Die Autoren danken NSF (MCB-1157876) für die Finanzierung. Wir danken auch Alberto Civetta, John Roote und zwei anonymen Gutachtern für ihre Kommentare.

Kleines Experimente durchgeführt werden, um sich mit der ganzen Prozedur werden. 1. Sammeln Virgin Weibliche und Männliche Naive Die einfachste Version des skizzierten Experiment besteht aus vier Typen von anfänglichen Kreuze, die die folgende Kombination von Erwachsenen beinhalten: a) w 1.118 Personen um jungfräulichen Weibchen sammeln, b) Oregon-R Einzelpersonen, um naive Referenz Männchen sammeln; c ) P {sw} homozygoten Männchen und jungfräulichen Weibchen aus einer Steuerleitung, die die Wildtyp-Organisation Sdic trägt, um naive experimentellen Männer (Typ I) zu sammeln, und d) P {sw} homozygoten Männchen und Sdic-sw-Deletion tragenden jungfräulichen Weibchen um naive experimentellen Männchen, welche die Sdic-sw-Mangel (Typ II) führen zu sammeln. <ol><li> Richten Sie mehrere Fläschchen mit 8-10 Frauen und 5 Männer jeweils. Erlauben die Weibchen legenEier und übertragen Sie die Erwachsenen, um neue Fläschchen alle 3-5 Tage. Verwenden Flaschen anstatt Fläschchen, wenn notwendig und immer frische Lebensmittel. Die Zahl der je erforderlich ist, hängt die Anzahl der experimentellen männlichen untersuchten Arten und der Anzahl der Personen geschätzte Bedarf Unterschiede (Tabelle 1) zu erfassen, abhängen. Mehr als 10 Frauen pro Fläschchen könnte in Überbelegung während Larvenwachstum, die Variation in der Fruchtbarkeit der Nachkommen führen kann. Aufbewahrung von Röhrchen bei 25 ° C in einer temperaturgeregelten Kammer. </li><li> Starten Sammeln jungfräulichen Weibchen und Männchen naiv an den Tagen 11 und 12. Nach dem Einrichten der anfänglichen Kreuze. Die Wartezeit variiert je nach der Temperatur; niedrigeren Temperaturen führen zu längeren Entwicklungszeit Verzögerung der Ansammlung von Individuen. Ein weiterer Faktor, der das Timing zum Schlüpfen der Art des Mediums. Nahrhaftes Essen, wie Maismehl-Hefe-Medium 29, versichert die richtige Entwicklung der erwachsenenFortpflanzungsorgane, die Paarung erleichtert. Sammle ungesteckt fliegt jede 4-6 Stunden. Bei der Erhebung, betäuben fliegt durch die Einführung von CO 2 in das Fläschchen, tippen Sie auf die Fliegen ab, und Sex sie unter Stereomikroskop (Abbildung 2). Legen Sie die gewünschten fliegt in verschiedenen Fläschchen nach Geschlecht und Phänotyp und Etikett der Fläschchen entsprechend. </li></ol> Anmerkung 1. Sammlung Routine beginnt in der Früh mit dem Verwerfen der Erwachsenen, die in der vergangenen Nacht entstanden. Sammle jungfräulichen Weibchen und Männchen naiv einmal oder zweimal während des Tages. Typischerweise D. melanogaster Männchen geschlechtsreif werden 8 Stunden nach dem Schlüpfen bei 25 ° C 30. Wenn Fliegen unter 0.12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklen beibehalten werden zwei Gipfeln eclosion erwartet: während der ersten 1-2 Stunden nach der das Licht auf, und während der 2 Stunden ausgeschaltet wird, bevor das Licht ausgeschaltet wird. Eclosion erfolgt innerhalb von 24 Stunden nach der Puppe verdunkelt. Anmerkung 2. Nicht mehr als 10 Frauen should in die gleiche Flasche gesetzt werden, um Überfüllung zu vermeiden. Dies begrenzt auch den Verlust von Frauen im Falle sie verworfen werden, da mindestens eine von ihnen ist nicht virgin. Anmerkung 3. Um die entsprechende Anzahl von jungfräulichen Weibchen und Männchen naiv in kurzer Zeit zu sammeln, können folgende Maßnahmen getroffen werden. Einrichten 15-20 Fläschchen w 1118 für Experimente mit zwei Arten von experimentellen Männern (Tabelle 1). Leicht streuen die Oberfläche der Medien und ein paar getrocknete aktive