Bei einer chronischen HBV-Infektion spielen CD4-T-Zellen eine wichtige Rolle sowohl bei der viralen Clearance als auch bei den Rückkehrern. Diese Methode ermöglicht es uns, HBV-spezifische CD4-T-Zellantworten zu bewerten und HBV-spezifische CD4-T-Zellepitope gleichzeitig zu identifizieren. Demonstriert wird das Verfahren von Jianmei Xiao, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter.
Und Xing Wan, ein Techniker aus Bilao. Um zu beginnen, isolieren Sie periphere mononukleäre Blutzellen oder PBMCs aus Blut, indem Sie die Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation bei 800 mal G für 20 Minuten verwenden. Dann sammeln Sie die Granulozyten zwischen der und der roten Blutkörperchenschicht mit einer Pasteurpipette.
Die aufgetaute Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr geben, einen Milliliter der vorgewärmten Benzonase RPMI 1640 hinzufügen, fallenweise, dann langsam weitere sechs Milliliter hinzufügen. Spülen Sie die Kryo-Durchstechflasche mit zwei Millilitern Benzonase RPMI 1640 aus, um die verbleibenden Zellen zu entnehmen. Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 400 mal G für 10 Minuten.
Entfernen Sie den Überstand und lösen Sie das Pellet durch Klopfen des Rohres. Suspendieren Sie das Pellet vorsichtig in einem Milliliter warmer Bensenase NACE RPMI 1640. Mischen Sie die Zellen vorsichtig und filtern Sie sie durch ein 70 Mikrometer großes Zellsieb, wenn Zellklumpen sichtbar sind.
Zählen Sie lebensfähige Zellen mit Trypanblau und einem Hämozytometer. Suspendieren Sie die PBMCs und das komplette Kulturmedium erneut, das 10 Einheiten pro Milliliter IL2 und 10 Nanogramm pro Milliliter IL7 enthält. Stellen Sie die Zelldichte auf 1,5 x 10 bis zu den 6 Zellen pro Milliliter ein.
Dann platten die Zellen in 96-Well flachen Bodenplatten mit einer Dichte von 3x10 bis zu den fünften Zellen pro Vertiefung. Fügen Sie hepatitis-B-Virus oder HBV-abgeleitete Peptidpools zu jedem Brunnen hinzu. Für die Hintergrund- und Positivkontrollbrunnen fügen Sie die gleiche Menge Lösungsmittel hinzu.
Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Ergänzen Sie das Kulturmedium am dritten Tag mit 50 Einheiten pro Milliliter IL2 und 10 Nanogramm pro Milliliter IL7. Ersetzen Sie am siebten Tag die Hälfte des Kulturmediums durch frisches Medium, das Vier Mikrogramm pro Milliliter Peptide, 100 Einheiten pro Milliliter IL2 und 20 Nanogramm pro Milliliter IL7 enthält.
Am Tag 10 pipetieren Sie die Zellen in jedem Bohrpunkt sieben bis neun Mal vorsichtig, um Zellcluster zu disaggregieren. Zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen und übertragen Sie 2x10 auf die fünften Zellen in jede Vertiefung einer runden 96-Well-Bodenplatte für die HPV-spezifische CD4-T-Zellantwortanalyse. Für die Restzellen in der flachen 96-Well-Bodenplatte stellen Sie das Volumen des Kulturmediums auf 100 Mikroliter ein, indem Sie überschüssiges Medium verwerfen.
Ergänzen Sie dann die Kultur mit 100 Mikrolitern frischem, vollständigem Kulturmedium, das Folgendes enthält:vier Mikrogramm pro Milliliter Peptide, 100 Einheiten pro Milliliter IL2 und 20 Nanogramm pro Milliliter IL7. Setzen Sie die Kultivierung der Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid zur Epitopidentifizierung am Tag 12 fort. Waschen Sie die Zellen in der runden 96-Well-Bodenplatte, indem Sie 200 Mikroliter RPMI 1640 hinzufügen, die Platte drei Minuten lang bei 550 mal G zentrifugieren und den Überstand entsorgen.
Wiederholen Sie die Wäsche zweimal mit vollständigem Kulturmedium für die letzte Wäsche. Fügen Sie für jede Zellbohrung, die mit einem spezifischen Peptidpool stimuliert wird, 200 Mikroliter vollständiges Kulturmedium hinzu, das mit demselben Peptidpool ergänzt wird. Fügen Sie für die Hintergrundsteuerungsbohrung ein vollständiges Kulturmedium hinzu, das mit einem Mikroliter pro Milliliter DMSO ergänzt wird.
Fügen Sie für den Positive Control Well ein komplettes Kulturmedium hinzu, das mit einem Mikroliter pro Milliliter DMSO, 150 Nanogramm pro Milliliter PMA und einem Mikromol pro Liter Ionomycin ergänzt wird. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für sechs Stunden. Nach einer Stunde Inkubation 1,37 Mikrogramm pro Milliliter Monensin in die Kultur geben.
Nachdem die sechsstündige Inkubation abgeschlossen ist, zentrifugieren Sie die Platte drei Minuten lang bei 550 mal G. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen einmal mit 200 Mikrolitern DPPs, wie zuvor gezeigt. Färbung für Oberflächenmarker CD3, CD4 und CD8 und einen Lebensfähigkeitsmarker.
