Unsere FRET-Sonde und -Protokolle ermöglichen die schnelle und empfindliche Quantifizierung der freien und oberflächengebundenen Elastase- und Kathespen-G-Aktivität im Sputum von Patienten mit neutrophilen Atemwegserkrankungen. Diese Methoden ermöglichen es, verschiedene Aspekte der Proteasenpathophysiologie zu erforschen. Plattenlesermessungen erlauben große Screenings.
Die konfokale Mikroskopie visualisiert die Enzymaktivität mit subzellulärer Lösung. Während die Durchflusszytometrie die Einzelzellphänotypisierung und die Quantifizierung der Proteaseaktivität auf personalisierte Weise ermöglicht. Diese Technik kann auf verschiedene Atemwegserkrankungen wie Mukoviszidose, Bronchiektasen oder COPD ausgeweitet werden.
Und es kann an verschiedene BioProben wie Blut- oder Bronchialalveola Lavash oder Mäuseproben angepasst werden. Bevor Sie mit der Sputuminduktion beginnen, inhalieren Sie 200 Mikrogramm der Beta-2-Rezeptorantagonisten Salbutamol. Anschließend hypertone 6% Kochsalzlösung für 15 Minuten mit einem Vernebler einatmen.
Sammeln Sie den schleimerten Auswurf in einer Petrischale. Schleimklumpen aus dem Speichel mit Hilfe einer Pipettenspitze in eine Petrischale trennen. Wiegen Sie den Schleim und fügen Sie dann vier Volumenteile pro Gewicht von 10% Sputolysin und PBS zum Sputum hinzu.
Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur auf einem Schaukelschüttler für 15 Minuten, um den Schleim aufzulösen. Löschen Sie die Reaktion, indem Sie einen Milliliter kaltes PBS für jeden Milliliter von 10% Sputolysin hinzufügen. Pipetten Sie die Mischung, um eine homogene Lösung zu erhalten.
Filtern Sie die Mischung durch ein 100 Mikron Nylon-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Wiederholen Sie den Filtrationsschritt durch ein 40-Mikron-Sieb und zentrifugieren Sie dann 10 Minuten lang bei 300 mal G bei vier Grad Celsius. Den Überstand in ein frisches Röhrchen geben und auf Eis lagern.
Das Zellpellet vorsichtig in 500 Mikroliter kaltem PBS wieder aufkehren und auf Eis legen. Tauen Sie Enzyme auf Eis auf und richten Sie eine Enzymstandardkurve ein, wie im Textmanuskript beschrieben. Parallel zur Standardvorbereitung verdünnen Sie Sputumproben im Aktivierungspuffer.
Stellen Sie auf dem Plattenleser die Anregungswellenlänge für die NE FRET-Sonde NEmo-1 auf 354 Nanometer und die Emissionswellenlänge auf 400 Nanometer für Donor und 490 Nanometer für Akzeptor ein. Für die CG FRET-Sonde stellte sSam die Anregungswellenlänge auf 405 Nanometer und die Emission auf 485 Nanometer für Donor und 580 Nanometer für Akzeptor ein. Fügen Sie 40 Mikroliter Proben, Standards oder Rohlinge in die Vertiefungen einer schwarzen 96-Well-Halbflächenplatte hinzu und fügen Sie die Master-Mischung hinzu.
Starten Sie den Plattenleser und zeichnen Sie den Anstieg des Verhältnisses von Spender zu Akzeptor nach 60 bis 90 Sekunden für mindestens 20 Minuten auf, oder bis der Anstieg des Signals ein Plateau erreicht. Exportieren Sie die Daten und berechnen Sie das Verhältnis von Spender zu Akzeptor, indem Sie die Spender-RFU durch die Akzeptor-RFU für jeden Zeitpunkt und jede Probe dividieren. Berechnen Sie dann das Verhältnis von Spender zu Akzeptor und Die Standardabweichung.
Bestimmen Sie die Steigung innerhalb des linearen Wachstums der Änderung des Verhältnisses von Donor zu Akzeptor. Für jede Messung werden 30.000 Sputumzellen in einem Volumen von 50 Mikrolitern PBS in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen resuspendiert. Inkubieren Sie die Sputumzellen mit einem spezifischen Inhibitor als Negativkontrolle und einem geeigneten Enzym als Positivkontrolle für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Fügen Sie 50 Mikroliter PBS mit FRET-Reporter und einem Kernfleck zu jedem Röhrchen hinzu, um eine Endkonzentration von 2 Mikromolaren zu erhalten. Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 10 bis 20 Minuten. Löschen Sie die Reaktion, indem Sie 100 Mikroliter eiskaltes PBS hinzufügen und die Proben auf Eis legen.