Hefe Pellets Eiablage zu erleichtern. Übertragen Eltern mindestens 4 mal an aufeinander folgenden Tagen. Um die zur Verfügung stehende Fläche für Verpuppung in jedem Fläschchen zu erhöhen, legen mehrfach gefalteten Papier (7 x 5 cm) in der 4. oder 5. Tag nachdem die Eltern in ein anderes Fläschchen (Abb. 3) übertragen werden. Wenn die Anzahl der Erwachsenen entstanden aus der anfänglichen Kreuze ist nicht genug, noch ein paar Tage warten und sammeln Sie individuellALS von Röhrchen bis zu unterschiedlichen Terminen eingestellt. Planen Sie für die Durchführung der Experimente über mehrere Tage hintereinander zum Ausgleich der Arbeitsbelastung. 2. Doppel-Paarung Experimente Abbildung 4 zeigt die wichtigsten Schritte in Doppel-Paarung in 14 Experimente durchgeführt beteiligt. <ol><li> Am Morgen des 1. Tag, beim Einrichten des ersten Paarung. Die Oregon-R Männchen sind die ersten in der Offensive Assay paaren. <ol><li> Mit dem Sauger, Fläschchen, die Einrichtung von 04 bis 05 Oktober-day-old white-eyed w 1118 jungfräulichen Weibchen und 10 rot-eyed Oregon-R naiv Männchen je. Zwei bis drei Flaschen werden täglich an 5 aufeinander folgenden Tagen eingestellt. Die Zahl der je eingerichtet werden können je nach der Anzahl der verfügbaren Individuen. Lassen Sie die Fliegen für 2 Stunden paaren. </li><li> Verwerfen Oregon-R Männer und platzieren Sie jede Frau in ein neues Gefäß unter Verwendung eines Gebläses (Abbildung 5). Sex Identifikation kann durch visuelle Inspektion von wenigen erreicht werdenmorphologischen Unterschiede (Abbildung 2). Beschriften Sie jedes Fläschchen angemessen und lassen Sie die Frau in dem Fläschchen für 2 Tage (im Folgenden &quot;v1&quot;). </li></ol></li><li> Am Tag 3, Einrichten der zweiten Paarung. Auswahl von Männchen und Cross Einrichtung sollte zufällig durchgeführt werden, um mögliche Tendenz zu einem experimentellen männlichen Arten minimieren. <ol><li> Zwei Stunden, bevor das Licht ausgeschaltet ist, wieder übertragen die weiblichen in ein neues Gefäß mit einem Sauger. Beschriften Sie die neue Flasche angemessen (im Folgenden &quot;v2&quot;). </li><li> Führen Sie drei 5-6 Tage alten experimentellen Männchen des gleichen Genotyps in v2. </li><li> Wiederholen 2.2.1 und 2.2.2 für jeden weiblich. </li><li> An Tag 4 wird 2 Stunden direkt vor dem Licht auf (dh nicht mehr als 12 Stunden nach 2.2.1), verwerfen Männchen mit dem Sauger eingeschaltet. </li></ol></li><li> Am Tag 6, übertragen jedes Weibchen wieder in eine andere neue Flasche. Beschriften Sie die neuen Fläschchen angemessen (im Folgenden &quot;v3&quot;). </li><li> Am 10. Tag, entsorgen Sie die w 1118 </sup&gt; Frauen. </li><li> Untersuchen Sie die Nachkommen in v2 und v3. Die erste Inspektion ist nach 13-15 Tagen durchgeführt, nachdem das Weibchen in v2 (oder v3), am Tag 17 nach der weiblichen anfing Eiablage in v2 zB eingeführt wird. Die zweite Prüfung ist genau nach 17 Tagen durchgeführt. Dieser Zeitrahmen stellt eine sichere obere zeitliche Grenze, die keine zweite Generation in der gleichen Flasche garantiert. Zwei Kontrollen verhindern Überbelegung und erleichtert Nachkommen zählen. <ol><li> Am Tag 17, inspizieren v1 und sicherzustellen, dass es rot-eyed Nachkommen vorhanden, wenn nicht markieren das Fläschchen entsprechend. Vorhandensein von weißen Augen Nachkommen zeigt an, dass das Weibchen nicht Jungfrau zum Zeitpunkt der ersten Paarung, während keine Nachkommen zeigt, dass die Paarung mit dem Verweis oder den experimentellen Männer traten nicht auf. </li><li> Am Tag 17, führen Sie die erste Inspektion v2. Anesthetize entstanden Nachkommen in v2 mit CO 2 und sortieren sie nach Augenfarbe und Geschlecht. Nimm Nachkommen