Nachdem Sie die Zellen mit dem Vibrator aufgehängt haben, kühlen Sie die Platte dann bei vier Grad Celsius für 30 Minuten. Nachdem Sie die Platte einmal mit 200 Mikrolitern DPBS gewaschen haben, fixieren und permeabilisieren Sie die Zellen, färben Sie sie für intrazelluläre Zytokine, TNF Alpha und Interferon-gamma ein und kühlen Sie die Platte bei vier Grad Celsius für 45 Minuten. Waschen Sie die Zellen noch einmal und suspendieren Sie sie in 150 Mikrolitern Durchflusszytometriepuffer erneut.
Erfassen Sie dann die Durchflusszytometriedaten mit einem Durchflusszytometer. Pflegen Sie allergene B-lymphoblastoide Zelllinien oder BLCLs in einem T-75-Kolben. Zählen Sie am 12. Tag der PBMC-Erweiterung die Anzahl der lebensfähigen BLCLs und übertragen Sie sie auf 15 Milliliter Zentrifugenröhrchen.
Zentrifugieren Sie die Zellen bei 350 mal G für 10 Minuten und entfernen Sie den Überstand. Suspendieren Sie das Zellpellet und das komplette Kulturmedium erneut. Dann aliquotieren Sie die BLCLs zu einer runden 96-Well-Bodenplatte bei 4x10 zur vierten Zellen pro Vertiefung und 80 Mikrolitern des vollständigen Kulturmediums.
Fügen Sie 10 Mikrogramm pro Milliliter eines einzelnen Peptids hinzu und legen Sie zwei Hintergrundkontrollen fest. Peptidpulsing mit HLADR-Blockierung und DMSO-Pulsierung. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für zwei Stunden.
Fügen Sie 100 Mikrogramm pro Milliliter Mitomycin C hinzu und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für eine Stunde. Waschen Sie die Platte dreimal mit 200 Mikrolitern RPMI 1640, um ungestoßendes Peptid und Mitomycin C zu entfernen, und suspendieren Sie die Zellen dann in 120 Mikrolitern des vollständigen Kulturmediums mit einem Vibrator. Übertragen Sie am 12. Tag der PBMC-Erweiterung die PBMCs auf eine runde 96-Well-Bodenplatte.
Zentrifugieren Sie die Zellen in der Platte, entfernen Sie den Überstand und waschen Sie sie zweimal mit 200 Mikrolitern RPMI 1640, wie zuvor gezeigt. Suspendieren Sie die PBMCs in jeder Vertiefung mit 210 Mikrolitern des vollständigen Kulturmediums erneut. Für die PBMC-Wells, die für die Epitopidentifikation ausgewählt wurden, aliquotieren Sie 70 Mikroliter der Zellsuspension und mischen Sie sich mit peptidgepulsten BLCLs in drei Wells, einschließlich zwei Hintergrundkontrollen.
Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für sechs Stunden. Nach einer Stunde Inkubation 1,37 Mikrogramm pro Milliliter Monensin in die Kultur geben und das endende Volumen in jeder Vertiefung auf 200 Mikroliter mit vollständigem Kulturmedium bringen. In diesem repräsentativen Beispiel sind die TNF Alpha und Interferon-gamma sezernierenden CD4 T-Zellantworten für den Peptidpool Core11 niedriger als das Zweifache der Hintergrundwerte und werden daher als negativ angesehen.
In der Zwischenzeit sind die Antworten für den Peptidpool Core09 höher als das Zweifache des Hintergrunds und gelten als positiv. Der graue Hintergrund zeigt Wells mit einer positiven CD4-T-Zellantwort und Kandidatenpeptide für die Epitopidentifikation sind rot angezeigt, Core01 hat die höchste Ansprechrate, sowohl nach TNF Alpha- als auch nach Interferon-gamma-sezernierenden CD4T-Zellen in Säulenpeptidpools. Die Peptide C1 bis 15, C31 bis 45, C61 bis 75 und C91 bis 105 in diesem Peptidpool werden als Kandidatenpeptide festgelegt, da die Reihe der Peptidpools, die diese Peptide enthalten, ebenfalls positive Ergebnisse zeigt.
PBMCs, die mit den Peptidpools Core07, 08, 09 und 10 erweitert wurden, werden zur Epitopidentifizierung dieser Peptide verwendet. In ähnlicher Weise hat Core09 die höchste Ansprechrate in Reihenpeptidpools. Alle Peptide in diesem Pool sind als Kandidatenpeptide gesetzt und PBMCs mit Peptidpools erweitert:Core01, 02, 03, 04, 05 und 06 werden zur Epitopidentifikation dieser Peptide verwendet.
Für peptidpool Core08 expandierte PBMCs nach Stimulation mit Peptid C31 auf 45 gepulste BLCLs, die Frequenzen von TNF Alpha und Interferon-gamma sezernierenden CD4 T-Zellen sind zweimal höher als Hintergrundkontrollen. Somit ist das Peptid C31 bis 45 ein verifiziertes HLADR-beschränktes CD4-T-Zell-Epitop. Es war dort, zusätzliche erweiterte PBMCs, die nach der Epitopidentifikation übrig blieben.
Die Feinmarkierung der identifizierten Epitope kann mit einem Panel verkürzter Peptide durchgeführt werden.
