an anti-AVP antibody in the mouse brain. Finally, the critical details for the entire procedure have been addressed, and the advantages of this protocol compared to those of other protocols. Taken together, this paper presents an optimized protocol for free-floating immunostaining of mouse brain tissue. Following this protocol makes this process easier for both junior and senior scientists to improve the quality, reliability, and reproducibility of immunostaining studies.

This protocol describes an efficient and reproducible approach for mouse brain histological studies, including perfusion, brain sectioning, free-floating immunostaining, tissue mounting, and imaging.

Fare Beyinlerinin Serbest Yüzen İmmünasyon

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and disease modeling, drug discovery, and regenerative medicine. To fully exploit these models, it is crucial to study them at cellular and subcellular levels. However, characterizing such in vitro 3D cell culture models can be technically challenging and requires specific expertise to perform effective analyses. Here, this paper provides detailed, robust, and complementary protocols to perform staining and subcellular resolution imaging of fixed in vitro 3D cell culture models ranging from 100 &#181;m to several millimeters. These protocols are applicable to a wide variety of organoids and spheroids that differ in their cell-of-origin, morphology, and culture conditions. From 3D structure harvesting to image analysis, these protocols can be completed within 4-5 days. Briefly, 3D structures are collected, fixed, and can then be processed either through paraffin-embedding and histological/immunohistochemical staining, or directly immunolabeled and prepared for optical clearing and 3D reconstruction (200 &#181;m depth) by confocal microscopy.

Here, we provide detailed, robust, and complementary protocols to perform staining and subcellular resolution imaging of fixed three-dimensional cell culture models ranging from 100 &#181;m to several millimeters, thus enabling the visualization of their morphology, cell-type composition, and interactions.

Üç Boyutlu Organoid ve Küresel Modellerin Boyama ve Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesi

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...

Biyoloji

Histological Staining of Neural Tissue

In order to examine the cellular, structural and molecular layout of tissues and organs, researchers use a method known as histological staining. In this technique, a tissue of interest is preserved using chemical fixatives and sectioned, or cut into very thin slices. A variety of staining techniques are then applied to provide contrast to the visually uniform sections. In the study of neuroanatomy, histological techniques are frequently applied to visualize and study nervous system tissue. This video focuses on histological staining techniques for neural tissue. An overview of common brain stains is provided, including those that specifically mark neuronal cell bodies, like Nissl stains, and those that selectively highlight myelinated axons, like the Luxol Fast blue stain. Immunohistological techniques, which take advantage of the specific interaction between antibodies and unique cellular proteins, are also discussed. Next, the preparation of brain samples for staining is described, including the basic steps for fixation, embedding, sectioning, and rehydration of the tissue. The presentation also provides a step-by-step procedure for immunohistological staining followed by a Nissl stain, in addition to practical applications of these techniques.

Brain Stains: Histological Staining of Neural Tissue

In order to examine the cellular, structural and molecular layout of tissues and organs, researchers use a method known as histological staining. In this ...

Education

JoVE Science Education

İleri Biyoloji

Histological Sample Preparation for Light Microscopy

Histology is the study of cells and tissues, which is typically aided by the use of a light microscope. The preparation of histological samples can vary greatly based on the inherent properties of the samples such as size and hardness as well as expected post-processing which includes planned staining techniques or other down-stream applications. As described in this video, specimen preparation typically begins with a fixation procedure to prevent degradation of the sample by naturally occurring enzymes that are released by the cells upon death. Once fixed, samples are placed into an embedding medium that is able to sufficiently support the sample. Most commonly this is paraffin wax, but other materials such as a glycerin based freezing medium and agars are also used to surround the sample during sectioning. Sectioning then takes place on a microtome or other cutting device that allows the user to shave the sample into thin slices ranging from a few microns to a few millimeters in thickness. Once cut, sections are mounted on a glass slide and stained to bring out specific features of the sample before being imaged on a microscope.

Histological Sample Prep for a Light Microscope

Histology is the study of cells and tissues, which is typically aided by the use of a light microscope.  The preparation of histological samples can vary ...

Temel Biyoloji

Genel Laboratuvar Teknikleri

Formalin-Fixed Paraffin Embedded (FFPE) Tissue Preservation: A Method for Studying Tissue Morphology

Source: Nagaraj A.S., et al., <a href="https://www.jove.com/v/58569/establishment-analysis-tumor-slice-explants-as-prerequisite-for">Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing.</a> J. Vis. Exp. (2018)
The following video describes how to preserve morphology of a tissue with formalin fixation and paraffin embedding.