Zahlen des ersten und zeugtezweite Männchen. Abbildung 6 zeigt die erwarteten Phänotypen bei den Nachkommen von jeder Paarung Schema. In diesem speziellen Experiment 14, können nur weibliche Nachkommen eindeutig zugeordnet werden, da durch den Verweis oder die experimentellen Männchen gezeugt und deshalb nur die Informationen von den Töchtern kann verwendet werden, um P 2 zu berechnen. Wenn mit anderen Markern die Vaterschaft von männlichen Nachkommen eindeutig zugeordnet werden kann, kann Nachkommen Grafen von beiden Geschlechtern in nachgelagerten Berechnungen verwendet werden. Entsorgen Sie die Nachkommen aber halten Sie für die zweite Inspektion v2. </li><li> Am Tag 20, wie in 2.5.2 mit dem neu entstandenen Nachkommen in v2 gehen und dann das Fläschchen entsorgen. </li><li> Am Tag 20, inspizieren die entstanden Nachkommen in v3 zum ersten Mal, und folgen Sie Schritt 2.5.2. </li><li> Am Tag 23, wie in 2.5.3 mit dem neu entstandenen Nachkommen in v3 gehen. </li></ol></li></ol> Anmerkung 1: Aufgrund der möglichen Auswirkungen auf Aufblasen P Partituren, dass mehrere Paarung haben könnte (2.2.2 und 2.2.3), Paarungauf einen bestimmten Zeitrahmen beschränkt. Die Zeitspanne hängt von der Frequenz remating mit dem Genotyp des weiblichen und männlichen verwendet verbunden abhängen. Die Wahrscheinlichkeit, dass mehrere Paarung ist speziell während der Nachtzeit 11 reduziert. Anmerkung 2: Fügen Sie keine lebende Hefe Pellets, weil diese Probleme wegen möglicher Überwucherung der Hefe, wenn die Zahl der erwachsenen Fliegen niedrig ist verursachen könnten. 3. Data Analysis <ol><li> Aufgezeichnet Nachkommen zählt sollten angemessen für eine einfache Sichtprüfung und effiziente Analyse organisiert werden mit einem geeigneten statistischen Paket (zB JMP von SAS Institute) oder kostenlose Web-basierte Tools (zB <a href="http://www.vassarstats.net/" target="_blank">http://vassarstats.net/</a> ). </li><li> Sperma Wettbewerbsfähigkeit. Fügen zählt von v2 und v3. Weibliche Fliegen, die Anlass gegeben haben, keine oder sehr begrenzte Nachkommen (zB &lt;10), starb während des Verfahrens, oder waren nur erfolgreich BesamungTed von einer der beiden Männer werden als nicht informativ betrachtet und von einer eventuell nachgeschalteten statistischen Analyse (2.5.1 und Tabelle 2) ausgeschlossen. Berechnen Sie den P 2 Punkte für jeden informative weiblich. </li><li> Testen Sie, ob es statistisch signifikante Unterschiede in P 2-Werte unter den experimentellen Männern. Dies kann mit Hilfe parametrischer (zB Tukey HSD) oder nicht-parametrische (zB Stahl-Dwass) Tests in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren, einschließlich der Schiefe der Verteilung der P 2-Werte und die Abhängigkeit zwischen der Varianz und der Mittelwert werden. Die Winkelumwandlung allgemein Proportionen wie P 2 angelegt vor der Verwendung der parametrischen Tests 31. </li><li> Mating Kursdifferenzen (optional). Für jeden experimentellen männlichen Typ, der überlege die Zahl der doppelt gedeckt Frauen und solche, die nur mit dem ersten Mann (der Verweis männlich in der Offensive Assay und die experimentelle Männchen in der d gepaartefense Assay). Verwendung eines zweiseitigen Fisher-Test (erhältlich unter <a href="http://www.langsrud.com/fisher.htm" target="_blank">http://www.langsrud.com/fisher.htm</a> ), ob statistisch signifikante Unterschiede zwischen den beiden Typen von experimentellen Männer. </li><li> Geschlechterverhältnis (optional). Für jeden experimentellen männlich, verwenden Sie den Chi-Quadrat-Test, ob das Verhältnis der Geschlechter in den Nachkommen von jedem weiblichen weicht von dem erwarteten 1:1-Verhältnis zu bestimmen. </li></ol>