Cytospin die Mischung auf Mikroskopie-Objektträgern. Dann an der Luft trocknen und die Zellen mit eiskaltem 10% Methanol für 10 Minuten fixieren. Nach der Fixierung an der Luft trocknen und die Probe mit einem geeigneten Montagemedium montieren.
Nehmen Sie die Bilder mit einem konfokalen Mikroskop auf. Bilden Sie mindestens 100 Zellen pro Bedingung ab, um schlüssige Statistiken zu erhalten. Resuspend 1 Million Zellen in 100 Mikroliter PBS in einem fünf Milliliter FACS Polystyrol Rundenbodenrohr und legen Sie das Rohr auf Eis.
Fügen Sie jeder Probe zwei Mikroliter FC-Block hinzu. Anschließend die Proben fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie Antikörper jede Tube hinzu und inkubieren Sie auf Eis im Dunkeln für 30 Minuten.
Waschen Sie die Zellen mit zwei Millilitern kaltem PBS und Zentrifuge bei 300 mal G und vier Grad Celsius. Schließlich, resuspend in 200 Mikroliter PBS. Teilen Sie die Suspension in zwei Röhrchen mit jeweils 100 Mikrolitern auf und fügen Sie fünf Mikroliter Zelllebensfähigkeitsfleck hinzu.
Fügen Sie dem Negativkontrollröhrchen einen geeigneten spezifischen NSP-Inhibitor hinzu und inkubieren Sie die Probe 10 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Fügen Sie PBS zur Probe hinzu und filtern Sie es durch einen 40-Mikron-Filter in ein sauberes FACS-Röhrchen. Fügen Sie den Reporter zur Negativkontrollprobe hinzu und wirbeln Sie vorsichtig vor.
Beginnen Sie mit der Erfassung von Zellen, die mit diesem spezifischen Inhibitor inkubiert wurden, und stellen Sie bei Bedarf die Gatter sowie die PMT-Spannungen des Reporters leicht ein. Um Veränderungen im Spender aufzuzeichnen, um ein Verhältnis aufgrund der membrangebundenen Proteaseaktivität zu akzeptieren, zeichnen Sie alle fünf bis 10 Minuten 1000 Neutrophile aus jeder Röhre auf. Berechnen Sie das FRET-Verhältnis, indem Sie den Donor durch die Akzeptorkanalwerte für die Proben dividieren, die an den gated viable Single Neutrophilen gemessen wurden.
Bilder von Neutrophilen, die mit 100 mikromollaren Sivilestaten vorinkubiert oder unbehandelt gelassen wurden, bevor reporterische NEmo-2-Zugabe zugesetzt wurden, werden hier gezeigt. Das Kernsignal wurde verwendet, um Neutrophile anhand ihrer Eigenschaften segmentierte Kerne zu identifizieren, und der ROI wurde manuell ausgewählt. Der Spender, um ein Verhältnis von Sputumneutrophilen zu akzeptieren, wurde gezeichnet.
Jeder Punkt stellt den Mittelwert eines ROI dar. Die Durchflusszytometrie Gating ermöglicht es, Sputumneutrophile zu unterscheiden und zu untersuchen. Die MFI-Verteilung bei Null und 10 Minuten wurde nach der Hinzufügung des Reporters beobachtet.
Die mittleren MFI-Werte für Spender und Akzeptor für 1000 Sputumneutrophile wurden berechnet. Das D/A-Verhältnis erreichte nach einem anfänglichen Anstieg ein Plateau. Die gesunde Spender-Sputum-Induktion erfordert etwas Übung vor der Perfektion.
Denken Sie daran, sich zu entspannen und das Aerosol 10 bis 15 Minuten vor dem Ausscheidungsabzug einzuatmen. Außerdem hält Sputumzellen immer auf Eis und verarbeitet sie so schnell wie möglich nach dem Auswurf. Wir fanden heraus, dass die oberflächengebundene Proteaseaktivität mit frühen Lungenschäden bei Kindern und mit der Schwere der Lungenerkrankung bei erwachsenen CF-Patienten korreliert.
Daher ermöglichen diese Methoden zusammen die Erforschung von Proteasen als frühe Entzündungsbiomarker bei neutrophilen Atemwegserkrankungen.
