Viele gentherapeutische und neurowissenschaftliche Studien beinhalten die Injektion von AAV-Vektoren in das Gehirn nichtmenschlicher Primaten. Damit diese Studien erfolgreich sind, muss die Injektionstechnik zuverlässig sein. Unsere Injektionstechnik ist sofort und genau.
Dieses Verfahren eignet sich gut für die Injektion bei anästhesierten oder wachen Tieren. Unsere hausgemachte Kanüle ist einfach zu handhaben und kostengünstig. Kevin Mai, ein technischer Techniker aus meinem Labor, demonstriert das Verfahren.
Um zu beginnen, stumpfen Sie eine 30-Gauge 13-Millimeter-Injektionsnadelspitze mit einer Scheibenschleifmaschine. Schneiden Sie dann ein Stück Edelstahlrohr auf eine Länge, die von der Tiefe des Zielhirnbereichs abhängt. Mit einer Scheibenschleifmaschine ein Ende des geschnittenen Rohrs abschrägen und das andere glatt streichen.
Entgraten Sie das Innere des Rohres mit einer Räumung. Als nächstes schneiden Sie ein Stück PTFE-Rohr auf eine Länge, die für das zu ladende Volumen der Vektorlösung geeignet ist. Flackern Sie beide Enden des Röhrchens auf, indem Sie die abgestumpfte Injektionsnadel einführen.
Führen Sie die abgestumpfte Injektionsnadel etwa fünf Millimeter in ein Ende des PTFE-Röhrchens ein. Stecken Sie dann das abgeschrägte Ende des Edelstahlrohrs etwa fünf Millimeter in das andere Ende. Testen Sie die Kanüle, indem Sie gefiltertes Wasser durch die Injektionsnadelnabe injizieren.
Vergewissern Sie sich, dass Wasser die abgeschrägte Edelstahlrohrspitze sanft verlässt und dass kein Wasser aus beiden Verbindungen austritt. Nachdem Sie die Kanüle getestet haben, legen Sie sie in einen Autoklavenbeutel und sterilisieren Sie sie durch Autoklavieren. Übertragen Sie die Vektorlösung vorsichtig in ein sterilisiertes PCR-Röhrchen mit einem P-20-Piptter, um die Bildung von Blasen zu vermeiden.
Als nächstes befestigen Sie die Kanüle mit der abgeschrägten Spitze nach unten an einem vertikal ausgerichteten stereotaktischen Halter. Verbinden Sie dann eine Ein-Milliliter-Luer-Lock-Spritze mit der Injektionsnadelnadel der Kanüle. Tauchen Sie die abgeschrägte Spitze in die Vektorlösung ein.
Wenden Sie dann mit der Ein-Milliliter-Spritze sanften Unterdruck an, um die Lösung in die Kanüle zu laden, während Sie den Meniskus zwischen der Lösung und der Luft visuell verfolgen. Sobald die Vektorlösung geladen wurde, setzen Sie den leichten Unterdruck fort, bis die Lösung die Nadelnabe erreicht. Entfernen Sie dann die Ein-Milliliter-Spritze und injizieren Sie langsam farbiges Mineralöl entlang der Innenwand der Injektionsnadelnabe, wobei Sie darauf achten, Luftblasen zu vermeiden.
Befestigen Sie die Injektionsnadelnabe an einem der beiden offenen Anschlüsse eines Drei-Wege-Luer-Lock-Absperrhahns. Schließen Sie dann den Port. Füllen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit Luft und befestigen Sie sie an einem der beiden anderen Anschlüsse.
Schließen Sie schließlich die verbleibende Spitze des Absperrhahns, um die Spritze mit der Kanüle zu verbinden. Das Anbringen der Spritze drückt Luft in den Absperrhahn und schiebt diese Luft in den freien Port, um zu verhindern, dass die Vektorlösung wieder in die Kanüle gedrückt wird. Drücken Sie langsam die Luft aus der Spritze in die Kanüle.
Sobald das farbige Öl an der Spitze der stumpfen Nadel im PTFE-Schlauch erscheint, prüfen Sie, ob Luft zwischen der Lösung und dem farbigen Öl vorhanden ist. Üben Sie weiterhin Überdruck aus, bis ein Tropfen Vektorlösung an der abgeschrägten Kanülenspitze sichtbar ist. Schließen Sie dann den Absperrhahn, um zu verhindern, dass der Vektor die Kanüle durch die Schwerkraft verlässt.
Sobald die Vektorlösung geladen wurde, befestigen Sie die Kanüle am stereotaktischen Manipulator. Um den Absperrhahn an die elektrische Luftpumpe anzuschließen, nehmen Sie den Pumpenschlauch vom nicht sterilen Assistenten. Fassen Sie den Luer-Lock-Anschluss durch die Wand einer sterilen Hülse.