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir haben die experimentellen Design beschrieben, um Unterschiede in den relativen Beitrag von genetisch unterschiedlichen beurteilen D. melanogaster Männchen auf die Nachkommenschaft in kontrollierten Doppelblind-Paarung Experimente 7,8. Dies wurde im Zusammenhang mit einer genetischen Faktor Hypothese Spermien Wettbewerbsfähigkeit beeinflussen, und es hat in der Tat Assay veranschaulicht, obwohl ein ähnlicher Vorgang gilt für die Verteidigung Assay (Fig. 1) geschehen. Diese Ver...

Seit Geoff Parker nahm die Prävalenz von Spermien Wettbewerb in Insekten und ihre evolutionären Implikationen 2, haben eine Welle von Studien in Drosophila und andere Arten versucht, etwas Licht auf dieses Phänomen Schuppen auf vielen verschiedenen Ebenen. Einige Beispiele für Bereiche von Interesse waren die Umfrage ihrer Variation in natürlichen Populationen 9,10, seine genetische Architektur und Relevanz der zugrunde liegenden genetischen Faktoren 11-14, und seine Rolle bei der Koevolution zwischen den Geschlechtern 15,16. In D. melanogaster Weibchen, die begrenzte Kapazität der spezialisierten Spermien-storage Organe, ein Paar Spermatheka und dem bahnbrechenden Aufnahme 6,17, trägt dazu bei, den Wettbewerb der Spermien von verschiedenen Männchen. Etwa 1.500 Spermien bei der Paarung mit dem weiblichen, aber nur ~ 500 übertragen werden können in den genannten Organen 18,19 untergebracht werden. Im Labor kontrollierte Doppelblind-Paarung Erfahrungengen mit einen Verweis Männchen und ein oder mehrere Männchen von Interesse wurden ausgiebig zur Auswertung Spermien Wettbewerbsfähigkeit 7,8 verwendet. Sperma Wettbewerbsfähigkeit ist als der Anteil der Nachkommen durch die experimentelle männlich in Doppel-Paarung Experimente über den gesamten Nachkommen gezeugt geschätzt, dh, dass sowohl von der experimentellen und Referenz Männer. Sperma Wettbewerbsfähigkeit besteht aus zwei Komponenten, von denen jede in einem separaten Test ausgewertet. In der Straftat-Assay wird die Fähigkeit der experimentellen männlichen Spermien, die Spermien aus dem ersten männlichen verdrängen, dh der Bezug männlich, ausgewertet wird. Umgekehrt bei der Verteidigung Assay wird die Fähigkeit des experimentellen männliche Samenzellen Verschiebung widerstehen oder um die Befruchtung Erfolg des Referenz männlichen Spermien reduziert wird ausgewertet. Je nach der Art des Assays, Angriff oder Verteidigung, ist Sperma Wettbewerbsfähigkeit durch die Partituren P 1 oder P 2, jeweils geschätzt. P1 und P 2 können nur Werte zwischen 0 und 1 liegt. Zwischenwerte werden in der Regel als indirekter Nachweis von Spermien Mischen, also unter physiologischen Bedingungen im Zusammenhang mit Direktinvestitionen Spermien Wettbewerb schlägt interpretiert. Nach dem gleichen Grundprinzip, können extreme Werte als Beweis für eine starke Differenz Spermien Wettbewerbsfähigkeit interpretiert werden. Frühe Studien zeigten, dass P 2 in D. melanogaster ist über 0,8 zunimmt, wenn die Zeit zwischen den beiden Paarungen verlängert 7 verstrichen ist. Dieselbe Versuchsanordnung in anderen Spezies Drosophila benutzt worden ist, wobei P 2 der gebräuchliche Kennziffer in Studien Spermien Wettbewerbsfähigkeit 20 auszuwerten. Für die meisten Arten ist die P-2-Werte der getesteten Stämme höher als 0,6 21. Dennoch können einige andere Mechanismen nicht mit der direkten Konkurrenz zwischen Spermien verschiedener Männchen zu identischen Noten (siehe Diskussion). Distinguishing Nachkommen von den ersten oder zweiten Männchen gewünscht ist durch den Einsatz von leicht identifizierbaren Marker möglich. In frühen Studien, einer der Männer bei subletalen Dosen bestrahlt wurde, z. B. X-Strahlen, so dass praktisch alle Eizellen von bestrahlten Spermien befruchtet versäumt, 7 schlüpfen. Anschließend wurden Mutationen verändern Augenpigmentierung oder Flügelform war die am häufigsten verwendeten Marker. Beispiele für erstere sind die Mutationen bw (braun) 9, cn (Zinnober) und 22 W (weiß) 23, während die Mutation Cy (Curly) 24 entspricht der zweiten Art von Phänotypen, einige dieser Mutationen in die kombiniert wurden demselben Individuum, z. B. cn bw. In geringerem Umfang wurden Allozyme 25 und 26,27 Mikrosatelliten mit bekannten Vererbungsmuster auch verwendet worden. Die Versuchsanordnung, um Unterschiede in testenSpermien Wettbewerbsfähigkeit hier beschriebenen folgt im Wesentlichen der von Clark et al. 9. Ergebnisse aus diesen Versuchen abgeleitet geben Informationen nur über die Differential Vaterschaft der experimentellen männlichen Typen unter die Lupe genommen. Assays, die auch für die Zulage nach der Befruchtung Unterschiede in Fitness-und Samenzellen 14,28 Visualisierungstechniken 24 ermöglichen Unterschiede in P 1 (oder P 2) erzielt als Unterschiede in Spermien Kompetenz interpretiert werden. Abbildung 1 skizziert das Grundprinzip sowohl der Straftat und die Verteidigung Assays. Um die Logistik des Prozesses zu veranschaulichen, eine Straftat durchgeführt Experiment in D. melanogaster 14 im Detail erläutert werden. Diese besondere Straftat Assay wurde verwendet, um für einen messbaren Effekt der Multigenfamilie Sperma-spezifische dynein Zwischenkette (Sdic) auf Spermien Wettbewerbsfähigkeit zu testen. All das Mitglieds dieser Genfamilie im Tandem auf dem X-Chromosom liegen. Knockout Männer wurden durch das Löschen der Sdic Cluster generiert. Weil das gelöschte Segment gehörte auch die essentiellen Gens kurze Flügel (sw) und der Zweck der Studie war es, die Bedeutung der Sdic bewerten, wurden die Männchen tragen Sdic-sw Löschung durch eine transgene Kopie sw gerettet (symbolisiert als P {sw} , die auch trug einen weißen Mini-Reporter-Gen) auf dem Chromosom 2. Augenfarbe wurde als sichtbare Markierung für Vaterschaft Identifizierung verwendet. All die Fliegen waren in einem weißen Hintergrund mit mutierten Ausnahme derjenigen, die aus dem Stamm Oregon-R, die als Referenz verwendet wurden Männchen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Amber latex tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62996-473</td>
			<td>1/4 inch ID, 1/6 inch Wall</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1 ml graduated XL filter tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1126-7810</td>
			<td>Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-7793</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mesh Fabric</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Thin and smooth</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S6D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CO2 Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD-50</td>
			<td>Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FlyStuff Foot Valve, complete system</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-121C</td>
			<td>Not necessary if FlyNap is used</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plastic vials</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-109</td>
			<td>Come with carboard trays that can be reused for holding vials</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cotton balls</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-212</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Active dry yeast</td>
			<td>Red Star</td>
			<td></td>
			<td>Found in general grocery store</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sharpie markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Different colors may be used for marking different genotypes</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