Lassen Sie den Kragen des Ärmels fallen, damit er sich durch die Schwerkraft entlang des Rohres erstrecken kann. Befestigen Sie dann den Absperrhahn und kleben Sie die Hülse fest um den Luer-Lock-Anschluss. Als nächstes testen Sie die Luftpumpe und die Kanüle, indem Sie die Luftpumpe auf niedrigen Druck einstellen, bevor Sie sie einschalten und den Druck erhöhen, bis das Öl durch die Kanüle vordringt und ein Tropfen Vektorlösung an der Kanülenspitze sichtbar ist.
Kleben Sie ein Kunststofflineal an den PTFE-Schlauch, um die Bewegung des Meniskus während der Injektion zu messen. Fahren Sie dann die Kanüle mit dem stereotaktischen Manipulator nach unten, bis die Spitze die Oberfläche erreicht und die Tiefe aufzeichnet. Fahren Sie die Kanüle zur tiefsten Stelle, um entlang der Spur injiziert zu werden.
Die Oberfläche wird bei Kontakt grübchen. Um Fehlziele aufgrund von Gewebekompression zu minimieren, fahren Sie die Kanüle nach unten und überschießen Sie die tiefste Injektionsstelle um 500 Mikrometer. Dann ziehen Sie sich langsam zurück.
Andere Alternativen sind, die Kanüle langsam nach unten zu fahren oder sie schnell zu fahren und unten ein bis fünf Minuten zu warten. Sobald die Kanüle an der tiefsten Injektionsstelle positioniert ist, injizieren Sie mit der elektrischen Luftpumpe 0,5 Mikroliter der Vektorlösung über 10 bis 30 Sekunden. Bestätigen Sie den Injektionsfluss, indem Sie den Meniskus zwischen dem farbigen Öl und der Vektorlösung im PTFE-Röhrchen verfolgen.
Nachdem Sie eine Minute gewartet haben, ziehen Sie die Kanüle zur nächsten Injektionsstelle entlang der Strecke zurück. Lassen Sie die Kanüle nach der letzten Injektion 10 Minuten an Ort und Stelle, um einen Vektorausfluss zu vermeiden. Dann ziehen Sie die Kanüle zurück und entsorgen Sie sie in einem Behälter für scharfe Biogefahren.
Die Injektion von AAV-Vektoren, die das Kanal-Rhodopsin-II-Transgen im linken Colliculus tragen, gefolgt von einer Stimulation mit kontinuierlichem blauem Licht bei 40 Milliwatt, erzeugte eine Reihe aufeinanderfolgender Aktionspotentiale. Ein-Millisekunden-Lichtimpulse evozierten keine Aktionspotentiale bei 40 Milliwatt, sondern zuverlässig bei 160 Milliwatt. Die optische Stimulation des Colliculus superior, ausgelöst durch visuell geführte Sakkaden, reduzierte den Sakkadengewinn allmählich.
Die Langsamkeit dieser Veränderung stimmt mit der optogenetisch induzierten Plastizität überein. Die Abgabe von gelbem Laserlicht an den okulomotorischen Vermis nach AAV-Injektionen in den Nucleus reticularis tegmentae pontis unterdrückte die moosige Faseraktivität, die ein Eingang zum Kleinhirn ist. Diese Unterdrückung reduzierte die Purkinje-Zellaktivität, die ein Ausgang des Kleinhirns ist.
Während der optogenetischen Unterdrückung nahm die Feuerrate ab und änderte sich zu einem geplatzten Porenmuster, was darauf hindeutet, dass der gehemmte moosige Fasereintrag in Purkinje-Zellen die Akkadenverzögerungsphase beeinflusst, indem er den zweiten Ausbruch antreibt. Kanalrhodopsin wurde ausschließlich in Purkinje-Zellen des okulomotorischen Vermis exprimiert. Die Abgabe kurzer Lichtpulse erhöhte die einfache Spike-Aktivität einer isolierten Purkinje-Zelle.
Ein einzelner 1,5-Millisekunden-Lichtimpuls rief häufig mehr als eine einfache Spitze hervor. Die optogenetische einfache Spike-Aktivierung während der Sakkade erhöhte die Sakkadenamplitude, was die dishemmende Rolle der Purkinje-Zellen am okulomotorischen Burst-Generator bestätigt. Luftblasen in der Kanüle können den Ölvektormeniskus stören, die Bestimmung von Injektionsvolumina erschweren und eine Feinsteuerung der Durchflussrate verhindern.
Aus diesen Gründen ist das Laden der Vektorlösungen ohne Luftblasen für dieses Verfahren von entscheidender Bedeutung. Sechs bis acht Wochen nach der Injektion können optogenetische Manipulationen durchgeführt und das Hirngewebe für die histologische Analyse aufbereitet werden. Diese Technik ermöglicht es den Forschern, viele Vektoren an wenigen Tieren zu testen, was wiederum die Entwicklung und Validierung neuer Vektoren erleichtert.
Ein besonderes Gebiet von aktuellem Interesse ist die Entwicklung von Vektoren, die auf bestimmte neuronale Typen abzielen.