assessing differences in sperm competitive ability in drosophila

Der Wettbewerb unter den Artgenossen Männchen zur Befruchtung der Eizellen ist einer der Mechanismen der sexuellen Selektion, dh Auswahl, die auf die Maximierung der Anzahl der erfolgreichen Paarung Veranstaltungen statt auf Maximierung Überleben und die Lebensfähigkeit 1 arbeitet. Sperma Wettbewerb stellt die Konkurrenz zwischen Männern nach Kopulation mit derselben 2, in denen ihre Spermien sind zufällig in Zeit und Raum. Dieses Phänomen ist in verschiedenen Arten von Pflanzen und Tieren 3 gemeldet. Zum Beispiel, in freier Wildbahn gefangenen D. melanogaster Weibchen Spermien enthalten in der Regel 2-3 Männchen 4. Die Spermien werden in speziellen Organen mit begrenzter Speicherkapazität, die auf die direkte Konkurrenz der Spermien von verschiedenen Männchen 2,5 führen könnten gespeichert. Vergleicht Spermien Wettbewerbsfähigkeit der verschiedenen Männchen von Interesse (experimentelle männlichen Typen) hat durch kontrollierte Doppel-Paarung experimentell durchgeführt wordents im Labor 6,7. Kurz gesagt, wird ein einziges Weibchen zu zwei verschiedenen Männern nacheinander, einer experimentellen Männchen und ein Cross-Referenz Paarung männlich ausgesetzt. Die gleiche Paarung Schema wird dann unter Verwendung von anderen experimentellen männlichen Typen und erleichtert so die indirekten Vergleich der Wettbewerbsfähigkeit ihrer Spermien durch eine gemeinsame Referenz. Der Anteil der Personen, die von der experimentellen und Referenz Männchen gezeugt wird identifiziert mit Markern, die man Sperma Wettbewerbsfähigkeit durch eine einfache mathematische Ausdrücke 7,8 abschätzen können. Darüber hinaus können Spermien Wettbewerbsfähigkeit in zwei verschiedene Szenarien je nachdem, ob die experimentelle Männchen zweite oder erste Partner (Angriff und Verteidigung Assay bezeichnet) 9, von der angenommen wird reflektierenden unterschiedlicher Kompetenz Eigenschaften geschätzt wird. Hier beschreiben wir einen Ansatz, um die Rolle der verschiedenen genetischen Faktoren, die mutmaßlich zugrunde t verhören hilfter Phänomen der Spermien Wettbewerbsfähigkeit in D. melanogaster.

Tabelle 2 fasst einige hervorstechende Merkmale von zwei Experimenten Straftat (Assays 1 und 2), in dem D. melanogaster experimentellen Männern mit und ohne (Typ I und II, jeweils) einer funktionellen Sdic Cluster 14 verglichen. Nach Berücksichtigung verschiedener Vorfälle mit einigen Wiederholungen angetroffen wurden 58-83% der Frauen gefunden informativ sein und damit die Vaterschaft zählt ihrer Nachkommen könnten für die Berechnung P 2 verwendet werden. D...

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Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

Geringe Spermien Wettbewerbsfähigkeit unter<em&gt; Drosophila</em&gt; Männer mit unterschiedlichen Genotypen können durch Doppelklick Paarung Experimenten ermittelt. Jedes dieser Experimente beinhaltet eines der Männchen von Interesse und einem Verweis männlich. Leicht erkennbare Markierungen in der Nachkommenschaft erlauben Rückschluss auf den Anteil der Personen, die von jeder männliche gezeugt.

Beurteilung Differenzen in Sperm Wettbewerbsfähigkeit in<em&gt; Drosophila</em

Competition among conspecific males for fertilizing the ova is one of the mechanisms of sexual selection, i.e. selection that operates on maximizing the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

14.5K Aufrufe.  University of California, Irvine. Geringe Spermien Wettbewerbsfähigkeit unter Drosophila Männer mit unterschiedlichen Genotypen können durch Doppelklick Paarung Experimenten ermittelt. Jedes dieser Experimente beinhaltet eines der Männchen von Interesse und einem Verweis männlich. Leicht erkennbare Markierungen in der Nachkommenschaft erlauben Rückschluss auf den Anteil der Personen, die von jeder männliche gezeugt.

Serie: Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluoreszenz In situ Hybridisierung (FISH)-Protokoll in menschlichen Spermien

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Forschung

Biologie

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Vorbereitung der Embryonen für Elektronenmikroskopie der Drosophila Embryonale Herz Rohr

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

Techniques for Imaging Ca 2 + Signaling in menschlichen Spermien

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

Isolation und In-vitro- Aktivierung von Caenorhabditis elegans Sperma

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Imaging Zellgröße Veränderung der Lebens- Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Live-Imaging von apoptotischen Ausverkauf während<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

Visualisierung und Verfolgung endogenes mRNAs in Live Drosophila melanogaster Eierkammern

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm cell to penetrate the zona pellucida and fertilize the egg. It is therefore of great interest to test compounds (e.g., environmental chemicals or drug candidates) for their effect on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm either to examine the potential adverse effects on human sperm cell function or to investigate a possible role as a contraceptive. Here, two medium-throughput assays are described: 1) a fluorescence-based assay for assessment of effects on Ca2+-signaling in human sperm, and 2) an image cytometric assay for assessment of acrosome reaction in human sperm. These assays can be used to screen a large number of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm. Furthermore, the assays can be used to generate highly specific dose-response curves of individual compounds, determine potential additivity/synergism for two or more compounds, and to study the pharmacological mode of action through competitive inhibition experiments with CatSper inhibitors.

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Here, two medium-throughput assays for assessment of effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm are described. These assays can be used to quickly and easily screen large amounts of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm.

Medium-Throughput Screening Tests zur Beurteilung der Auswirkungen auf Ca2 +-Signalisierung und Akrosom Reaktion in menschliches Sperma

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to recognize a wide range of particles and destroy microbial pathogens. As organisms age, this process begins to decline, yet little is known about the underlying mechanisms or the genetic basis of immunosenescence. Here, an injection based in vivo phagocytosis assay is used to assess age related changes in different aspects of phagocytosis, such as binding, engulfment, and degradation of internalized particles, by quantifying phagocytic events in hemocytes in adult Drosophila. Drosophila melanogaster has become an ideal model to investigate age related changes in innate immune function for many reasons. For one, many genetic components and functions of the innate immune response, including phagocytosis, are evolutionarily conserved between Drosophila and mammals. Because of that, results obtained from using this protocol are likely to be widely relevant to understanding the age related changes in immune function in a variety of organisms. Additionally, we note that this method provides quantitative estimates of hemocyte phagocytic ability, which could be useful for a variety of research topics, and need not be limited to studies of aging.

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo assay of phagocytosis used to assess and quantify the ability of young and aged Drosophila melanogaster hemocytes to phagocytose bacteria.

Beurteilung der altersspezifischen phagozytischen Fähigkeit von adulten Drosophila melanogaster Hämozyten mit einem In Vivo Phagozytose-Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent adult integument. Their immobility and transparency make them ideal for in vivo live imaging experiments. Many studies have focused on the dorsal epithelial monolayer of the pupal&#160;notum because of its accessibility and relatively large size. In addition to the studies of epithelial mechanics and development, the notum has been an ideal tissue to study wound healing. After an injury, the entire epithelial repair process can be captured by live imaging over 6-12 h. Despite the popularity of the notum for live imaging, very few published studies have utilized fixed notum samples. Fixation and staining are common approaches for nearly all other Drosophila tissues, taking advantage of the large repertoire of simple cellular stains and antibodies. However, the pupal notum is fragile and prone to curling and distortion after removal from the body, making it challenging to complement live imaging. This protocol offers a straightforward method for fixing and staining the pupal notum, both intact and after laser-wounding. With this technique, the ventral side of the pupa is glued down to a coverslip to immobilize the pupa, and the notum is carefully removed, fixed, and stained. The notum epithelium is mounted on a slide or between two coverslips to facilitate imaging from the tissue&#39;s dorsal or ventral side.

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The present protocol details the preparation and visualization of fixed tissue of the Drosophila pupal notum. It can be used for either intact or wounded tissue, and the original architecture of the tissue is preserved. The procedures for dissecting, fixing, and staining are all described in this article.

Sezieren, Fixieren und Visualisieren der Drosophila pupal notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...